專利名稱：促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
早在七十年代初，人們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性切除大鼠肝臟的2/3或手術(shù)切除大部分損傷的人體肝臟后只需7-10天就可使肝臟恢復(fù)到原體積大小并自行停止；同時(shí)胚胎肝勻漿注入肝損傷鼠體內(nèi)可明顯促進(jìn)肝細(xì)胞再生，因此認(rèn)為在體內(nèi)存在某種物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的再生。1973早LaBrecque從大鼠再生肝臟中提取一種肝再生促進(jìn)物質(zhì)，將70％肝部分切徐后殘余的成年大鼠肝細(xì)胞制備勻漿并高速離心，從上清液中提取的物質(zhì)可明顯刺激單層培養(yǎng)的正常大鼠肝細(xì)胞DNA合成增加，并命名為“肝刺激物質(zhì)(Hepatic Stimulator Substance，HSS)。Goldberg從大鼠部分肝切除后的殘余肝組織提純的肝再生因子在體內(nèi)可使肝細(xì)胞DNA合成增加3-4倍；Starzl在狗的再生肝中亦發(fā)現(xiàn)類似物質(zhì)。Russell等和鹽田邦郎等證明血小板內(nèi)的肝再生因子也促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成顯著；同步和彥等在肝部分切除后48小時(shí)的大鼠小腸粘膜的可溶性成份中提取的肝再生因子與肝組織中的肝再生因子不同；謝明等從人胎肝細(xì)胞中提取的人胎肝再生因子具有較強(qiáng)的促進(jìn)鼠肝細(xì)胞DNA合成的作用。廣州空軍醫(yī)院陳光明等從乳豬肝中提取的“肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(HGF)”應(yīng)用于臨床治療各種肝炎患者有較好的療效。因此，到目前已發(fā)現(xiàn)一系列物質(zhì)均能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生，其來(lái)源不同，有肝源性、血小板源性和腸源性；分子量等理化性質(zhì)亦不相同，甚至同一來(lái)源不同方法的制備的物質(zhì)也有差別，所以命名有不同，如“肝細(xì)胞再生因子”、“肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(HGF)”、“促肝生長(zhǎng)素(Hepatopoietin，HPP)”、“肝刺激物質(zhì)(HepaticStimulator Substance，HSS)”、“DNA合成促進(jìn)因子(DNA SynthesisPromoter)”，關(guān)于這類物質(zhì)分子量的報(bào)導(dǎo)相差較大，坪內(nèi)博仁等從暴發(fā)性肝炎病人血液中經(jīng)Sephadex G-200分離后測(cè)其分子量為230000；Goldberg等從大鼠血漿中分離后其分子量約為38000；LaBrecque從乳鼠肝臟提取的HSS分子量為1-2萬(wàn)；陳光明制備的乳豬HCF分子量為10685，無(wú)論其分子量大小，他們都有其生物活性，使肝細(xì)胞DNA合成增加。
肝臟再生因子的研究在國(guó)內(nèi)外都報(bào)道很多，但應(yīng)用于臨床研究的很少，目前，國(guó)內(nèi)廣州空軍醫(yī)院研制的“肝細(xì)胞生長(zhǎng)素HGF”已初步應(yīng)用于臨床治療各種肝病患者，為低分子量多肽，有一定的治療效果。
病毒性肝炎在我國(guó)是常見(jiàn)病、多發(fā)病、其死亡率高，目前無(wú)理想的治療藥物，嚴(yán)重影響人們的生命健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是采用優(yōu)化的方法從乳豬肝中提取活性高、純度理想的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素，提供一種療效確切的治療肝病藥物。
本發(fā)明公開(kāi)了一種含促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)素為從乳豬肝臟中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由15種氨基酸組成，氨基酸總量為135.21±10.23nmol/ml；主要活性組份蛋白質(zhì)分子量為2.1萬(wàn)道爾頓，占總蛋白含量的60％以上，具有較高的刺激肝細(xì)胞DNA合成的活性。
所述的組成蛋白質(zhì)的15種氨基酸為Asp、Glu、Ser、Thr、Gly、His、Tyr、Arg、Ala、Met、Val、Ile、Leu、Lys、Phe。
本發(fā)明所述促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液為每毫升含蛋白質(zhì)15-25μg、pH6.0-8.0的水針或凍干粉針。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的制備方法。
本發(fā)明公開(kāi)的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液是通過(guò)將乳豬肝勻漿、攪拌、加熱、過(guò)濾、吸附、洗脫、除鹽、除菌、分裝獲得的。該注射液具體通過(guò)下述技術(shù)方案制得1.勻漿取經(jīng)洗滌后的乳豬肝先在攪肉機(jī)上初步攪碎，再用膠體磨處理，得到乳豬肝的勻漿。
2.攪拌把勻漿置于提取罐內(nèi)，按比例加入提取液，比例為1∶3W/V，同時(shí)以慢速攪拌一小時(shí)。
3.加熱以水浴的方式給提取罐加熱，至料液溫度達(dá)到95℃時(shí)停止加熱，并在此溫度點(diǎn)上保持15-20分鐘。
4.過(guò)濾加熱完成后，先把料液冷卻至室溫，然后用過(guò)濾的方式進(jìn)行固液分離，保留濾液。
5.提純5.1.上樣把經(jīng)固液分離得到的濾液以10升/時(shí)的流速上樣至已經(jīng)裝好、并經(jīng)平衡的DEAE Sepharose FF柱中，上樣量為柱體積的6倍。
5.2.洗脫上樣完畢后，分別用A、B洗脫液進(jìn)行分段洗脫，并收集B液洗脫峰。
5.3.除鹽用超濾膜超濾器除鹽；6.半成品檢定用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用注射用水調(diào)整其含量，使之為15-25μg/ml；用pH計(jì)測(cè)定pH值，調(diào)節(jié)pH值為6.0-8.0；控制氯離子濃度小于1.0mmol/L；7.除菌用0.2μ微孔濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾。
9.分裝，即得水針劑或冷凍干燥得凍干粉針，4℃以下保存。
