專利名稱：一種抗生育化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是抗生育化合物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽及其制備方法以及用其制備的一種抗生育制劑。
背景技術(shù)：
人精子頂體蛋白酶是受精過程中必不可少的蛋白水解酶，頂體蛋白水解酶抑制劑能抑制精子頂體蛋白酶活性，影響精子的頂體反應(yīng)和穿卵能力，從而達(dá)到避孕效果。據(jù)報(bào)道4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯鹽酸鹽具有抑制頂體酶活性(詳見J.Med.Chem.1986，29，514～519)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為 其經(jīng)典制備路線如下 反應(yīng)步驟為(1)對氨基苯甲酸于水溶液中，在鹽酸存在下與硫氰酸銨作用，生成4-硫脲基苯甲酸鹽酸鹽；(2)4-硫脲基苯甲酸鹽酸鹽在乙醇溶液中與碘甲烷反應(yīng)，生成4-(S-甲基異硫脲基)苯甲酸氫碘酸鹽；(3)4-(S-甲基異硫脲基)苯甲酸氫碘酸鹽與過量氨水反應(yīng)生成4-胍基苯甲酸；(4)4-胍基苯甲酸與稀鹽酸生成4-胍基苯甲酸鹽酸鹽；(5)4-胍基苯甲酸鹽酸鹽與4-羥基苯甲酸甲酯于吡啶與N，N-二甲基甲酰胺溶劑中在4-甲苯磺酸催化下以DCC脫水成酯，反應(yīng)畢以醋酸破壞過量的DCC，粗品以索氏提取器用氯仿做溶劑提取得產(chǎn)品4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯；(6)4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯與稀鹽酸生成4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽。
上述制備工藝存在如下不足1、步驟(1)至(3)，反應(yīng)時(shí)間長，操作繁瑣，總產(chǎn)率較低；2、步驟(2)中使用碘甲烷，價(jià)格較貴；3、步驟(5)無水要求高，后處理繁瑣，收率極低，特別是4-胍基苯甲酸鹽酸鹽與對羥基苯甲酸甲酯成酯反應(yīng)，采用DCC脫水成酯的方法，反應(yīng)不完全，后處理困難，產(chǎn)率很低。
由于上述不足，以及4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯鹽酸鹽溶解度差，所以雖然其有抑制頂體酶活性的報(bào)道，但至今未見用該化合物制備抗生育制劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種溶解度大、抗生育效果好、制備工藝簡單、得率高的抗生育化合物，以及用該化合物制備的抗生育制劑。
本發(fā)明抗生育化合物，是4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽，該化合物不僅溶解度比4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯鹽酸鹽大，而且制備工藝大大簡化，產(chǎn)物得率又高。
4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽合成路線如下 反應(yīng)步驟為(1)1-脒基-3，5-二甲基吡唑硝酸鹽(I)和對氨基苯甲酸(II)于乙醇中反應(yīng)，反應(yīng)畢堿化，稀鹽酸酸化，得4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)；(2)4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)與氯化亞砜作用生成4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽，再加入四氫呋喃、三乙胺和4-羥基苯甲酸甲酯(IV)生成4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯鹽酸鹽(V)；(3)(V)于二甲亞砜溶劑中，冰浴下與稀氫氧化鈉作用，得游離4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯，再與甲烷磺酸反應(yīng)得產(chǎn)物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽(VI)。
本發(fā)明制備方法在4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽制備方法基礎(chǔ)上作了改進(jìn)1.在4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)的制備中，由原三步反應(yīng)縮短為一步反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了收率；2.在4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)與4-羥基苯甲酸甲酯(IV)成酯反應(yīng)中改用酰氯法，反應(yīng)更簡便，后處理簡易，收率提高，成本降低；3.在4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)制備中革除了原制備方法中碘甲烷等價(jià)格昂貴的試劑，從而降低了成本。重要的是4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽比4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽溶解度大為提高，因而提高了化合物的抗生育效果。
