一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括如下步驟：1)乳豬肝預(yù)處理；2)均質(zhì)；3)胃蛋白酶的制備；4)酶解：乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加鹽酸溶液至pH值為2.5-3.5，再加入胃蛋白酶攪拌后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于水浴鍋中水解得到酶解物料；5)滅活；6)離心；7)粗濾：將中性離心液先后經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置和截留分子量為10KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行過(guò)濾得到粗濾液；8)超濾：粗濾液經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單溫和，而且節(jié)能環(huán)保，提取率高；所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性較高，安全性高。
【專利說(shuō)明】一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是從新鮮乳豬肝臟中提取的小分子量多肽類混合物，分子量在10000以下。其藥理作用主要為可刺激正常肝細(xì)胞DNA的合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，對(duì)損傷的肝細(xì)胞有保護(hù)作用，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)，還有調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和抗肝纖維化作用。臨床上用于治療重型肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎和肝硬化等。目前，針對(duì)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素這一生物制劑類藥物，已經(jīng)有很多專利和文獻(xiàn)報(bào)道。
[0003]在專利ZL03116052.2中，公開(kāi)了一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液及制備方法，其中的肝細(xì)胞生長(zhǎng)素為從乳豬中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，占總蛋白含量的60%以上，該促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是通過(guò)以下方法制備:1)勻漿；2)攪拌:加提取液，室溫下低速60rpm攪拌Ih ；3)加熱:水浴加熱提取罐，液體溫度達(dá)到95°C時(shí)停止加熱，保持15-20分鐘；4)過(guò)濾；5)提純:將過(guò)濾液上樣至DEAE Sepharose FF柱中，采用含有氯化鈉的PBS溶液進(jìn)行洗脫，再用超濾膜除鹽。該制備方法的工藝繁瑣，還需要加鹽的洗脫液洗脫后再脫鹽，這些操作步驟都會(huì)損失活性物質(zhì)的含量，造成提取物活性低，提取率低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基本【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，采用酶解和超濾工藝，工藝簡(jiǎn)單溫和，而且節(jié)能環(huán)保，提取率高；所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性較高，并且分子量小于6000D，安全性高，對(duì)人的過(guò)敏反應(yīng)基本消除。
[0005]本發(fā)明提出的一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括如下步驟:
[0006]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0007]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3100-3250rpm的轉(zhuǎn)速研磨2-3.5min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為5-6:4.5-5.5加入攪拌機(jī)中，以310-325rpm的轉(zhuǎn)速攪拌14_17min得到乳豬肝勻漿；
[0008]S3、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，力口入1.2-1.5wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為22-25:27-30，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于47-50°C的水浴鍋中浸提63-66min得到浸提液，將浸提液以5800-6200rpm的轉(zhuǎn)速離心22_23min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0009]S4、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加4-6mol/L鹽酸溶液至pH值為2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的轉(zhuǎn)速攪拌19_22min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于37-45°C的水浴鍋中水解6-8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99-101:0.7-1 ；
[0010]S5、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81-82°c，保溫12_15min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0011]S6、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4000-4300rpm的轉(zhuǎn)速離心
14-17min后，將上清液取出滴加4-6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.8-7.2得到中性離心液；
[0012]S7、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.04-0.07MPa ；
[0013]S8、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.13-0.16MPa，回流壓力為0.04-0.07MPa。
[0014]優(yōu)選地，S3中，取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.3-1.4wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23-24:28-29，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于48-49 V的水浴鍋中浸提64-65min得到浸提液，將浸提液以5900-610rpm的轉(zhuǎn)速離心22.3-22.6min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶。
[0015]優(yōu)選地，S4中，將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加4.5-5.5mol/L鹽酸溶液至PH值為2.7-3.2，再加入S3得到的胃蛋白酶以195-200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌20_2Imin后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于40-42°C的水浴鍋中水解6.7-7.8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99.4-100.2:0.8-0.9。
[0016]優(yōu)選地，S6中，將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4100-4200rpm的轉(zhuǎn)速離心
