專利名稱：人肝細(xì)胞增殖方法和人肝細(xì)胞的獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)發(fā)明涉及到在小鼠體內(nèi)使人肝細(xì)胞增殖的方法，肝臟內(nèi)含有人肝細(xì)胞的嵌合小鼠，由嵌合小鼠獲取人肝細(xì)胞的方法以及通過該方法獲取的人肝細(xì)胞。由這樣操作從嵌合小鼠得到的人肝細(xì)胞成為肝細(xì)胞試劑盒和體外人工肝臟的材料。
背景技術(shù)：
肝臟具有500多種以上的多種多樣的特異功能。作為肝臟的主要功能如血漿蛋白質(zhì)的合成分泌、通過糖異生和糖原代謝進(jìn)行血糖調(diào)節(jié)、脂質(zhì)合成、尿素合成、膽汁合成分泌、解毒等。
攝入到體內(nèi)的很多物質(zhì)在肝臟中代謝。在醫(yī)藥品開發(fā)的領(lǐng)域中，醫(yī)藥品候補(bǔ)物質(zhì)在肝臟受到什么樣的代謝，對(duì)肝臟和其他臟器或組織有什么樣影響等是必需的資料。另外，到目前為止，很多化學(xué)物質(zhì)被合成也釋放到環(huán)境。闡明這些物質(zhì)每一個(gè)、或復(fù)合后對(duì)人體有什么樣的影響對(duì)于社會(huì)也是非常重要的，對(duì)于這樣的化學(xué)物質(zhì)對(duì)人體的影響的評(píng)價(jià)中也需要對(duì)肝功能的毒性試驗(yàn)。
在以醫(yī)藥品候補(bǔ)物質(zhì)為首的化學(xué)物質(zhì)的安全性試驗(yàn)和藥物代謝試驗(yàn)中，目前可以使用小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。特別在醫(yī)藥品開發(fā)中，在進(jìn)入以人為對(duì)象的第一相試驗(yàn)之前，有義務(wù)使用動(dòng)物進(jìn)行毒性試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)，試驗(yàn)需要大量的時(shí)間和勞力，投資額也巨大。
然而，通過這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的資料不能保證直接可以應(yīng)用于人。事實(shí)上，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中認(rèn)為沒有毒性的物質(zhì)對(duì)人表現(xiàn)出毒性的事例很多，而相反的場(chǎng)合也有。因此，到目前為止，很多醫(yī)藥品候補(bǔ)物質(zhì)在進(jìn)入以人為對(duì)象的第一相試驗(yàn)后處于開發(fā)中止，而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中由于毒性強(qiáng)在進(jìn)入臨床試驗(yàn)前變成開發(fā)中止的物質(zhì)中實(shí)際上認(rèn)為對(duì)人沒有毒性的個(gè)案也存在很多。
人們認(rèn)為這起因于人的肝臟中的代謝功能和小鼠或大鼠的肝臟的代謝功能不同。最近，已經(jīng)可以使用人肝細(xì)胞進(jìn)行體外代謝試驗(yàn)或毒性試驗(yàn)了?？墒牵瑥耐ㄟ^不能用于移植的腦死亡患者的肝臟或腫瘤摘出等的切除肝得到的人肝細(xì)胞的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于需要。因此，人肝細(xì)胞的增殖技術(shù)的開發(fā)在醫(yī)藥品開發(fā)中非常必要。
而大量的人肝細(xì)胞的必要性在體外型人工肝臟中也同樣。人工肝臟是通過人工方式代行肝臟功能的醫(yī)療裝置，將吸附、透析、過濾等依據(jù)物理化學(xué)原理的人工作用和通過摘出肝或肝組織的灌流產(chǎn)生的生物學(xué)作用組合的混合型人工肝臟的開發(fā)正全力進(jìn)行著。在進(jìn)行這樣的人工肝臟開發(fā)時(shí)，在用于使物理化學(xué)方面的功能提高的膜或回路的性能提高的同時(shí)，可適用于人的大量肝細(xì)胞的供給是不可缺的。
然而，人的肝細(xì)胞到目前為止一直認(rèn)為對(duì)成熟個(gè)體分離的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)是不可能的。即，因?yàn)閷?duì)于粘附依賴性的成熟肝細(xì)胞，為了進(jìn)行該細(xì)胞的傳代操作從培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行剝離時(shí)會(huì)造成很大損傷，再使他粘附培養(yǎng)基質(zhì)更困難。與此相反，本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)明了從由人肝臟分離的正常肝細(xì)胞分離具有克隆性的增殖能力的小型肝細(xì)胞，對(duì)該小型肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，再將該培養(yǎng)肝細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)之后使肝細(xì)胞增殖的方法，獲得了專利(特開平08-112092號(hào)公報(bào)；日本專利第3266766號(hào)；美國(guó)專利第6,004,810號(hào)、特開平10-179148號(hào)公報(bào)；日本專利第3211941號(hào)、特開平7-274951公報(bào)；日本專利第3157984號(hào)、特開平9-313172號(hào)公報(bào)；日本專利第3014322號(hào))。
該專利發(fā)明的方法是提供用于在體外使肝細(xì)胞增殖，得到大量人肝細(xì)胞的新的手段的方法，但存在著在長(zhǎng)期的傳代培養(yǎng)中幾種肝功能下降的問題。由于這一原因，雖然作為例如維持肝功能的藥劑的篩選體系，或就長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后仍保存的特定功能進(jìn)行藥劑的毒性或藥效進(jìn)行試驗(yàn)的體系是有用的，但作為代替人肝功能的肝細(xì)胞，或作為混合型人工肝臟的材料還存在不充分的地方。
作為用于消除在體外的肝細(xì)胞增殖中的上述那樣問題的手段，有人提出了在動(dòng)物個(gè)體內(nèi)(in vivo)使肝細(xì)胞增殖的方法。