本發(fā)明制備中所述的提取液為pH值7.6，0.02M的磷酸鹽緩沖液(PBS)；所述的A洗液是指含氯化鈉0.28M的PBS溶液；所述的B洗液是指含氯化鈉0.65M的PBS溶液。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)上述促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液在制備治療肝病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液能促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成，使肝細(xì)胞再生，可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
其治療劑量為重癥肝炎和肝硬化靜脈注射，每次4毫升(60μg)，每天兩次，30天為一療程。慢性肝炎靜脈注射，每次2毫升(30μg)，每天兩次，30-60天為一療程。
本發(fā)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液對(duì)熱敏感，4℃以下活性可保存一年，室溫14天(25℃)活性降低，95℃，30分鐘失去活性。
注射液在pH6.0-8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，不失去活性；對(duì)胰蛋白酶敏感，對(duì)SDS不敏感。注射液的活性測(cè)定可采用體內(nèi)、外3H-TdR摻入法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，均有明顯生物活性；其放射性計(jì)數(shù)(cpm)為對(duì)照組的1.7倍以上。
用本發(fā)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液進(jìn)行有關(guān)毒理、藥代、藥效和臨床試驗(yàn)一、毒理試驗(yàn)1.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的局部試驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)豚鼠，經(jīng)肌肉注射，呼吸平穩(wěn)、心跳頻率在正常范圍內(nèi)無(wú)異常改變，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，局部亦未發(fā)紅、腫、熱現(xiàn)象，無(wú)熱源反應(yīng)。
2.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的急性及長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)急性毒性試驗(yàn)選用健康小白鼠，肌肉和靜脈兩種途徑給藥，分別作一次肌注和一次靜注毒性試驗(yàn)，肌肉和靜脈用藥劑量達(dá)到最高允許劑量即750μg/kg體重時(shí)，均無(wú)動(dòng)物死亡，動(dòng)物行為正常，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，LD50無(wú)法測(cè)算。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，分成為高、中、低劑量組進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，無(wú)動(dòng)物死亡，亦未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等的異常改變。
3.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的特殊毒性試驗(yàn)為了觀察促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是否致癌變、畸變，利用姊妹染色體交換(SCE)，染色體畸變和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)，分別從染色體和細(xì)胞水平檢測(cè)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液是否致畸變和致癌變，設(shè)三個(gè)劑量組及對(duì)照組，同時(shí)設(shè)平行管，觀察細(xì)胞染色體的變化，無(wú)論從SCE細(xì)胞數(shù)觀察和間隔、二著絲粒、多著絲粒，大小環(huán)及染色體間交換，與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
致癌變?cè)囼?yàn)，采用3T3細(xì)胞培養(yǎng)，在軟瓊脂上培養(yǎng)觀察，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液三個(gè)劑量組均無(wú)細(xì)胞克隆形成，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞克隆的形成為陽(yáng)性，空白對(duì)照組陰性，說(shuō)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液不致癌變，亦不致突、畸變。
4.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的生殖毒性試驗(yàn)選用性成熟健康小白鼠、體重20克左右，分給藥與對(duì)照組，治療組分高、低劑量組，分別在受精前、妊娠期以及泌乳期用藥，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胎胚形態(tài)、外觀、器官發(fā)育正常、無(wú)畸胎發(fā)現(xiàn)，自然分娩后新生動(dòng)物情況良好，與對(duì)照組均無(wú)差異。
上述試驗(yàn)表明本發(fā)明注射液安全無(wú)毒。
二、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)將125I標(biāo)記的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，注射兔靜脈，注射后1、2、4、6、12、24、33、48、72小時(shí)分別靜脈抽血測(cè)血中放射性高、中、低劑量組濃度，結(jié)果注射后4小時(shí)血中達(dá)最高濃度，33小時(shí)后基本消失，半衰期為10小時(shí)，以肝臟分布最高，主要通過(guò)腎臟排泄。
通過(guò)8例正常人藥代動(dòng)力學(xué)觀察，藥物劑量120μg/8ml/次，用藥前、用藥后5’、10’、30’、45’、1°、2°、3°、4°、6°、8°、12°、24°共13次標(biāo)本分離血清后低溫保存，用生物活性檢測(cè)方法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者實(shí)驗(yàn)前后肝功能、心電圖、腎功能均無(wú)改變。血中開(kāi)始出現(xiàn)最高活性為0.84小時(shí)，半衰期為6.96小時(shí)。
三、藥效試驗(yàn)
A.促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成作用(一)材料和方法動(dòng)物健康純系SD大白鼠，體重200-250g。