15-16min后，將上清液取出滴加4.7-5.6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.9-7.1得到中性離心液。
[0017]優(yōu)選地，包括如下步驟:
[0018]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0019]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3200rpm的轉(zhuǎn)速研磨3min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為1:1加入攪拌機(jī)中，以315rpm的轉(zhuǎn)速攪拌15.5min得到乳豬肝勻漿；
[0020]S3、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.3wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23:28，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于490°C的水浴鍋中浸提65min得到浸提液，將浸提液以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心22.5min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0021]S4、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加5mol/L鹽酸溶液至pH值為3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌20min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于40°C的水浴鍋中水解7h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為100:0.9 ；
[0022]S5、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81.8°C，保溫14min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0023]S6、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4200rpm的轉(zhuǎn)速離心15min后，將上清液取出滴加5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為7得到中性離心液；
[0024]S7、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.06MPa ；
[0025]S8、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.14MPa，回流壓力為0.05MPa。
[0026]上文中KD為千道爾頓，D為道爾頓。
[0027]本發(fā)明將乳豬肝研磨成乳豬肝糜，促使部分肝細(xì)胞的細(xì)胞膜破碎，再通過(guò)加水?dāng)嚢?，使肝?xì)胞中的蛋白質(zhì)溶出；將豬胃粘膜研磨后，加入1.2-1.5wt%鹽酸溶液消化豬胃粘膜細(xì)胞，再通過(guò)47_50°C時(shí)的浸提、離心封層和低溫干燥得到高活性的胃蛋白酶，而且胃蛋白酶產(chǎn)率高；對(duì)乳豬肝勻漿滴加鹽酸溶液不僅可以促使更多肝細(xì)胞破碎，加速蛋白質(zhì)溶出，而且可以為下一步胃蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)水解營(yíng)造適宜的反應(yīng)環(huán)境，接著加入胃蛋白酶并攪拌，促使胃蛋白酶在酸性條件下與乳豬肝勻漿充分接觸，在37_45°C的水浴鍋中水解6_8h，充分水解大分子蛋白質(zhì)，使之降解為小分子多肽鏈和小分子蛋白質(zhì)；而將酶解物料水浴加熱至81-82°C，保溫12-15min，使胃蛋白酶和剩余的大分子蛋白質(zhì)變性，有效的殺死可能存在的病毒和細(xì)菌，同時(shí)保證小分子多肽鏈和小分子蛋白質(zhì)的活性；將滅活勻漿離心得到上清液使大分子蛋白質(zhì)沉淀，而小分子多肽鏈和小分子蛋白質(zhì)仍溶于溶液中；接著將中性離心液分別通過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置和截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置，形成分級(jí)過(guò)濾，提高中性離心液的過(guò)濾效率，并得到分子量小于1KD的多肽和蛋白質(zhì)，同時(shí)控制回流壓力為0.04-0.07MPa，既提高了過(guò)濾效率，又能避免某些大分子在高壓下通過(guò)中空纖維超濾裝置；再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾，同時(shí)進(jìn)液壓力為0.13-0.16MPa和回流壓力為0.04-0.07MPa，使本發(fā)明所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素中的分子小于6000D，大大提高了有效組分含量濃度，而且安全性高。
[0028]本發(fā)明采用酶解和超濾工藝，工藝簡(jiǎn)單溫和，而且節(jié)能環(huán)保，提取率高；所制備的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的活性較高，并且分子量小于6000D，安全性高，對(duì)人的過(guò)敏反應(yīng)基本消除。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0030]實(shí)施例1
[0031]本發(fā)明提出的一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括如下步驟:
[0032]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0033]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3100rpm的轉(zhuǎn)速研磨3.5min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為5:5.5加入攪拌機(jī)中，以310rpm的轉(zhuǎn)速攪拌17min得到乳豬肝勻漿；
[0034]S3、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.2wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為25:27，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于50°C的水浴鍋中浸提63min得到浸提液，將浸提液以6200rpm的轉(zhuǎn)速離心22min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0035]S4、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加6mol/L鹽酸溶液至pH值為2.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以205rpm的轉(zhuǎn)速攪拌19min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于45°C的水浴鍋中水解6h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為101:0.7 ；
[0036]S5、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81°C，保溫15min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0037]S6、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心17min后，將上清液取出滴加4mol/L氫氧化鈉溶液至pH為7.2得到中性離心液；
[0038]S7、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.07MPa ；
[0039]S8、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.13MPa，回流壓力為0.07MPa。