用本發(fā)明化合物和輔料制備抗生育制劑，輔料為檸檬酸、檸檬酸鈉、過氧化氫、卡伯浦974p和甘油，重量配比如下4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽1份檸檬酸5-7份檸檬酸鈉22-26份過氧化氫 4-6份卡伯浦974p0.8-1.2份甘油12-14份制備方法為(按各組份的上述重量配比)將2.75％(g/v)檸檬酸溶液加到3.69％(g/v)檸檬酸鈉溶液中，攪拌至檸檬酸鹽緩沖液pH4.8～5.3，加3％過氧化氫至檸檬酸鹽緩沖液中，得過氧化氫檸檬酸鹽緩沖液，備用。
取4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽，溶于甘油中，攪拌溶解，將卡泊浦-974p加入至甘油中，當(dāng)卡泊浦-974p被甘油完全浸潤后，把過氧化氫檸檬酸緩沖液加入至甘油液中，持續(xù)攪拌均勻即得本發(fā)明抗生育制劑。
該制劑呈凍膠狀，用于陰道給藥，經(jīng)體外及動物試驗(yàn)，具有良好的抗生育效果；且一次給藥抗生育作用時(shí)間可持續(xù)24小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例14-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)的制備4-氨基苯甲酸13.7g(0.10mol)、1-脒基-3，5-二甲基吡唑硝酸鹽20.12g(0.10mol)在200ml乙醇中，磁力攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流8小時(shí)，回收乙醇，殘留物加10％氫氧化鈉溶液至pH9，加活性炭2g脫色，濾液加10％鹽酸中和至pH3，析出固體。固體加蒸餾水煮沸溶解，放冷，慢慢析出針狀無色固體，抽濾，得4-胍基苯甲酸鹽酸鹽白色固體15.7g，產(chǎn)率72.7％。mp276～277℃。
核磁共振儀測得其核磁共振氫譜如下1HNMRδ(DMSO，300MHz)7.19(2H，d，J＝4.86)；7.94(2H，d，J＝4.84)；8.33(4H，s)；12.18(1H，s)實(shí)施例24-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽(V)的制備4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)23.3g(0.10mol)，氯化亞砜119g(1.00mol)，磁力攪拌，回流1.5小時(shí)，放冷，加石油醚100ml，過濾得4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽。
于另一反應(yīng)瓶中加4-羥基苯甲酸甲酯(IV)15.2g(0.10mol)，無水四氫呋喃150ml，三乙胺10.1g(0.10mol)，攪拌反應(yīng)，溫度維持在3～2℃迅速加入上述4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽，冰浴反應(yīng)2小時(shí)，室溫?cái)嚢?小時(shí)，過濾，濾餅以乙醚160ml分四次充分洗滌，抽干，干燥，得4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽(V)白色固體32g℃產(chǎn)率91.5％，熔點(diǎn)255～257℃。
實(shí)施例34-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽(VI)的制備4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽(V)32g，二甲亞砜150ml，攪溶；冰浴下將0.10mol氫氧化鈉40ml滴入二甲亞砜液中，冰浴攪拌1小時(shí)，將反應(yīng)液傾入冰蒸餾水中；以乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯液，加甲烷磺酸9.6g(0.10mol)，濃縮去適量乙酸乙酯液，固體過濾。無水乙醇重結(jié)晶得4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽(VI)純品18g，產(chǎn)率48.1％。熔點(diǎn)215～217℃。
核磁共振儀測得其核磁共振氫譜如下1HNMR(DMSO，300MHz)3.88(3H，s)；4.27(3H，s)；7.44(2H，d，J＝5.22)；7.81～7.85(4H，m)；8.08(2H，d，J＝5.22)；8.18(2H，d，J＝5.16)；10.15(1H，s)。
實(shí)驗(yàn)例4制備抗生育制劑將2.75％(g/v)檸檬酸溶液12ml加到3.69％(g/v)檸檬酸鈉溶液48ml中，攪拌，得檸檬酸鹽緩沖液60ml，pH5，再加3％過氧化氫溶液10ml，得過氧化氫檸檬酸鹽緩沖液70ml，備用。
取4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽2g，溶于25g甘油中，以50轉(zhuǎn)/分鐘不斷攪拌，將3g卡泊浦-974p慢慢加入至甘油中，當(dāng)卡泊浦-974p被甘油完全浸潤后，把上述70ml過氧化氫檸檬酸緩沖液在5分鐘之內(nèi)持續(xù)加入甘油液中，加畢，以50轉(zhuǎn)/分鐘攪拌2小時(shí)，得本發(fā)明抗生育制劑。
4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽急性毒性試驗(yàn)與致突變作用一、急性毒性試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選用昆明種小鼠，雌雄各半，重18～22g。實(shí)驗(yàn)前停食4小時(shí)，按體重隨機(jī)分組，灌胃給藥。觀察給藥后七天內(nèi)動物的毒性反應(yīng)和死亡數(shù)。