例如，Heckel等人制作了清蛋白尿激酶型纖溶酶激活物轉(zhuǎn)基因小鼠(uPA-Tg小鼠)。在該小鼠中，尿激酶型纖溶酶激活物(uPA)基因與清蛋白的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子連接，合成對(duì)肝臟特異作用的uPA蛋白(HeckelJL，Sandgren EP，Degen JL，Palmiter RD，and Brinser RL.Neonatalbleeding in transgenic mice expressing urokinase-typeplasminogen activator.Cell 62447-456，1990)。肝細(xì)胞被uPA損傷，肉眼看呈白色，也觀察到由于出血或肝衰竭而死亡的個(gè)體。如果從該小鼠的脾臟移植lac轉(zhuǎn)基因小鼠的正常肝細(xì)胞，可知在肝臟活存和增殖，最終被供體肝細(xì)胞置換(Rhim JA，Sandgren EP，Degen JL，PalmiterRD，and Brinster RL.Replacement of diseased mouse liver by hepaticcell transplantation.Science 2631149-1152，1994)。另外，Rhim等人使uPA-Tg小鼠和由于先天缺損胸腺而不具有T細(xì)胞功能的NUDE小鼠交配，制作uPA-Tg/NUDE小鼠。通過向uPA-Tg/NUDE小鼠移植大鼠的肝細(xì)胞，制作帶有大鼠肝細(xì)胞的小鼠(Rhim JA，Sandgren EP，PalmiterRD and Brinster RL.Complete reconstitution of mouse liver withxenogeneic hepatocytes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924942-4946，1995)。然而，使用該小鼠的帶有人肝細(xì)胞的嵌合小鼠的報(bào)告還沒有。
Dandri等人使uPA-Tg小鼠和具有免疫缺陷性質(zhì)的敲除小鼠Rag2小鼠交配，制作uPA-Tg/Rag2小鼠。向uPA-Tg(+/-)/Rag2小鼠移植由人肝臟採(cǎi)取的人肝細(xì)胞，顯示出小鼠肝臟的15％被置換。他們成功地使B型肝炎病毒感染了該小鼠(Dandri M，Burda MR，Torok B，PollokJM，Iwanska A，Sommer G，Rogiers X，Rogler CE，Gupta S，Will H，GretenH，and Petersen J.Repopulation of mouse liver with humanhepatocytes and in vivo infection with hepatitis Bvirus.Hepatology 33981-988，2001)。
另外，本申請(qǐng)發(fā)明人公布了在先前專利申請(qǐng)的發(fā)明(特開2002-45087號(hào)公報(bào))中，向作為免疫缺陷小鼠的SCID小鼠與uPA-Tg交配得到的uPA-Tg/SCID小鼠移植人肝細(xì)胞，該移植肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)上承擔(dān)著小鼠的肝功能的嵌合小鼠。先前申請(qǐng)發(fā)明的嵌合小鼠由于通過uPA基因的表達(dá)造成小鼠肝細(xì)胞功能缺陷，所以該肝功能被移植的人肝細(xì)胞保持。因此，可以正確評(píng)價(jià)移植的人肝細(xì)胞的個(gè)體內(nèi)功能，作為用于對(duì)被檢測(cè)物質(zhì)的毒性和藥效進(jìn)行判定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體是非常有用的。然而，對(duì)于先前申請(qǐng)發(fā)明的嵌合小鼠，人肝細(xì)胞移植后不能生存50天以上，另外由于在成長(zhǎng)過程中正?；男∈蟾渭?xì)胞增殖，移植人肝細(xì)胞的增殖效率低，人肝細(xì)胞的置換率停止在約50％程度。
這種現(xiàn)象也可以通過最近的Mercer等人的報(bào)告(MercerDF，Schiller DE，Eliiott JF，Douglus DF，Hao C，Ricnfret A，AddisonWR，F(xiàn)ischer KP，Churchill TA，Lakey JRT，Tyrrell DLJ and KetemanNM.Hepatits C virus replication in mice with chimeric humanlivers.Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and invivo infection with hepatitis B virus.Nature Medicine7927-933，2001)證實(shí)。Mercer等人報(bào)告了與本申請(qǐng)發(fā)明人同樣制作uPA-Tg/SCID，將冷凍保存的人肝細(xì)胞融解后進(jìn)行移植，結(jié)果在小鼠血清中檢測(cè)到2mg/ml以下的人清蛋白 (換算成血液中約1mg/ml以下)，約50％肝臟被人肝細(xì)胞置換。
如上所述，將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠(uPA-Tg/SCID小鼠)，制作嵌合小鼠雖然在該嵌合小鼠本身中存在有用性(例如，對(duì)人肝細(xì)胞的毒性和藥效的體內(nèi)試驗(yàn)等)，但作為用于在小鼠個(gè)體內(nèi)使移植肝細(xì)胞大量增殖的手段并不充分。
另外，由于移植了人肝細(xì)胞的嵌合小鼠不能長(zhǎng)期生存，而且在成長(zhǎng)過程中小鼠肝細(xì)胞增殖，作為對(duì)人肝細(xì)胞的毒性和藥效的體內(nèi)評(píng)價(jià)體系其利用對(duì)象被限定。
本申請(qǐng)發(fā)明作為課題提供用于在體內(nèi)使人肝細(xì)胞充分增殖的改良方法作為人肝細(xì)胞的增殖方法。
另外作為課題也提供對(duì)通過長(zhǎng)期生存在小鼠體內(nèi)增殖的人肝細(xì)胞進(jìn)行分離、回收的方法。