[0040]實(shí)施例2
[0041]本發(fā)明提出的一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括如下步驟:
[0042]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0043]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3250rpm的轉(zhuǎn)速研磨2min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為6:4.5加入攪拌機(jī)中，以325rpm的轉(zhuǎn)速攪拌14min得到乳豬肝勻漿；
[0044]S3、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.5wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為22:30，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于47°C的水浴鍋中浸提66min得到浸提液，將浸提液以5800rpm的轉(zhuǎn)速離心23min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0045]S4、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加4mol/L鹽酸溶液至pH值為3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190rpm的轉(zhuǎn)速攪拌22min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于37°C的水浴鍋中水解8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為99:1 ；
[0046]S5、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至82V，保溫12min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0047]S6、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4300rpm的轉(zhuǎn)速離心14min后，將上清液取出滴加6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.8得到中性離心液；
[0048]S7、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.04MPa ；
[0049]S8、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.16MPa，回流壓力為0.04MPa。
[0050]實(shí)施例3
[0051]本發(fā)明提出的一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括如下步驟:
[0052]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0053]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3150rpm的轉(zhuǎn)速研磨2.5min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為1.1:1加入攪拌機(jī)中，以320rpm的轉(zhuǎn)速攪拌16min得到乳豬肝勻漿；
[0054]S3、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.4wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為24:29，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于48°C的水浴鍋中浸提64min得到浸提液，將浸提液以5900rpm的轉(zhuǎn)速離心22.7min,取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0055]S4、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加5.5mol/L鹽酸溶液至pH值為2.8，再加入S3得到的胃蛋白酶以195rpm的轉(zhuǎn)速攪拌2Imin后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于43°C的水浴鍋中水解7.2h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為100:0.8 ；
[0056]S5、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81.5°C，保溫13min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0057]S6、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4100rpm的轉(zhuǎn)速離心16min后，將上清液取出滴加5.5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.9得到中性離心液；
[0058]S7、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.05MPa ；
[0059]S8、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.15MPa，回流壓力為0.06MPa。
[0060]實(shí)施例4
[0061]本發(fā)明提出的一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，包括如下步驟:
[0062]S1、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀，再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l_3mm的乳豬肝顆粒；
[0063]S2、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3200rpm的轉(zhuǎn)速研磨3min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為1:1加入攪拌機(jī)中，以315rpm的轉(zhuǎn)速攪拌15.5min得到乳豬肝勻漿；
[0064]S3、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.3wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23:28，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于49°C的水浴鍋中浸提65min得到浸提液，將浸提液以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心22.5min,取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶；
[0065]S4、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加5mol/L鹽酸溶液至pH值為3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌20min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于40°C的水浴鍋中水解7h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為100:0.9 ；
[0066]S5、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81.8°C，保溫14min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿；
[0067]S6、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4200rpm的轉(zhuǎn)速離心15min后，將上清液取出滴加5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為7得到中性離心液；