HepG2細(xì)胞。
試劑3H-TdR(0.5mci/ml)，1640培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)其它常用試劑。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，蛋白濃度15μg/ml。
(二)方法1.體內(nèi)法選健康SD大白鼠，體重200g左右。設(shè)五個(gè)劑量組，分別給藥2.5μg/kg體重/天、1.25μg/kg體重/天、0.63μg/kg體重/天、0.32μg/kg體重/天、0.16μg/kg體重/天。并設(shè)一個(gè)對(duì)照組，用生理鹽水代替促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液。各劑量組及對(duì)照組分配大白鼠5只。首先將大白鼠用乙醚麻醉，外科手術(shù)方法切除其肝臟的三分之一，給予正常飲食飲水，六小時(shí)后按上述方案腹腔給藥一次，再過(guò)十八小時(shí)后腹注射3H-TdR50μCi，三小時(shí)后處死取肝組織1克，加0.1mol/L NaCl-檸檬酸鈉充分勻漿后，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，去上清，沉淀加1mol/LNaCl勻漿，于4℃靜置過(guò)夜后，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清，加無(wú)水乙醇至出觀沉淀，低速離心10分鐘，收集沉淀加2ml1mol/LNaCl，迅速攪拌加速溶解，加等體積氯仿—異戊醇(24∶1)劇烈振蕩15分鐘，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上層加2倍無(wú)水乙醇，離心取沉淀，加2ml蒸餾水溶解，取1ml滴在玻璃纖維膜上，烤干后加閃爍液放射性計(jì)數(shù)，另1ml稀釋后在260nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度。按0.200相當(dāng)于0.01mg/ml DNA換算成DNA的濃度，計(jì)算各組1分鐘放射性計(jì)數(shù)值cpm/mgDNA。
2.體外法將體外培養(yǎng)的HepG2培養(yǎng)液中加入三種不同劑量的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，使促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素終濃度分別為16.6μg/ml、3.3μg/ml和0.66μg/ml。另設(shè)空白對(duì)照組，用生理鹽水代替促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素。各劑量組和空白對(duì)照組又各設(shè)四個(gè)平行孔。37℃、5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后每孔加入3H-TdR5μCi，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，吸去培養(yǎng)液，用胰酶——EDTA使細(xì)胞脫壁，離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞吸至玻璃纖維膜上，在膜上用蒸餾水破細(xì)胞，然后用5％三氯醋酸變性蛋白、95％乙醇固定，膜片在37℃烤箱中烤干后放入液閃杯中，加閃爍液(POP-POPOP)5ml，用液體閃爍儀測(cè)一分鐘的放封性計(jì)數(shù)值(cpm值)。
(三)結(jié)果1.體內(nèi)法測(cè)定結(jié)果表1 體內(nèi)法測(cè)定肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液活性結(jié)果給藥途徑劑量(μg/kg體重) X±SD(cpm/mgDNA) 倍數(shù)靜注 2.508508±821 2.571.258342±799 2.530.636427±650 1.950.325758±542 1.740.163001±290 0.91生理鹽水對(duì)照組 3302±185注X±SD(×104)表示各劑量組平行管cpm/mgDNA計(jì)數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
靜注ED50為0.60μg/kg體重/天。
靜注的有效劑量范圍為0.32μg/kg體重/天以上。
2.體外細(xì)胞培養(yǎng)法測(cè)定結(jié)果。
表2體外法測(cè)定(放射性計(jì)數(shù))結(jié)果分組 劑量(μ g/ml) X±SD(cpm/2.5×105) 倍數(shù)空白對(duì)照組 不加細(xì)胞，不加 40(本底)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素16.610.520±311 2.14給藥組3.3 9.678±280 1.980.668.142±184 1.67對(duì)照組生理鹽水4.923±111注X±SD表示各組平行孔cpm計(jì)數(shù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
(四)結(jié)論經(jīng)體內(nèi)法活性測(cè)定得知，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注封液有明顯促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成的作用，3H-TdR的摻入明顯優(yōu)于對(duì)照組。通過(guò)對(duì)不同劑量促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液活性的研究表明，靜注的有效劑量為0.32μg/kg體重以上；靜注的半有效劑量為0.60μg/kg體重；靜注的藥效隨劑量增加而升高，但達(dá)1.25μg/kg體重/天時(shí)達(dá)到一種類似“穩(wěn)定”的狀態(tài)。體外細(xì)胞培養(yǎng)中活細(xì)胞計(jì)數(shù)和放射性計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比也顯著差異。放射性計(jì)數(shù)cpm值代表了肝細(xì)胞中3H-TdR的摻入量，因而也反映了細(xì)胞DNA的合成速度。由此可見(jiàn)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素不論在體內(nèi)或體外均有明顯促進(jìn)肝細(xì)胞DNA合成的作用。認(rèn)為促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素是一種活性高、藥效強(qiáng)的刺激肝細(xì)胞DNA合成的藥物。