另外，作為課題還提供通過將分離的人肝細(xì)胞移植到許多小鼠中，在小鼠體內(nèi)使人肝細(xì)胞增殖，可以大量獲取在體內(nèi)保持一定規(guī)格的人肝細(xì)胞的嵌合小鼠，可以大量獲取從該小鼠中分離的一定規(guī)格的人肝細(xì)胞的方法。
另外，作為課題提供分離的肝細(xì)胞的利用方法。
另外，本申請(qǐng)作為課題也提供用于實(shí)施上述各個(gè)發(fā)明的單克隆抗體以及產(chǎn)生該單克隆抗體的新的雜交瘤細(xì)胞株。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)作為解決上述課題的第1發(fā)明提供一種人肝細(xì)胞增殖方法，其特征是通過將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下，對(duì)人肝細(xì)胞移植小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，使移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中增殖。
在第1發(fā)明的方法中，其中防御來自人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)作為優(yōu)選狀態(tài)至少是以下的(a)和(b)中一種狀態(tài)。
(a)至少投給人肝細(xì)胞移植小鼠1次補(bǔ)體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠，使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(decayaccelerating factor)(DAF/CD55)轉(zhuǎn)基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
在第1發(fā)明的方法中，作為優(yōu)選的狀態(tài)，其中免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配后得到的后代小鼠。另外，作為各個(gè)優(yōu)選狀態(tài)，后代小鼠是半合子免疫缺陷肝損傷小鼠，而且在將肝細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)投給半合子免疫缺陷肝損傷小鼠后，進(jìn)行人肝細(xì)胞移植。
在第1發(fā)明的方法中以及其優(yōu)選的狀態(tài)中，作為另外的一種優(yōu)選狀態(tài)是將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細(xì)胞的免疫缺陷肝損傷小鼠。
在第1發(fā)明的方法中，也可以將移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝細(xì)胞是增殖性人肝細(xì)胞，其增殖性人肝細(xì)胞是被特異識(shí)別形成集落增殖的人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的人肝細(xì)胞，而且單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體作為各自的優(yōu)選狀態(tài)。
作為第2發(fā)明，本申請(qǐng)?zhí)峁┤烁渭?xì)胞大量增殖方法，其特征是由以下步驟(1)～(3)構(gòu)成，并且將步驟(2)和(3)重復(fù)一次以上。
(1)通過將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下對(duì)人肝細(xì)胞移植小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，使移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中增殖的步驟；(2)從小鼠肝臟分離增殖的人肝細(xì)胞的步驟；以及(3)將分離的人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下將人肝細(xì)胞移植小鼠飼養(yǎng)50天以上的步驟。
在該第2發(fā)明的方法中，作為優(yōu)選的狀態(tài)是在步驟(1)和/或步驟(3)中防御來自人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)至少是以下的(a)和(b)中的一種狀態(tài)。
(a)至少投給人肝細(xì)胞移植小鼠一次補(bǔ)體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(DAF/CD55)轉(zhuǎn)基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
在該第2發(fā)明的方法中，作為各個(gè)優(yōu)選的狀態(tài)是在步驟(1)和/或步驟(3)中，免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配得到的后代小鼠，后代小鼠是半合體免疫缺陷肝損傷小鼠，而且將肝細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)投給半合體免疫缺陷肝損傷小鼠后，進(jìn)行肝細(xì)胞移植，在該第2發(fā)明的方法以及上述的優(yōu)選狀態(tài)中，在步驟(1)和/或步驟(3)中，也可以將抗Fas抗體投給移植了人肝細(xì)胞的免疫缺陷肝損傷小鼠作為另一種理想狀態(tài)。
另外，在該第2發(fā)明的方法中，各個(gè)優(yōu)選的狀態(tài)是在步驟(1)和/或步驟(3)中向免疫缺陷肝損傷小鼠進(jìn)行移植的人肝細(xì)胞是增殖性人肝細(xì)胞，增殖性人肝細(xì)胞是被特異識(shí)別形成集落增殖的人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的人肝細(xì)胞，而單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
在該第2發(fā)明的方法中，更為優(yōu)選的狀態(tài)是通過在步驟(2)中至少進(jìn)行以下的(a)和(b)(a)對(duì)從小鼠肝臟分離的肝臟組織進(jìn)行膠原酶處理，以及(b)對(duì)被不識(shí)別非人肝細(xì)胞，特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞進(jìn)行分離，中的一種操作，實(shí)質(zhì)上只分離人肝細(xì)胞。而在該狀態(tài)中單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產(chǎn)生的單克隆抗體。