[0068]S7、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.06MPa ；
[0069]S8、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.14MPa，回流壓力為0.05MPa。
[0070]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: .51、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀,再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l-3mm的乳豬肝顆粒； .52、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3100-3250rpm的轉(zhuǎn)速研磨2-3.5min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為5-6:4.5-5.5加入攪拌機(jī)中，以310-325rpm的轉(zhuǎn)速攪拌14_17min得到乳豬肝勻漿； .53、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.2-1.5wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為22-25:27-30，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于47-50°C的水浴鍋中浸提63-66min得到浸提液，將浸提液以5800-6200rpm的轉(zhuǎn)速離心22_23min，取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶； .54、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加4-6mol/L鹽酸溶液至pH值為2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的轉(zhuǎn)速攪拌19_22min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于37-45°C的水浴鍋中水解6-8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為 99-101:0.7-1 ； .55、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81-82°C，保溫12_15min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿； .56、離心:將S5得到的滅活勻衆(zhòng)加入離心瓶中，以4000_4300rpm的轉(zhuǎn)速離心14_17min后，將上清液取出滴加4-6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.8-7.2得到中性離心液； .57、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.04-0.07MPa ； .58、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.13-0.16MPa，回流壓力為0.04-0.07MPa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，其特征在于，S3中，取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.3-1.4wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23-24:28-29，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于48-49°C的水浴鍋中浸提64-65min得到浸提液，將浸提液以5900-6100rpm的轉(zhuǎn)速離心22.3-22.6min,取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，其特征在于，S4中，將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加4.5-5.5mol/L鹽酸溶液至pH值為2.7-3.2，再加入S3得到的胃蛋白酶以195-200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌20_2Imin后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于40-42°C的水浴鍋中水解6.7-7.8h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為 99.4-100.2:0.8-0.9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，其特征在于，S6中，將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4100-4200rpm的轉(zhuǎn)速離心15_16min后，將上清液取出滴加4.7-5.6mol/L氫氧化鈉溶液至pH為6.9-7.1得到中性離心液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述高提取率高活性促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: .51、乳豬肝預(yù)處理:取乳豬肝，去除膽囊、筋膜和結(jié)締組織，清水洗凈，浙水后再用注射用水清洗，然后切成寬度為3-5cm的小塊或細(xì)條狀,再置于絞肉機(jī)中絞成粒徑為l-3mm的乳豬肝顆粒； .52、均質(zhì):將SI得到的乳豬肝顆粒加入膠體磨中以3200rpm的轉(zhuǎn)速研磨3min得到乳豬肝糜，將乳豬肝糜和注射用水按重量比為1:1加入攪拌機(jī)中，以315rpm的轉(zhuǎn)速攪拌15.5min得到乳豬肝勻漿；. .53、胃蛋白酶的制備:取豬胃粘膜研磨成豬胃粘膜糜后置于反應(yīng)容器中，加入1.3wt%鹽酸溶液，豬胃粘膜糜和鹽酸溶液的體積比(g/ml)為23:28，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于4900C的水浴鍋中浸提65min得到浸提液，將浸提液以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心22.5min,取上清液進(jìn)行低溫干燥得到胃蛋白酶； .54、酶解:將S2得到的乳豬肝勻漿置于反應(yīng)容器中，滴加5mol/L鹽酸溶液至pH值為3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的轉(zhuǎn)速攪拌20min后，將反應(yīng)容器及其內(nèi)容物置于40°C的水浴鍋中水解7h得到酶解物料，其中乳豬肝勻漿與胃蛋白酶的重量比為100:0.9 ; .55、滅活:將S4得到的酶解物料水浴加熱至81.8°C，保溫14min后，將溫度降至室溫靜置得到滅活勻漿； .56、離心:將S5得到的滅活勻漿加入離心瓶中，以4200rpm的轉(zhuǎn)速離心15min后，將上清液取出滴加5mol/L氫氧化鈉溶液至pH為7得到中性離心液； .57、粗濾:將S6得到的中性離心液經(jīng)過(guò)截留分子量為100KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第一次過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截留分子量為1KD的中空纖維超濾裝置進(jìn)行第二次過(guò)濾得到粗濾液，其中第一次過(guò)濾和第二次過(guò)濾的回流壓力為0.06MPa ； .58、超濾:將S7得到的粗濾液再經(jīng)截流分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行超濾得到促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素溶液，其中進(jìn)液壓力為0.14MPa，回流壓力為0.05MPa。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104388510SQ201410583540
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】王康林, 馬婕, 陳玉海 申請(qǐng)人:合肥平光制藥有限公司