B.D-半乳糖胺或四氯化碳所致肝損害動(dòng)物試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用純系健康大小白鼠各50只，大鼠體重在132-214克，小鼠體重50-100克，隨機(jī)分組(1)肝損傷組10只；(2)治療組30只(促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組2.5μg/kg、1.25μg/kg、0.63μg/kg；各10只)；(3)生理鹽水組10只。肝損傷組用D-半乳糖胺按500毫克/公斤體重腹腔注射或四氯化碳按0.5ml/100克體重造成肝損害，每天腹腔或靜脈注射1ml生理鹽水，72小時(shí)后處死取肝組織進(jìn)行病理檢查。治療組動(dòng)物如前造成肝損害，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組每天用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液分別按2.5μg/kg、1.25μg/kg、0.63μg/kg體重腹腔和靜脈注射共三天(每天一次)，治療組動(dòng)物均在72小時(shí)處死取肝臟進(jìn)行病理檢查。生理鹽水組的大白鼠不用D-半乳糖胺造成肝損害，小白鼠不用四氯化碳造成肝損害，僅每天用無(wú)菌生理鹽水5毫升腹腔和靜脈注射一次，共三次，72小時(shí)處死取肝送病理檢查(表3)。
說(shuō)明表中+、++、+++分別表示肝組織學(xué)觀察中，光鏡下以中央靜脈和門靜脈為視野中心，肝細(xì)胞壞死、變性、浸潤(rùn)和濁腫程度為輕、中、重；0表示無(wú)病毒改變。括號(hào)中數(shù)字表示產(chǎn)生各病理改變程度的動(dòng)物數(shù)。
表3不同劑量的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液對(duì)不同動(dòng)物、不同途徑、不同藥物所致肝損害的療效觀察大白鼠D-半乳糖胺肝組織學(xué)觀察分類 動(dòng)物數(shù) 途徑壞死變性細(xì)胞浸潤(rùn)濁腫生理鹽水 100 0+(1) +(1) 腹腔肝損傷組 10 +++(5) +++(2)+++(2)++(4) 腹腔促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療組2.5μg/kg 100 0 0+(1) 腹腔1.25μg/kg100 0 0+(1) 腹腔0.63μg/kg100+(1) +(1) +(2) 腹腔小白鼠四氯化碳組織學(xué)觀察分類 動(dòng)物數(shù) 途徑壞死變性細(xì)胞浸潤(rùn)濁腫生理鹽水 100 0+(1) +(1) 靜脈肝損傷組 10 +++(4) +++(2)++(3) ++(5) 靜脈促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療組2.5μg/kg 100 0+(1) +(1) 靜脈1.25μg/kg100 0 0+(1) 靜脈0.63μg/kg100 +(1) 0+(1) 靜脈小結(jié)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液治療組有明顯的改善肝細(xì)胞壞死、變性、炎癥侵潤(rùn)、濁腫作用，病變恢復(fù)接近正常。生理鹽水注射組，與病理組的病變有顯著差異，證示了促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素有再生肝細(xì)胞的能力，從理論上證明了促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素有促使DNA的合成和支持代謝、免疫調(diào)節(jié)的作用。
四、臨床試驗(yàn)(一)用藥方法、劑量及療程分重型肝炎組和重度慢性肝炎組，二組均在常規(guī)的基礎(chǔ)綜合治療基礎(chǔ)上，加用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液。
使用時(shí)劑量為；120μg加入10％葡萄糖100-250ml中靜脈滴注，每日一次，療程4周，有效者可延長(zhǎng)至6-8周。
常規(guī)的基礎(chǔ)綜合治療包括靜滴葡萄糖注射液、茵梔黃注射液、維生素、脂肪乳、支鏈氨基酸、適量的新鮮血、新鮮血漿、白蛋白及止血藥等，但在治療期間，重型肝炎組不能用皮質(zhì)激素、日達(dá)仙，前列腺素、胎肝注射液、胎肝及其他乳肝制劑等治療藥物；重度慢性肝炎組不能使用皮質(zhì)激素、抗病毒藥物、日達(dá)仙等治療藥物。
(二)觀察內(nèi)容1.癥狀及體征(包括乏力、食欲、惡心、嘔吐、腹脹、神志、尿量、出血情況、腹水量、黃疸、肝濁音界)，于治療前、治療后每2周和治療結(jié)束時(shí)各觀察記錄一次。
2.血常規(guī)、尿常規(guī)、血尿素氮及肌酐，血氨、甲胎蛋白(AFP)、電解質(zhì)、腹水常規(guī)及細(xì)菌培養(yǎng)，于治療前、治療后每2周和治療結(jié)束時(shí)各觀察記錄一次。
3.肝功能血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、于治療前、治療2周時(shí)和治療結(jié)束時(shí)各觀察記錄一次。
4.血清病毒標(biāo)志物測(cè)定抗-HAVIgM、HBsAg、HbeAg，抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc，HBsAg或/和HBeAg陽(yáng)性者測(cè)HBVDNA，抗-HCV陽(yáng)性者測(cè)定HCVRNA，HBsAg陽(yáng)性者測(cè)抗-HDV、HDVAg，另外，還測(cè)定抗-HEV，以上指標(biāo)于治療前記錄一次。
5.記錄藥物在應(yīng)用過(guò)程中的不良事件。
(三)療效判定標(biāo)準(zhǔn)療效分為顯效、有效、無(wú)效三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。
重型肝炎和重度慢性肝炎療效判定標(biāo)準(zhǔn)1.顯效臨床癥狀恢復(fù)，血清膽紅素、ALT復(fù)常。
2.有效；血清膽紅素，ALT降至治療前水平50％以下。
3.無(wú)效療程結(jié)束后臨床及肝功能未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)或死亡。
將顯效例數(shù)和有效例數(shù)合并統(tǒng)計(jì)為總有效例數(shù)。
(四)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法1.病人癥狀、體征的變化用X2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2.病人的生化指標(biāo)，如ALT、AST、TBIL、ALB、PTA及AFP的變化用改變率來(lái)表示 因改變率呈偏態(tài)分布，因此用中位數(shù)表示之，+代表上升，一代表下降。用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
(五)結(jié)果A.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重度慢性肝炎的治療效果1.病死率及死亡原因應(yīng)用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素后，333例重度慢性肝炎病人中，死亡2例。其中1例死于消化道出血，另一例死于肝腎綜合征。存活331例。用藥觀察期間病死率為0.6％。