作為第3發(fā)明，本申請(qǐng)?zhí)峁┰诟闻K內(nèi)含有通過上述第1發(fā)明或第2發(fā)明的方法增殖的人肝細(xì)胞的嵌合小鼠。
該第3發(fā)明的嵌合小鼠優(yōu)選的狀態(tài)是增殖的人肝細(xì)胞占肝臟內(nèi)細(xì)胞的70％以上，和/或具有人型P450活性。
作為第4發(fā)明，本申請(qǐng)還提供人肝細(xì)胞獲取方法，其特征是從上述第3發(fā)明的嵌合小鼠的肝臟分離人肝細(xì)胞。
在第4發(fā)明的方法中，更為優(yōu)選的狀態(tài)是至少進(jìn)行以下的(a)和(b)(a)對(duì)從小鼠肝臟分離的肝臟組織進(jìn)行膠原酶處理，以及(b)對(duì)被不識(shí)別非人肝細(xì)胞，特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞進(jìn)行分離，中的一種操作，實(shí)質(zhì)上只分離人肝細(xì)胞。而且在該狀態(tài)下單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產(chǎn)生的單克隆抗體。
作為第5發(fā)明，本申請(qǐng)還提供通過第4發(fā)明的方法獲取的人肝細(xì)胞。
另外，作為第6發(fā)明，本申請(qǐng)還提供含有上述第5發(fā)明的人肝細(xì)胞的細(xì)胞試劑盒。
另外，作為第7發(fā)明，本申請(qǐng)還提供充填了上述第5發(fā)明的人肝細(xì)胞的混合型人工肝臟。
另外，作為第8發(fā)明，本申請(qǐng)還提供一種不識(shí)別非人肝細(xì)胞，特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體。該第8發(fā)明的一個(gè)例子是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產(chǎn)生的單克隆抗體。
作為第9發(fā)明，本申請(qǐng)還提供將候補(bǔ)物質(zhì)全身投給上述第3發(fā)明的嵌合小鼠，試驗(yàn)候補(bǔ)物質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)或毒性的方法。
以上各發(fā)明中的狀態(tài)和用語(yǔ)、概念在發(fā)明的實(shí)施方式的說明和實(shí)施例中有詳細(xì)的規(guī)定。另外為了實(shí)施本發(fā)明使用的各種各樣的技術(shù)，除了明確給出其資料的技術(shù)外，只要是同行，根據(jù)眾所周知的文獻(xiàn)都可以容易而且確實(shí)地實(shí)施。例如，本發(fā)明的基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)在Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989；Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等有記載。
附圖的簡(jiǎn)單說明

圖1是補(bǔ)體抑制劑對(duì)人血清清蛋白濃度的效果的試驗(yàn)結(jié)果。
圖2是對(duì)分別移植了人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和小型肝細(xì)胞的小鼠的血中清蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。
圖3是補(bǔ)體抑制劑對(duì)小鼠體重的效果的試驗(yàn)結(jié)果。
圖4是將補(bǔ)體抑制劑投給或不投給嵌合小鼠時(shí)人補(bǔ)體(hC3a)濃度的比較。
圖5是表示小鼠血中人清蛋白濃度和被人肝細(xì)胞置換的置換率和功能的相關(guān)性的曲線圖。
圖6是利用人特異的細(xì)胞角蛋白8/18抗體染色后的免疫染色圖。
圖7是利用人特異的細(xì)胞角蛋白8/18抗體進(jìn)行免疫染色的放大圖。
圖8是移植了人肝細(xì)胞的小鼠肝臟微粒體中人特異的CYP2CP的Western blot分析結(jié)果。
圖9是表示小鼠和供體肝臟的微粒體中的雙氯酚酸鈉的代謝活性的圖。
圖10是表示各種各樣的人肝細(xì)胞置換率的嵌合小鼠肝臟、以及投給了利福平的嵌合小鼠肝臟中的6種人型P450分子的表達(dá)量的圖。
圖11是對(duì)進(jìn)行再移植人肝細(xì)胞的小鼠血中人清蛋白濃度進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
圖12是將倒千里光堿投給uPA(+/+)SCID小鼠的效果的試驗(yàn)結(jié)果。
圖13是對(duì)將抗小鼠Fas抗體投給人肝細(xì)胞嵌合小鼠后的小鼠血中的人清蛋白進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果。
圖14是對(duì)各種各樣年齡患者採(cǎi)取的肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的增殖曲線。
圖15是為了制作單克隆抗體，作為抗原使用的培養(yǎng)人肝細(xì)胞的相差顯微鏡照片。
圖16是通過熒光抗體觀察雜交瘤培養(yǎng)上清(K8223)在人肝細(xì)胞中的反應(yīng)性的照片。
圖17是通過FACS對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清(No.23)在人肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析的結(jié)果。
圖18是對(duì)與雜交瘤培養(yǎng)上清(No.23)反應(yīng)的細(xì)胞集團(tuán)(R2)和不反應(yīng)的細(xì)胞集團(tuán)(R3)分類收集、培養(yǎng)時(shí)的相差顯微鏡照片。
