專利名稱：含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白(Lactoferrin簡稱LF)，1960年從牛乳中分離獲得，它是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，分子量80KDa左右，LF具有轉(zhuǎn)運鐵離子和殺菌抗病毒的功效，它在乳腺中的表達(dá)量最高。其獨特的作用機理引起人們的高度重視，并將其從牛奶中分離純化后加入嬰兒奶粉。全蠶粉營養(yǎng)價值豐富，具有一些特殊的功效，是一種優(yōu)良的蛋白源，但是含有乳鐵蛋白的全蠶粉目前尚無相關(guān)報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉的方法。
本發(fā)明的含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法包括以下步驟1)取泌乳1-21天母畜乳房乳腺腺泡，液氮冷凍研磨成粉末，提取總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到LF-cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白基因特征設(shè)計一對各帶一個酶切位點的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，PCR產(chǎn)物割膠純化后，用引物中對應(yīng)的兩個內(nèi)切酶雙酶切，定向連接入以上兩個酶切過的pGEM-3Z載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，再接種3ml液體LB培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)至少8小時；2)將以上培養(yǎng)的TG-1抽提質(zhì)粒，對應(yīng)雙酶切，割膠回收目的片段，定向克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pVL1393，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF，同時用Bsu36 I酶切野生型桿狀病毒DNA，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑pVL139315.0μl，野生型桿狀病毒DNA 1.0μL，滅菌水10.0μL，lipofectin 14.0μL輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用parafilm密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動使之均勻，27℃感染1小時后，移去接種液，在病毒接種時將3％低熔點瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清的2X TC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時后，選取白斑按上述步驟進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF；4)將純化的重組病毒每頭約106pfu注射5齡起蠶，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)五天后于冰上收集蠶血，加入0.1％苯基硫脲，10000rpm離心10分鐘，取上清，再注射5齡起蠶，106pfu/頭，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)5天，待家蠶發(fā)病后，收集病蠶冷凍干燥，粉碎，制成含乳鐵蛋白的全蠶粉。
LF本身有殺菌抗病毒的作用，在胃中經(jīng)胃蛋白酶降解后的產(chǎn)物L(fēng)fcin的作用更強，它作用機理獨特，不同于傳統(tǒng)的抗生素。本發(fā)明以桿狀病毒為載體，用家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)含乳鐵蛋白的全蠶粉。桿狀病毒只感染無脊椎動物，不能在脊椎動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖，病毒基因組也不可能整合到脊椎動物細(xì)胞染色體上；病毒基因組內(nèi)多角體基因是病毒復(fù)制非必需的且具有強啟動子，提供了外源基因插入的理想場所；晚晚期高效表達(dá)啟動子的使用，對高水平表達(dá)各種外源蛋白(包括毒性蛋白)都不會有影響；翻譯后加工機制完善。因此本發(fā)明生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉的方法產(chǎn)率高，且安全無毒，適宜大批量生產(chǎn)。以此方法生產(chǎn)的含乳鐵蛋白全蠶粉因含有殺菌抗病毒的乳鐵蛋白，因此作為飼料添加劑在補充飼料蛋白的同時可起到抗病防病的作用，而且動物不會產(chǎn)生抗藥性，可部分或全部替代飼料中的抗生素。
具體實施例方式
下面以鼠為例進(jìn)一步說明生產(chǎn)含乳鐵蛋白蠶粉的方法，具體操作步驟如下1.將泌乳15天的小白鼠母鼠引頸致死，摘取乳腺組織即乳腺腺泡50-100毫克，置于事先200℃烘烤并冷卻到室溫的研缽中，加入1/3研缽積液氮，研磨成粉末并將其轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管，加入1ml Trizol液，充分混勻，冰上靜置5分鐘，再加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩混勻后于4℃12000rpm離心30秒，取上層水相于一新的eppendorf管中，加入0.5ml異丙醇，混勻后-20℃靜置30分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用1ml75％乙醇洗滌后室溫干燥，干燥后將沉淀溶于20-100μL無酶水，得到總RNA提取液，將獲得的總RNA提取液用隨機引物在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，所得產(chǎn)物即為cDNA。
設(shè)計合成上下游引物上游引物CCAGGATCCACAGACATGAAGCTGCTCA，下游引物TATGAATTCAGTGTTTTCACTGGGTAAGA，以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR滅菌雙蒸水 33.5μL 94℃ 3分鐘 上下游引物各 1μL 72℃ 10分鐘cDNA 2μLTaq酶 1μLPCR產(chǎn)物全部上樣0.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下割回2.1kb片段，置于1.5mL離心管，加入600μL 6M NaI，37℃水浴使膠融化完全，加入9μLglassmilk混勻，冰浴15分鐘，12000rpm離心5秒，棄上清，450μL 75％冰乙醇洗滌3次，棄上清，至37℃烘箱烘干殘余液體，沉淀溶于50μL 0.1 X TE，12000rpm離心約1分鐘，轉(zhuǎn)上清于一新管，-20℃保存；割膠回收的產(chǎn)物和質(zhì)粒pGEM-Z分別用BamH I和EcoR I酶切，兩酶切產(chǎn)物以4∶1比例加入200μL小離心管用T4 DNA連接酶1μL，5Xligase Buffer1.5μL，15℃連接過夜，以上連接產(chǎn)物5μL轉(zhuǎn)化200μL CaCl2法制備的TG-1感受態(tài)細(xì)胞，加入37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基1mL后置37℃搖床，180rpm振蕩1小時，同時制備篩選培養(yǎng)基，Amp(+)LB固體培養(yǎng)基表面加40μL20mg/ml的X-gal和4μL 200mg/ml的IPTG用無菌玻棒涂布均勻，置37℃培養(yǎng)箱使之吸收，上述菌液4000rpm離心5分鐘，棄去1ml上清，用移液器輕輕吹打混勻后涂布篩選培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時以上，直到出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落，挑白色單菌落于3mL加入5μL Amp的液體LB培養(yǎng)基，抽提質(zhì)粒，用BamH I和EcoR I酶切鑒定重組質(zhì)粒，篩選出陽性克隆接種于3ml LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2.