2.肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重度慢性肝炎病人癥狀、體征的療效表4二周四周 六周好轉(zhuǎn)好轉(zhuǎn) 例 好轉(zhuǎn) X2P例數(shù) (％) 例數(shù)(％) (％)例數(shù)例數(shù) 數(shù) 例數(shù)乏力 322 23573.0 302 266 88.1 87 77 88.5 27.73 ＜0.001納差 316 24577.5 294 271 92.2 86 81 94.2 33.47 ＜0.001惡心 263 22485.2 246 235 95.5 70 67 95.7 19.25 ＜0.001嘔吐 167 14083.8 157 153 97.5 50 50 100 25.04 ＜0.001腹脹 247 17671.3 233 211 90.6 74 66 89.2 33.85 ＜0.001上腹不 192 11258.3 183 150 82.0 59 51 86.4 36.11 ＜0.001適黃疸 311 17054.7 292 234 80.1 85 74 87.1 60.42 ＜0.001出血 4629 63.1 4235 83.3 18 17 94.4 8.93 0.01用藥后2周，病人的乏力、納差、惡心、嘔吐、腹脹、上腹不適、黃疸及出血的好轉(zhuǎn)率分別為73.0％、77.5％、85.2％、83.8％、71.3％、58.3％、54.7％和63.1％；用藥至4周時(shí)好轉(zhuǎn)率分別為88.1％、92.2％、95.5％、97.5％、90.6％、82.0％、80.1％和83.3％；用藥6周時(shí)分別為88.5％、94.2％、95.7％、100％、89.2％、86.4％、87.1％和94.4％。這些變化經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異非常顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。
3.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重度慢性肝炎病人生化指標(biāo)的療效表5

N病例數(shù)，M改變率的中位數(shù)，Min改變率最小值，Max，改變率最大值。重度慢性肝炎病人用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素后ALT、AST、TBIL變化明顯下降，PTA、ALB的變化逐漸上升，AFP也有上升，但上升幅度逐漸減少。這些變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有非常顯著的差異，P＜0.01。
4.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重度慢性肝炎的總臨床效果表6療效病例數(shù) ％顯效 124 38.3有效 164 50.6無(wú)效 3611.1總有效288 88.9用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液治療重度慢性肝炎總有效率為88.9％。
B.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)重型肝炎的治療效果1.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重型肝炎病人癥狀、體征的影響表7
二周 四周 六周好轉(zhuǎn) 好轉(zhuǎn) 例好轉(zhuǎn) X2P例數(shù) (％) 例數(shù)(％) (％)例數(shù) 例數(shù) 數(shù)例數(shù)乏力 346 197 56.9 291 243 83.5 113 9886.7 71.86 ＜0.001納差 333 214 64.3 278 240 86.3 113 106 93.8 64.68 ＜0.001惡心 302 215 71.2 257 230 89.5 104 9995.2 47.75 ＜0.001嘔吐 212 162 76.4 181 168 92.8 767092.1 24.91 ＜0.001腹脹 315 183 58.1 264 225 85.2 104 9288.5 80.07 ＜0.001上腹不 231 125 51.4 197 156 79.2 847285.7 46.89 ＜0.001適黃疸 345 141 40.9 287 200 69.7 110 8577.3 74.20 ＜0.001出血 77 39 50.7 644671.9 232087.0 17.110.002用藥后2周，病人的乏力、納差、惡心、嘔吐、腹脹、上腹不適、黃疸及出血的好轉(zhuǎn)率分別為56.9％、64.3％、71.2％、76.4％、58.1％、51.4％、40.9％和50.7％；用藥至4周時(shí)好轉(zhuǎn)率分別為83.5％、86.3％、89.5％、92.8％、85.2％、79.2％、69.7％和71.9％用藥6周時(shí)分別為86.7％、93.8％、95.2％、92.1％、88.5％、85.7％、77.3％和87.0％，這些變化經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異非常顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。
2.使用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重型肝炎病人生化指標(biāo)的影響表8

重型肝炎病人應(yīng)用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素后ALT、AST、TBIL、ALB及PTA均有明顯的改變，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，ALT、AST、TBIL逐漸下降，ALB與PTA上升，改變率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有非常顯著的差異，P＜0.01。
3.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液對(duì)重型肝炎的臨床效果①促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)重型肝炎的總臨床效果表9
療效病例數(shù) ％顯效 118 34.0有效 154 44.4無(wú)效 7521.6總有效272 78.4用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(威佳)注射液治療重型肝炎總有效率為78.4％。