圖19是通過FACS對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清(No.23)在傳代培養(yǎng)人肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析的結(jié)果。
圖20是通過FACS對(duì)雜交瘤培養(yǎng)上清(K8216)在剛分離后的人、小鼠、大鼠肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
第1發(fā)明的人肝細(xì)胞增殖方法，其特征是通過將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下，對(duì)人肝細(xì)胞移植小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，使移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中增殖。
上述的Mercer等人(Nature Medicine 7927-933，2001)報(bào)道了制作免疫缺陷肝損傷小鼠(uPA-Tg/SCID小鼠)，將冷凍保存的人肝細(xì)胞融解后移植到小鼠中，結(jié)果肝臟的50％左右細(xì)胞被人肝細(xì)胞置換。然而，Mercer等人制作的人肝細(xì)胞移植小鼠不能達(dá)到移植的人肝細(xì)胞的高置換率。
第1發(fā)明的方法通過防止移植的人肝細(xì)胞制造的補(bǔ)體攻擊小鼠本體，可以使人肝細(xì)胞移植小鼠存活50天以上。而且由于使小鼠存活50天以上，可以使小鼠肝臟細(xì)胞70％以上置換為人肝細(xì)胞。
用于防御來自人補(bǔ)體對(duì)接受移植的小鼠的攻擊的第1具體手段是給該小鼠注射「補(bǔ)體抑制劑」。作為補(bǔ)體抑制劑可以使用nafamostatmesilate(フサンR；鳥居制藥)、gabexate mesilate(FOYR；小野制藥)、comostat mesilate(フオイパンR；小野制藥)、眼鏡蛇毒因子等。另外，這些補(bǔ)體抑制劑是小鼠在細(xì)胞移植或臟器移植時(shí)使用的藥劑。但是，在通常移植手術(shù)中，補(bǔ)體抑制劑可以用于防御接受移植的肝臟產(chǎn)生的補(bǔ)體對(duì)移植細(xì)胞或移植臟器的攻擊。另外，在本發(fā)明中，由于接受移植小鼠因肝損傷，本身不能產(chǎn)生補(bǔ)體，所以補(bǔ)體抑制劑可以用于防御移植的人肝細(xì)胞產(chǎn)生的補(bǔ)體對(duì)接受移植的小鼠進(jìn)行攻擊。
用于防御來自人補(bǔ)體對(duì)接受移植的小鼠的攻擊的第2具體手段是作為接受移植的小鼠，使用免疫缺陷肝損傷小鼠和人衰變加速因子(hDAF/CD55)轉(zhuǎn)基因小鼠交配后得到的后代小鼠。有報(bào)道hDAF/CD55轉(zhuǎn)基因小鼠在腎臟、心臟、肺、肝臟等內(nèi)皮細(xì)胞表面高效表達(dá)hDAF，對(duì)人補(bǔ)體具有抗性能力。(Murakami H，Takahagi Y，Yoshitatsu M，Miyagawa S，F(xiàn)ujimura T，Toyomura K，Shigehisa.T，Shirakura R，and Kinoshita T.Porcine MCP gene promoterdirects high level expression of human DAF(CD55)in transgenic mice.Immunobiology，201583-597，1999/2000；van Denderen BJW，PearseMJ，Katerelos M，Nottle MB，Du Z-T，Aminian A，Adam WR，Shenoy-Scaria A，Lublin DM，Shinkel TA，and D′Apice AJF.Expression offunctional decay-accelerating factor(CD55)in transgenic mice protectsagainst human complement-mediated attack.Transplantation，61582-588，1996)。
因此，作為hDAF/CD55轉(zhuǎn)基因小鼠和免疫缺陷肝損傷小鼠的后代動(dòng)物的接受移植小鼠對(duì)于移植人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體有很高的抗性能力。hDAF/CD55轉(zhuǎn)基因小鼠可以根據(jù)上述文獻(xiàn)(Immunobiology，201583-597，1999/2000和Transplantation，61582-588，1996)，使用例如在廣泛的各種各樣組織、器官中表達(dá)的膜輔因子蛋白(MCP)或H2K(b)(MHC class I)的啟動(dòng)子調(diào)控下hDAF可以表達(dá)那樣構(gòu)建的載體，通過眾所周知的轉(zhuǎn)基因小鼠制作方法(例如，Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)進(jìn)行制作。
在第1發(fā)明的人肝細(xì)胞增殖方法中使用的「免疫缺陷肝損傷小鼠」是本來的肝細(xì)胞受到損傷的「免疫缺陷肝損傷小鼠」，而且是對(duì)來自異種動(dòng)物的細(xì)胞不表現(xiàn)出排斥反應(yīng)的「免疫缺陷小鼠」。因此，免疫缺陷肝損傷小鼠可以通過對(duì)同一個(gè)小鼠實(shí)施肝損傷誘發(fā)處置和免疫缺陷處置制作。肝損傷誘發(fā)處置可以通過例如眾所周知的肝損傷誘發(fā)物質(zhì)(例如，四氯化碳、D-半乳糖胺、2-乙酰氨芴、焦精[染料]生物堿等)進(jìn)行處理，或外科的肝切除等。而作為免疫缺陷處置，是投給免疫抑制劑或摘出胸腺等。
但在第1發(fā)明的方法中，作為優(yōu)選狀態(tài)小鼠，使用具有遺傳性肝損傷的小鼠和遺傳性免疫缺陷小鼠交配后作為后代個(gè)體得到的免疫缺陷肝損傷小鼠。作為遺傳性肝損傷小鼠例如上述Rhim等人(Science，263，1149(1994))作成的uPA-Tg小鼠?；蛘呤褂檬垢螕p傷發(fā)生的基因(例如，組織型纖溶酶原激活物基因等)，通過眾所周知的轉(zhuǎn)基因法(Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)也可以制作轉(zhuǎn)基因免疫缺陷肝損傷小鼠。另外，通過眾所周知的基因?qū)ぐ蟹?Science，244，1288-1292，1989)敲除承擔(dān)肝功能的基因，也可以得到基因遺傳性肝損傷的小鼠。另外，作為遺傳性免疫缺陷小鼠可以使用SCID小鼠、NUDE小鼠、RAG2敲除小鼠等眾所周知的小鼠。以下將這樣得到的小鼠記為「遺傳性免疫缺陷肝損傷小鼠」。