以上陽性克隆測序正確后堿法小量抽提質(zhì)粒，然后用Centricon-100管(Amicon公司)離心除去RNA，測0D260/0D280約為1.8，再用BamHI和EcoR I酶切后連入轉(zhuǎn)移載體pVL1393，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF，pVL1393-LF與經(jīng)Bsu36 I酶切后的HyBacPAK6病毒DNA在lipofectin介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染Bm-N家蠶細(xì)胞，在35mm滅菌培養(yǎng)皿中加入0.5ml生長旺盛期的細(xì)胞，加入0.5ml新鮮培養(yǎng)基TC-100，混勻，前后左右輕輕搖勻，室溫放置1小時，使細(xì)胞貼壁，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑pVL1393 15.0μl(含量1.0μg/μL)；野生型桿狀病毒DNA1.0μL(含量1.0μg/μL) 滅菌水10.0μL，lipofectin 14.0μL輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞吸取培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基。15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，然后用parafilm密封，27℃培養(yǎng)5天。
3.待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動使之均勻。27℃感染1小時后，移去接種液，在病毒接種時將3％低熔點瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的2X TC-100(含20％胎牛血清)快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個病毒斑，感染接種于5X104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時后，選取白斑按上述步驟進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF。
4.將純化的重組病毒HyBacPAK-LF注射5齡起蠶，每頭注射約106pfu，待家蠶發(fā)病后于冰上收集蠶血，加入0.1％苯基硫脲，10000rpm離心10分鐘，取上清，再注射5齡起蠶，106pfu/頭，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)5天收集病蠶，冷凍干燥，粉碎，即得含乳鐵蛋白的全蠶粉。
權(quán)利要求
1.含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法，其特征是包括以下步驟1)取泌乳1-21天母畜乳腺腺泡，液氮冷凍研磨成粉末，提取總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到LF-cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白基因特征設(shè)計一對各帶一個酶切位點的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，PCR產(chǎn)物割膠純化后，用引物中對應(yīng)的兩個內(nèi)切酶雙酶切，定向連接入以上兩個酶切過的pGEM-3Z載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，再接種3ml液體LB培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)至少8小時；2)將以上培養(yǎng)的TG-1抽提質(zhì)粒，對應(yīng)雙酶切，割膠回收目的片段，定向克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pVL1393，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF，同時用Bsu36 I酶切野生型桿狀病毒DNA，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑pVL139315.0μl，野生型桿狀病毒DNA 1.0μL，滅菌水10.0μL，lipofectin 14.0μL輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用parafilm密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動使之均勻，27℃感染1小時后，移去接種液，在病毒接種時將3％低熔點瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清的2X TC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時后，選取白斑按上述步驟進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF；4)將純化的重組病毒每頭約106pfu注射5齡起蠶，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)五天后于冰上收集蠶血，加入0.1％苯基硫脲，10000rpm離心10分鐘，取上清，再注射5齡起蠶，106pfu/頭，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)5天，待家蠶發(fā)病后，收集病蠶冷凍干燥，粉碎，即得含乳鐵蛋白的全蠶粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法，它是以桿狀病毒為載體，用家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉的。應(yīng)用本發(fā)明方法生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉，產(chǎn)率高，在生產(chǎn)和使用過程中對人畜安全無毒，適宜大批量生產(chǎn)和使用。以此方法生產(chǎn)的含乳鐵蛋白全蠶粉因含有殺菌抗病毒的乳鐵蛋白，故作為飼料添加劑在補充飼料蛋白的同時可起到抗病防病的作用，而且動物不會產(chǎn)生抗藥性，可部分或全部替代飼料中的抗生素。
文檔編號A61K35/64GK1437957SQ0311585
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者汪以真, 許梓榮, 黃海青 申請人:浙江大學(xué)