②促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)重型肝炎(亞急性、慢性)不同分期病人的臨床觀察效果 表10顯效 有效 無(wú)效 總有效病例數(shù)N％N％N％N％早期 129 49 38.0 67 51.9 13 10.1 116 89.9中期 145 56 38.6 67 46.2 22 15.2 123 84.8*晚期 51 12.0 13 25.5 37 72.6 14 27.5*用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療亞急性、慢性重型肝炎早期、中期和晚期的總有效率分別為89.9％、84.8％和27.5％。
*重型肝炎早期與中期的總有效率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，X2＝1.59，P＝0.21；重型肝炎晚期的總有效率與早期和中期比較差異顯著，有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，X2＝89.08，P＜0.001。
結(jié)論在基礎(chǔ)綜合治療上加用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)重度慢性肝炎的總有效率為88.9％，對(duì)重型肝炎的總有效率為78.4％。表現(xiàn)為病人病死率較低，癥狀、體征及生化指標(biāo)的改善較明顯。這與促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液能夠促進(jìn)肝細(xì)胞的再生、降低腫瘤壞死因子(TNF)水平，及對(duì)肝細(xì)胞膜有一定的修復(fù)作用有關(guān)。
上述試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液有顯著的再生肝細(xì)胞的能力，促使DNA的合成和支持代謝、免疫調(diào)節(jié)的作用，是理想的治療肝病藥物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的制備原料健康乳豬，豬齡15-20天，體重7-7.5kg/只，于上午6-8時(shí)放血處死取肝臟，清洗血液后-20℃保存。
1.勻漿取經(jīng)洗滌后的乳豬肝先在攪肉機(jī)上初步攪碎，再用膠體磨處理，得到乳豬肝的勻漿。
2.攪拌搗碎后的勻漿置于提取罐內(nèi)，按1∶3W/V的比例加入提取液，于室溫下低速(60轉(zhuǎn)/分)攪拌一小時(shí)，以充分提取所需成分。
3.加熱以水浴的方式給提取罐加熱，至料液溫度達(dá)到95℃時(shí)停止加熱，并在此溫度點(diǎn)上保持15-20分鐘。
4.過(guò)濾和冷卻加熱完成后，先把料液冷卻至室溫，然后用過(guò)濾的方式進(jìn)行固液分離，保留濾液。
5.提純5.1.DEAE-Sepharose FF的裝柱和處理把新購(gòu)入的DEAE-Sepharose FF中的酒精倒掉，加入3倍以上體積的PBS，搖勻，以“自然沉降法”裝柱，裝好后柱內(nèi)無(wú)氣泡，無(wú)分層觀象。然后用2M的氯化鈉溶液洗1個(gè)柱體積，用蒸餾水洗3個(gè)柱體積，再用PBS平衡至流出液的pH值與PBS相同。
5.2、上樣把經(jīng)固液分離得到的濾液以10升/時(shí)的流速給已經(jīng)裝好、并經(jīng)平衡的DEAE Sepharose FF柱上樣，上樣量為柱體積的6倍。
5.3.A液洗脫上樣完畢后，先用A液洗脫，流速15000ml/小時(shí)，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)洗脫液在280nm的吸收度，小于0.5后停用A液洗脫。
5.4.B液洗脫
當(dāng)A液洗脫液的A280nm小于0.5時(shí)，換為B液洗脫，流速8000ml/小時(shí)，同樣用A280nm監(jiān)測(cè)，當(dāng)A280nm開(kāi)始上升時(shí)，收集此部分洗脫液，至A280nm小于0.5時(shí)停止收集。
5.5.除鹽采用進(jìn)口超濾膜超濾器除鹽，經(jīng)除鹽后即為半成品促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素。
6.半成品檢定6.1.蛋白質(zhì)含量用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用注射用水調(diào)整其含量，使之為15-25μg/ml。
6.2.PH值調(diào)整用pH計(jì)測(cè)定pH值，調(diào)節(jié)pH值為7.0-7.8(6.0-8.0)。
6.3.氯離子檢查用“硝酸銀滴定法”測(cè)定，要求氯離子濃度小于1.0mmol/L。
6.4、內(nèi)毒素檢測(cè)以鱟試劑檢測(cè)半成品的內(nèi)毒素，使蛋白含量在15-25μg/ml時(shí)，其內(nèi)毒素值應(yīng)小于5.25EU/ml。
7.除菌用0.2μ微孔濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾。
8.分裝安瓿，2ml/支，蛋白質(zhì)含量為15μg/ml，保存于4℃以下。
實(shí)施例2 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素蛋白質(zhì)含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備 取已在五氧化二磷干燥器中減壓干燥至恒重的牛血清白蛋白對(duì)照品約15mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分別置具塞試管中，均加水使成4.0ml，分別精密加入福林酚試液甲6ml，搖勻，放置10分鐘，再分別精密加入福林酚試液乙1ml，立即搖勻，至35℃水浴中保溫35分鐘，放冷至室溫，以第一份為空白，照分光光度法(中國(guó)藥典1990年版二部附錄24頁(yè))，在660nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度為縱座標(biāo)，濃度為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定法精密量取本品4ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“分別精密加入福林酚試液甲6ml”起，依法測(cè)定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中蛋白質(zhì)的含量(μg)，計(jì)算，即得。
取8個(gè)批號(hào)的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，每批取5支樣品，依上述方法測(cè)得其蛋白質(zhì)含量。結(jié)果見(jiàn)表11。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的蛋白質(zhì)含量為15.0-25.0μg/ml。