遺傳性免疫缺陷肝損傷小鼠優(yōu)選使用肝損傷基因是純合體的小鼠。這樣的純合小鼠由于正常的肝細(xì)胞幾乎不增殖，小鼠肝細(xì)胞不妨礙人肝細(xì)胞的增殖。但是，這樣的純合小鼠在使半合體之間交配時(shí)概率上只得到1/4的比例。
另外，肝損傷基因?yàn)榘牒象w的遺傳性免疫缺陷肝損傷小鼠(「半合體免疫缺陷肝損傷小鼠」)由于在使半合體之間交配時(shí)，或半合體和SCID小鼠交配時(shí)可以得到的概率為1/2，所以第1發(fā)明可以低成本實(shí)施。然而，半合體免疫缺陷肝損傷小鼠由于二倍體染色體的一方的基因是正常的，所以由于肝損傷基因的缺失使得正常肝細(xì)胞可形成集落，進(jìn)行增殖，出生后7周時(shí)小鼠肝臟就被正常的小鼠肝細(xì)胞占據(jù)了。所以一般來說，半合體免疫缺陷肝損傷小鼠作為用于使人肝細(xì)胞增殖的接受移植小鼠是不合適的。因此，作為該第1發(fā)明的優(yōu)選狀態(tài)，在向半合體免疫缺陷肝損傷小鼠移植人肝細(xì)胞之前，投給特異抑制肝細(xì)胞增殖的物質(zhì)，預(yù)防正?；∈蟾渭?xì)胞增殖后形成集落。作為肝細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)如作為雙吡咯烷(類)生物堿的一種的倒千里光堿、毛果天芥菜堿、千里光菲靈、單野百合堿、毛束草堿等。
在第1發(fā)明的方法中，移植中使用的人肝細(xì)胞可以使用通過常規(guī)方法從正常的人肝組織分離的人肝細(xì)胞。在第1發(fā)明的方法中，作為優(yōu)選的狀態(tài)使用在體內(nèi)具有特別活躍增殖能力的增殖性肝細(xì)胞。而在本發(fā)明中所謂的「增殖性人肝細(xì)胞」指的是在培養(yǎng)條件下(in vitro)，形成單一細(xì)胞種集團(tuán)的集落，進(jìn)行增殖可以使集落增大的人肝細(xì)胞。另外，其增殖在集落構(gòu)成細(xì)胞是單一種這一點(diǎn)上有時(shí)也稱之為「克隆性增殖」。另外，這樣的細(xì)胞是通過傳代培養(yǎng)可以進(jìn)一步增加細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞。
這樣的增殖性人肝細(xì)胞作為一個(gè)例子可以使用本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)明的人小型肝細(xì)胞。即本申請(qǐng)發(fā)明人在大鼠或人的肝臟中發(fā)現(xiàn)了增殖能力高的小型肝細(xì)胞，已經(jīng)申請(qǐng)了專利(特開平08-112092號(hào)公報(bào)；日本專利第3266766號(hào)；美國(guó)專利第6,004,810號(hào)、特開平10-179148號(hào)公報(bào)；日本專利第3211941號(hào)、特開平7-274951公報(bào)；日本專利第3157984號(hào)、特開平9-313172號(hào)公報(bào)；日本專利第3014322號(hào))。另外相關(guān)的論文也已經(jīng)發(fā)表(Chise Tateno，and Katsutoshi YoshizatoGrowth and differentiation in culture ofclonogenic hepatocytes that express both phenotypes of hepatocytes andbiliary epithelial cells.American Journal of Pathology 1491593-1605，1996.Hiroshi Hino，Chise Tateno，Hajime Sato，Chihiro Yamasaki，Shigeru Katayama，Toshihiko Kohashi，Akio Aratani，Toshimasa Asahara，Kiyohiko Dohi，and Katsutoshi YoshizatoA long-term culture of humanhepatocytes which show a high growth potential and express theirdifferentiated phenotypes.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 256184-191，1999.Chise Tateno，Kaori Takai-Kajihara，Chihiro Yamasaki，Hajime Sato，and Katsutoshi YoshizatoHeterogeneity of growth potential of adult rat hepatocytes in vitro.Hepatology 3165-74，2000.Shigeru Katayama，Chise Tateno，Toshimasa Asahara，and Katsutoshi YoshizatoSize-dependent in vivogrowth potential of adult rat hepatocytes.American Journal of Pathology15897-105，2001.)。
該人小型肝細(xì)胞由于其優(yōu)越的增殖能力，可以在接受移植者的體內(nèi)急速增殖，在短時(shí)間內(nèi)可以形成能夠發(fā)揮正常肝功能的人肝細(xì)胞集團(tuán)。
這樣的小型肝細(xì)胞的採(cǎi)取除了使用上述以前申請(qǐng)發(fā)明記載的那樣的離心分離的方法之外，也可以通過淘析器或FACS等細(xì)胞分級(jí)裝置採(cǎi)取。另外，也可以通過特異識(shí)別形成集落進(jìn)行增殖的肝細(xì)胞的單克隆抗體採(cǎi)取。無(wú)論是在體外(in vitro)增殖的人肝細(xì)胞、冷凍保存肝細(xì)胞、通過端粒末端轉(zhuǎn)移酶基因等的導(dǎo)入存活的肝細(xì)胞、使這些肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞混合后的細(xì)胞都可以。