小鼠服藥后15分鐘開始精神委靡、少動、反應(yīng)退緩，呼吸加深，除個別動物死亡外，8小時(shí)后動物都恢復(fù)正常，飲食、活動正常，體重增加。經(jīng)Bilss法計(jì)算，小鼠口服LD50大于5000mg/kg。表明本發(fā)明化合物毒性極小。
二、致突變試驗(yàn)一)試驗(yàn)方法用組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)TA97、TA98、TA100及TA102為指示微生物。采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，實(shí)驗(yàn)在加和不加代謝活性系統(tǒng)條件下進(jìn)行，代謝活化系統(tǒng)用S9。樣品的各種濃度均做3個平板，取其均值及標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)，實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)計(jì)見表1。
表1實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)計(jì)劑量S9或Buf菌量頂瓊脂培養(yǎng)時(shí)間測試物(μg/皿) (ml) (ml) (ml)(h)本發(fā)明化合物5000 0.20 0.10 2.0481000 0.20 0.10 2.048500 0.20 0.10 2.048100 0.20 0.10 2.04850 0.20 0.10 2.048二甲亞砜 0.1ml 0.20 0.10 2.048水 0.1ml 0.20 0.10 2.048陽性對照 0.1ml 0.20 0.10 2.048二)結(jié)果，見表2三)評價(jià)Ames試驗(yàn)結(jié)果的評價(jià)，是以比較各劑量的回變菌落數(shù)與陰性對照的倍數(shù)為基礎(chǔ)，如大于或相當(dāng)于陰性對照的兩倍，并在一定劑量范圍內(nèi)存在著劑量反應(yīng)關(guān)系，則判為陽性。
本實(shí)驗(yàn)中各劑量組的本發(fā)明化合物對TA97、TA98、TA100及TA102的回變菌落數(shù)，在加和不加S9條件下均與自發(fā)回變數(shù)相近(未超過白發(fā)回變數(shù)的2倍)，故判本發(fā)明化合物致突變?yōu)殛幮?。? 4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽對S.typhimurium TA97、TA98、TA100及TA102的致突變性結(jié)果測試物 回變菌落數(shù)(個/皿，X±S)及劑量 TA97TA98TA100TA102(μg/皿)-S9 +S9 -S9+S9 -S9 +S9 -S9 +S9本發(fā)明化合物5000112±3.1105±9.1 42±3.138±3.1158±17.0156±16.2240±14.3251±17.41000112±3.6133±4.9142±7.031±3.5139±14.7177±10.2231±11.5270±5.0500 110±10.1 117±15.129±8.533±7.2163±21.9166±7.0 275±52.3252±20.2100 103±13.9 109±2.1 35±6.531±8.5168±11.4170±13.6243±24.2238±3.150 124±7.0118±11.334±7.533±6.8149±9.6 169±12.1246±30.7257±6.1二甲亞砜 0.1ml113±4.4116±15.136±4.633±3.8164±9.8 172±5.7 237±15.7239±2.0水 0.1ml113±24.0 112±11.431±3.534±7.4159±8.5 176±6.4 250±11.7246±10.1敵克松 50μg773±83.1 -605±102 -702±100- 727±48.3-2-AF 10μg -751±539- 549±50.4 - 806±95.6 - -1，8-二羥基蒽醌 30μg - -- - - - - 839±64.1
體外試驗(yàn)4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽(VI)對精子頂體酶抑制作用的檢測本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的明膠薄膜法來測定4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽對人精子頂體酶的抑制活性。并用已知對人精子頂體酶有抑制活性的TLCK(對甲苯磺酰賴氨酰氯甲基酮)做對照。結(jié)果表明4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽是一種較強(qiáng)且有效的精子頂體酶抑制劑，它比標(biāo)準(zhǔn)的頂體酶抑制劑TLCK的抑制活性強(qiáng)約120倍，最低有效抑制濃度為4×10-2mg/ml。
動物試驗(yàn)本試驗(yàn)的目的是觀察本發(fā)明化合物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽在家兔體內(nèi)的抗生育作用本發(fā)明化合物濃度為3mg/ml，6mg/ml(用含有8％DMF的生理鹽水配制)。動物家兔，新西蘭種來源中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心體重3～4kg性別雌性分組對照組、家兔5只，每只給1ml含8％DMF的生理鹽水；低劑量組，家兔7只，給本發(fā)明化合物的劑量為3mg/只；大劑量組，家兔5只，給本發(fā)明化合物的劑量為6mg/只。試驗(yàn)的主要步驟精液的采取取新西蘭種家兔，雄性，與雌兔同籠時(shí)，用人工陰道，采取新鮮精液，置37℃水浴中，檢查精子活動度，并計(jì)數(shù)。