表11 不同批號(hào)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的蛋白質(zhì)含量(μg/ml) 實(shí)施例3 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的氨基酸組成分析取10個(gè)不同批號(hào)的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，每批號(hào)取10個(gè)樣品，經(jīng)鹽酸處理，110℃加熱，離心取上清液，用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜測(cè)定其氨基酸組成，與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖譜比較。
取促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液2.5ml加12N鹽酸2.5ml，110℃水解后，取上清液1ml抽干，加入雙蒸水溶解，加鄰苯二甲醛、巰基乙醇等上HPLC所得圖譜與標(biāo)準(zhǔn)比較，計(jì)算每個(gè)峰的面積。其氨基酸組成共有15種(見(jiàn)表12)，氨基酸總量為135.21±10.23nmol/L。
表12 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的氨基酸組成及濃度測(cè)定氨基酸濃度(nmol/ml±SD)氨基酸 濃度(nmol/ml±SD)Asp12.71±3.23 Ala 13.63±4.27
Glu 19.40±5.65 Met0.31±0.12Ser 14.33±4.37 Val8.57±2.48Thr7.36±2.31 ILe5.88±2.18Gly 22.18±8.02 Leu 11.05±4.20His2.75±0.61 Lys 6.3±1.63Tyr1.83±0.62 Phe3.54±1.04Arg5.36±1.20 Total135.21±10.23實(shí)施例4 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的聚丙烯酰胺疑膠電泳和分子量測(cè)定將促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(顯)示產(chǎn)品中有三個(gè)蛋白質(zhì)組份，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)TdR3H摻入法用β-液體閃爍儀檢測(cè)得知其中跑在最前面的一條主要區(qū)帶A為有活性的區(qū)帶，其余兩條帶為無(wú)活性的次要區(qū)帶。經(jīng)紫外掃描檢測(cè)和高效液相色譜圖面積計(jì)算主帶占總蛋白時(shí)的60％以上(Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量)。
分子量測(cè)定取本品1支，凍干后，加蒸餾水20μl使溶解，加水解液(取十二烷基硫酸鈉0.1g，硫基乙醇100μl，甘油1g，溴酚藍(lán)指示液適量)，置沸水浴中水解3分鐘，備用。標(biāo)準(zhǔn)蛋白(SIGM公司，分子量14400-94000)，水解方法同供試品。凝膠濃度為10％。照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定(部頒標(biāo)準(zhǔn)生化藥品第一冊(cè)1989附錄61頁(yè))，以相對(duì)適移率(R’m)為橫座標(biāo)，已知分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對(duì)數(shù)為縱座標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪圖，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出供試品的分子量。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的有效成份為A帶，分子量約2.1萬(wàn)道爾頓。
實(shí)施例5 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的活性測(cè)定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素促使肝細(xì)胞DNA合成，利用此原理建立體內(nèi)、體外的測(cè)活方法。(HepG2細(xì)胞培養(yǎng)3H-TdR摻入法)材料和方法1.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液(自制蛋白含量15μg/ml)。
2.試劑檸檬酸鈉、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、PPO-POPOP閃爍液、1640培養(yǎng)基、氯化鈉等。
3.儀器754紫外分光光度計(jì)、液體閃爍儀、二氧化碳培養(yǎng)箱。
4.促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素活性測(cè)定方法一體內(nèi)3H-TdR摻入法。
(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)SD大白鼠體重180-230g，于上午8:00-10:00用乙醚麻醉，手術(shù)切除1/3(切左后葉)，術(shù)后六小時(shí)于腹腔內(nèi)注射促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，術(shù)后23小時(shí)于腹腔注入50uCi3H-TdR(中國(guó)原子能科學(xué)研究所)，術(shù)后25小時(shí)處死鼠取肝臟。對(duì)照組大白鼠用等體積生理鹽水代替促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液腹腔注射，其余同實(shí)驗(yàn)組。
(2)肝細(xì)胞DNA提取及測(cè)定肝組織1克，加0.1mol/L NaCL-0.05mol/L檸檬酸納4ml制成勻漿，3000rpm/分離心20’，沉淀再用0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉洗滌二次，沉淀加5ml 5M NaCl研磨，粘度逐漸增加，4℃放置24-48小時(shí)，取上清液加95％乙醇至出現(xiàn)凝膠狀態(tài)停止，取膠狀物加5ml1mol/L NaCl溶解，加等量氯仿-異戌醇(24∶1)，振蕩15分鐘，3000rpm/分離心10分鐘分三層，取上清液加2倍體積95％乙醇出現(xiàn)纖維狀物，取此物用75％乙醇洗二次，加2ml蒸餾水溶解，其中1ml滴于49型玻璃纖維膜，干燥后用FJ-2107液體閃爍測(cè)放射性計(jì)數(shù)(cpm值)，最后計(jì)算cpm值/mgDNA。