增殖性人肝細(xì)胞的其他例子是通過特異識(shí)別增殖性人肝細(xì)胞的單克隆抗體(實(shí)施例6)識(shí)別的人肝細(xì)胞。這樣的單克隆抗體識(shí)別的增殖性人肝細(xì)胞根據(jù)對(duì)抗體的標(biāo)記，可以通過眾所周知的EIA、RIA、熒光抗體法等以高純度獲取。具體來說，例如使酶、放射性同位素、磁珠、或熒光色素等標(biāo)記的單克隆抗體接觸由人肝臟分離的肝細(xì)胞集團(tuán)，通過分離發(fā)出標(biāo)記信號(hào)的細(xì)胞進(jìn)行。作為標(biāo)記使用的酶只要滿足轉(zhuǎn)換數(shù)大、與抗體結(jié)合也穩(wěn)定、使底物特異著色等條件的酶，沒有特別限制，通常的EIA中使用的酶，例如可以使用過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。另外也可以使用酶抑制物質(zhì)或輔酶等。這些酶和抗體結(jié)合可以通過使用馬來酰亞胺化合物等架橋劑的眾所周知的方法進(jìn)行。作為底物可以根據(jù)使用的酶的種類使用眾所周知的物質(zhì)。例如作為酶使用過氧化物酶時(shí)，可以使用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，而作為酶使用堿性磷酸酶時(shí)，可以使用對(duì)硝基苯酚等。作為放射性同位素可以使用125I或3H等通常RIA中使用的同位素。作為熒光色素可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)或四甲基羅丹明熒光素(TRITC)等通常在熒光抗體法中使用的熒光色素。另外，標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)在使用酶時(shí)加由于酶分解作用而發(fā)色的底物，通過對(duì)底物的分解量進(jìn)行光學(xué)測(cè)定，求酶活性，將其換算為結(jié)合抗體量，從與標(biāo)準(zhǔn)值的比較可以算出抗體量。使用放射性同位素時(shí)，通過閃爍掃描計(jì)數(shù)器等測(cè)定放射性同位素發(fā)出的放射線量。而在使用熒光色素時(shí)，可以通過組合了熒光顯微鏡的測(cè)定裝置測(cè)定熒光量。
在將象上述那樣的人肝細(xì)胞、特別是增殖性人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠時(shí)，就象實(shí)施例所表示的那樣，可以經(jīng)由小鼠的脾臟移植到肝臟。另外，也可以由門靜脈進(jìn)行移植。移植的人肝細(xì)胞的數(shù)目可以是1～10000個(gè)程度。
另外在第1發(fā)明的方法中作為優(yōu)選的狀態(tài)之一是將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細(xì)胞的小鼠。抗小鼠Fas抗體與小鼠肝細(xì)胞的Fas抗原反應(yīng)，具有誘導(dǎo)凋亡的作用。通過將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細(xì)胞的小鼠，小鼠的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，死掉。該抗體由于對(duì)人肝細(xì)胞沒有影響，所以可以有選擇地只增殖移植了的人肝細(xì)胞。通過該方法可以使小鼠肝臟中被人肝細(xì)胞置換的置換率進(jìn)一步上升。
以下就第2發(fā)明的人肝細(xì)胞大量增殖方法進(jìn)行說明。
第2發(fā)明的方法，其特征是進(jìn)行以下步驟(1)～(3)。
步驟(1)與第1發(fā)明的方法同樣進(jìn)行，使人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中增殖。
步驟(2)對(duì)在小鼠肝臟內(nèi)增殖的人肝細(xì)胞進(jìn)行分離。
步驟(3)將分離的人肝細(xì)胞分別移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，與第1發(fā)明的方法同樣使人肝細(xì)胞增殖。
而且，該第2發(fā)明的方法將上述步驟(2)和(3)重復(fù)1次以上。即在步驟(1)中，移植到1只小鼠的人肝細(xì)胞在該小鼠肝臟內(nèi)增加到約100倍。因此，在步驟(2)中如果全部回收增殖的人肝細(xì)胞，那么在步驟(3)中從原理上講可以向100只小鼠移植人肝細(xì)胞，最終可以回收最初移植的人肝細(xì)胞的100×100倍的人肝細(xì)胞。另外通過將步驟(2)和(3)反復(fù)進(jìn)行2次，可以回收最初移植的人肝細(xì)胞的100×100×100倍的人肝細(xì)胞。
在該第2發(fā)明的方法中，可以與上述第1發(fā)明方法和其優(yōu)選狀態(tài)方法同樣操作進(jìn)行步驟(1)和/或步驟(3)。這里所謂「和/或」指的是對(duì)于上述第1發(fā)明方法中的一個(gè)要素可以只在步驟(1)進(jìn)行，也可以只在步驟(3)進(jìn)行，或者也可以在步驟(1)和步驟(3)兩方中進(jìn)行。例如，在步驟(1)中，將上述的單克隆抗體(第8發(fā)明)識(shí)別的增殖性肝細(xì)胞移植到小鼠中，也可以將在步驟(3)中回收的人肝細(xì)胞的全部用于移植。上述第1發(fā)明中各個(gè)要素可以根據(jù)使人肝細(xì)胞增殖的小鼠個(gè)體、或從小鼠回收的人肝細(xì)胞的用途等適當(dāng)選擇。
第2發(fā)明的步驟(2)是從小鼠肝臟分離在步驟(1)[反復(fù)進(jìn)行步驟(2)和(3)時(shí)，其前面的步驟]中增殖的人肝細(xì)胞的步驟。分離方法可以采用各種各樣的方法(例如，膠原酶灌流法)，優(yōu)選是至少采用以下方法(a)和(b)中的一種方法進(jìn)行。
方法(a)通過對(duì)從小鼠肝臟分離的肝臟組織進(jìn)行膠原酶處理，實(shí)質(zhì)上只回收人肝細(xì)胞。由于膠原酶的細(xì)胞毒性對(duì)小鼠肝細(xì)胞比對(duì)人肝細(xì)胞更高，所以通過調(diào)節(jié)膠原酶的消化時(shí)間可以造成肝細(xì)胞損傷，也可以只收獲人肝細(xì)胞。膠原酶處理的時(shí)間也因人肝細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞的比例不同而不同，例如人肝細(xì)胞在70％以上時(shí)，可以進(jìn)行8～20分鐘程度的處理。