要求精子活動度≥60％，前向運(yùn)動精子≥75％，精子數(shù)＞108/ml。選用雌性成熟的家兔，給藥前一天注射苯甲酸求偶索(50mg/只)，24小時(shí)后陰道內(nèi)注入本發(fā)明化合物(不同劑量)混懸液1ml，5分鐘后，注入上述人工陰道法收集到的兔精液0.5ml[原精液]。5～10分鐘耳靜脈注射hCG(絨毛膜促性腺激素)100單位。
對照組家兔陰道內(nèi)注入含有8％DMF的生理鹽水1ml/只，3～5分鐘后注入人工采集的精液0.5ml；5～10分鐘后耳靜脈注射hCG 100單位。
十天后，麻醉情況下剖腹檢查子宮內(nèi)胎兒數(shù)，卵巢黃體數(shù)；最終判斷本發(fā)明化合物在家兔體內(nèi)的抗生育效果。結(jié)果見表3。
表3本發(fā)明化合物家兔體內(nèi)抗生育試驗(yàn)家兔體重 黃體數(shù) 胎兒數(shù) 妊娠組別 ％(No.)(kg) (左右) (左右) (否)對 1 3.6 8(4，4) 8(4，4) +2 3.6 8(4，4) 8(4，4) +3 3.7 5(2，3) 5(2，3) +照4 3.2 6(2，4) 6(2，4) + 100.05 4.2 6(2，4) 6(2，4) +組-----------------------------------------------------X±SD (n＝5) 3.7±0.3 6.7±1.26.7±1.2 5/564.013(8，5)0(0，0) -低 73.358(3，5)1(1，0) +劑 84.0 8(4，4)0(0，0) -量94.212(4，8)0(0，0) -組 28.9(3mg/只)103.56(2，4) 0(0，0) -114.213(5，6)0(0，0) -123.912(4，8)6(2，4) +----------------------------------------------------------X±SD (n＝7) 3.9±0.3 10.3±2.7 1.0±0.1 2/7大 133.413(8，5)0(0，0)-劑 143.615(7，8)0(0，0)-量153.513(7，6)0(0，0)-組 0163.65 7(3，4) 0(0，0)-(6mg/只)173.615(6，9)0(0，0)------------------------------------------------------------X±SD (n＝5)3.6±0.1 12.6±2.9 0 0由表3看出，一次給藥后，對照組家兔5只全部妊娠，平均黃體數(shù)為6.7±1.2，平均胎兒數(shù)為6.7±1.2；本發(fā)明化合物大劑量組(6mg/只)，家兔5只無一只妊娠，平均黃體數(shù)12.6±2.9；本發(fā)明化合物低劑量組(3mg/只)，家兔7只有二只妊娠，妊娠率為28.9％，平均胎兒數(shù)1.0±0.1，黃體數(shù)為10.3±2.7。結(jié)果表明，本發(fā)明化合物具有顯著體內(nèi)抗生育效果。
權(quán)利要求
1.一種抗生育化合物，其為4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
2.權(quán)利要求1所述的抗生育化合物的制備方法，合成路線如下 反應(yīng)步驟為(1)1-脒基-3，5-二甲基吡唑硝酸鹽(I)與對氨基苯甲酸(II)于乙醇中反應(yīng)，反應(yīng)畢堿化，稀鹽酸酸化，得4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)；(2)4-胍基苯甲酸鹽酸鹽(III)與氯化亞砜作用生成4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽，再加入四氫呋喃、三乙胺和4-羥基苯甲酸甲酯(IV)生成4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯鹽酸鹽(V)；(3)4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽(V)于二甲亞砜溶劑中，冰浴下與稀氫氧化鈉作用，得游離4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯，再與甲烷磺酸反應(yīng)得產(chǎn)物4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲?；?苯酯甲烷磺酸鹽(VI)。
3.權(quán)利要求1所述抗生育化合物與輔料組成的抗生育制劑，其特征在于輔料為檸檬酸、檸檬酸鈉、過氧化氫、卡泊浦974p和甘油，配比如下4-胍基苯甲酸(4-甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽 1份檸檬酸5-7份檸檬酸鈉22-26份過氧化氫 4-6份卡伯浦974 0.8-1.2份甘油12-14份。
4.權(quán)利要求1所述抗生育化合物用于制備抗生育制劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是抗生育化合物4－胍基苯甲酸(4－甲氧甲酰基)苯酯甲烷磺酸鹽及其制備方法，以及用其制備的一種抗生育制劑?；衔?－胍基苯甲酸(4－甲氧甲?；?苯酯鹽酸鹽具有抑制頂體酶的活性，但其溶解度小，制備方法繁瑣，得率低。本發(fā)明化合物不僅溶解度大，抑制頂體酶活性高，而且制備方法簡單，得率高，成本低，體外及動物試驗(yàn)表明具有良好的抗生育效果，可用于制備抗生育制劑。
文檔編號A61K31/21GK1438217SQ0311589
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者呂加國, 趙亞南, 周有駿, 朱駒, 紀(jì)亞忠, 張萬年, 崔英, 惠寧, 季海濤, 余建鑫, 劉玉環(huán), 宋云龍, 盛春泉, 章玲, 張俊潔, 徐明娟, 許翠琴, 王賀玲 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)