5、體外法測(cè)定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液生物活性由于體內(nèi)法測(cè)活性比較繁瑣復(fù)雜，而且動(dòng)物個(gè)體之間差異較大，存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差。參照LaBreque和Romero等推薦的體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)活性方法，本發(fā)明建立了體外測(cè)定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素生物活性的方法，多次實(shí)驗(yàn)證實(shí)此方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。故此我們將此方法作為促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液產(chǎn)品的常規(guī)活性檢查方法?，F(xiàn)將方法報(bào)導(dǎo)如下。
HepG2細(xì)胞，調(diào)至細(xì)胞濃度為2.5×105/ml/孔，用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁后每孔加一定劑量的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，5％CO2連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加5uCi3H-TdR/每孔，6小時(shí)用胰酶-EDTA消化細(xì)胞并全部收集于49型玻璃纖維膜上，用蒸餾水破細(xì)胞后三氯醋酸、乙醇處理，將膜烘干，放于閃爍液中，計(jì)數(shù)60秒的放射性計(jì)數(shù)(cpm)值，即為cpm值/2.5×105細(xì)胞/孔。為對(duì)照組的1.7倍以上者為合格產(chǎn)品。
結(jié)果1.體內(nèi)法測(cè)定結(jié)果(表13)表13體內(nèi)法測(cè)定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液活性結(jié)果分組 X±SD(cpm mgDNA) 倍數(shù)(與對(duì)照組比)給藥組(促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素)9315±2120 1.725生理鹽水對(duì)照組5400±14022.體外法測(cè)定結(jié)果(表14)表14體外法測(cè)定促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液活性結(jié)果分組 X±SD(cpm/2.5×105細(xì)胞)倍數(shù)空白對(duì)照組(不加細(xì)胞) 36±10(本底)生理鹽水對(duì)照組 6010±128給藥組(促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素0.2ml)1.2488±249 2.08
權(quán)利要求
1.一種促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，其特征在于其中所述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)素為從乳豬肝臟中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由15種氨基酸組成，分子量為2.1萬(wàn)道爾頓，占總蛋白含量的60％以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，其特征在于該注射液為每毫升含蛋白質(zhì)15-25μg、pH6.0-8.0的水針或凍干粉針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，其特征在于其中所述的組成蛋白質(zhì)的15種氨基酸為Asp、Glu、Ser、Thr、Gly、His、Tyr、Arg、Ala、Met、Val、Ile、Leu、Lys、Phe。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的制備方法，其特征在于該注射液是通過(guò)將乳豬肝勻漿、攪拌、加熱、過(guò)濾、吸附、洗脫、除鹽、除菌、分裝獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液的制備方法，其特征在于該注射液的制備包括下列步驟1)勻漿取經(jīng)洗滌后的乳豬肝先在攪肉機(jī)上初步攪碎，再用膠體磨處理，得到乳豬肝的勻漿；2)攪拌搗碎后的勻漿置于提取罐內(nèi)，按1∶3W/V的比例加入提取液，于室溫下低速60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢枰恍r(shí)，以充分提取所需成分；3)加熱以水浴的方式給提取罐加熱，至料液溫度達(dá)到95℃時(shí)停止加熱，并在此溫度點(diǎn)上保持15-20分鐘；4)過(guò)濾加熱完成后，先把料液冷卻至室溫，然后用過(guò)濾的方式進(jìn)行固液分離，保留濾液；5)提純(5.1)上樣把經(jīng)固液分離得到的濾液以10升/時(shí)的流速上樣至已經(jīng)裝好、并經(jīng)平衡的DEAE Sepharose FF柱中，上樣量為柱體積的6倍；(5.2)洗脫分別用含氯化鈉0.28M和0.65M的PBS溶液洗脫；(5.3)除鹽用超濾膜超濾器除鹽；6)半成品檢定用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用注射用水調(diào)整其含量，使之為15-25μg/ml；用PH計(jì)測(cè)定PH值，調(diào)節(jié)PH值為6.0-8.0；控制氯離子濃度小于1.0mmol/L；以鱟試劑檢測(cè)半成品的內(nèi)毒素，使蛋白含量在15-25μg/ml時(shí)，其內(nèi)毒素值應(yīng)小于5.25EU/ml；8)除菌用0.2μ微孔濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾；9)分裝，即得水針劑或冷凍干燥得凍干粉針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液在制備治療肝病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液及制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液，選用的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素為從乳豬肝臟中提取分離獲得的一種活性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由15種氨基酸組成，氨基酸總量為135.21±10.23nmol/ml；主要活性組份蛋白質(zhì)分子量為2.1萬(wàn)道爾頓，占總含量的60％以上，具有較高的刺激肝細(xì)胞DNA合成的活性，使肝細(xì)胞再生。該注射液可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
文檔編號(hào)A61K35/37GK1533806SQ0311605
公開(kāi)日2004年10月6日 申請(qǐng)日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者楊錦龍 申請(qǐng)人:威海賽洛金藥業(yè)有限公司