方法(b)通過對(duì)被不識(shí)別非人肝細(xì)胞，特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞進(jìn)行分離，可以回收純度高的人肝細(xì)胞。作為這樣的單克隆抗體例如小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM P-18751)產(chǎn)生的單克隆抗體。
本申請(qǐng)的第3發(fā)明是在肝臟內(nèi)含有通過上述第1發(fā)明或第2發(fā)明的方法增殖的人肝細(xì)胞的「嵌合小鼠」。該嵌合小鼠優(yōu)選是從人肝細(xì)胞移植后生存50天以上，更優(yōu)選的是生存70天以上的嵌合小鼠。另外，該嵌合小鼠鼠肝臟的70％以上、優(yōu)選是90％以上、更優(yōu)選的是98％以上被人肝細(xì)胞占據(jù)的小鼠。另外該嵌合小鼠是具有人細(xì)胞色素P450活性的小鼠。即，人型P450存在著CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等數(shù)十種的分子種類，本發(fā)明的嵌合小鼠的特征之一是這些人型P450與各個(gè)人肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)上同等程度地進(jìn)行表達(dá)。細(xì)胞色素P450是肝臟中與外源性化學(xué)物質(zhì)代謝等有關(guān)的蛋白質(zhì)，表達(dá)人型P450的小鼠肝臟與人肝臟實(shí)質(zhì)上同樣對(duì)化學(xué)物質(zhì)等進(jìn)行代謝。因此，這個(gè)第3發(fā)明的嵌合小鼠使得試驗(yàn)例如藥劑的藥效和毒性對(duì)人肝細(xì)胞的影響的方法(第9發(fā)明)成為可能。而這樣的嵌合小鼠的利用可以參照本申請(qǐng)發(fā)明人等先前提出的發(fā)明(特開2002-45087號(hào)公報(bào)嵌合動(dòng)物)。另外，肝臟內(nèi)含有通過第2發(fā)明的大量增殖方法增殖的人肝細(xì)胞的嵌合小鼠的集團(tuán)是分別含有來自同一人的肝細(xì)胞的嵌合小鼠的集團(tuán)，可以在實(shí)質(zhì)上均一的條件下進(jìn)行大規(guī)模試驗(yàn)。
本申請(qǐng)的第4發(fā)明是從上述第3發(fā)明的嵌合小鼠分離人肝細(xì)胞的方法。該方法可以與上述第2發(fā)明的步驟(2)同樣進(jìn)行。
本申請(qǐng)的第5發(fā)明是通過上述第4發(fā)明的方法從嵌合小鼠的肝臟分離的人肝細(xì)胞。該人肝細(xì)胞通過在小鼠個(gè)體內(nèi)增殖，實(shí)質(zhì)上具有與人肝組織的正常肝細(xì)胞同樣的肝功能。因此，通過該第5發(fā)明的人肝細(xì)胞可以提供用于藥物代謝試驗(yàn)或安全性試驗(yàn)等的人肝細(xì)胞試劑盒(第6發(fā)明)以及混合型人工肝臟(第7發(fā)明)。另外，使用在混合型人工肝臟中使用的模件(充填了人肝細(xì)胞的模件)，可以回收人肝細(xì)胞生產(chǎn)的有用物質(zhì)。
肝細(xì)胞試劑盒根據(jù)細(xì)胞的種類和用途有各種各樣，只要是同行，通過采用第5發(fā)明的人肝細(xì)胞和眾所周知的細(xì)胞試劑盒的構(gòu)成，可以很容易制作第6發(fā)明的細(xì)胞試劑盒。另外模件和混合型人工臟器的構(gòu)成也眾所周知，只要是同行可以很容易制作第7發(fā)明的人工肝臟等。
作為第8發(fā)明，本申請(qǐng)還提供不識(shí)別非人肝細(xì)胞，特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體。
該單克隆抗體根據(jù)眾所周知的單克隆抗體制作方法(「單克隆抗體」，長(zhǎng)宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年；“Monoclonal Antibody”James W.Goding，third edition，Academic Press，1996)，可以按照例如以下步驟制作。
1雜交瘤細(xì)胞的制作用含有傳代培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞的免疫原免疫哺乳動(dòng)物，根據(jù)需要可以適當(dāng)進(jìn)行追加免疫，對(duì)動(dòng)物充分致敏。然后從該動(dòng)物中摘出抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞或脾臟細(xì)胞)，得到該細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株的融合細(xì)胞。然后從這些融合細(xì)胞中選擇產(chǎn)生目的單克隆抗體的細(xì)胞，通過培養(yǎng)可以得到雜交瘤細(xì)胞。以下對(duì)各工序進(jìn)行詳細(xì)說明。
a)免疫原的制備對(duì)通過膠原酶從正常肝組織分離到的人肝細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，作為免疫原。人肝細(xì)胞可使用進(jìn)行4次以上，優(yōu)選是6次以上傳代的，例如從15歲以下的人肝組織分離的肝細(xì)胞。
b)動(dòng)物免疫作為被免疫動(dòng)物，可以使用眾所周知的在雜交瘤制作法中使用的哺乳動(dòng)物。具體來說，如小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但從與摘出的抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞容易獲取等觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用小鼠或大鼠作為被免疫動(dòng)物。而實(shí)際使用的小鼠和大鼠的系統(tǒng)沒有特別限制，使用小鼠時(shí)，可以使用例如各系統(tǒng)A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等，使用大鼠時(shí)可以使用例如Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。其中如果考慮到與下面的骨髓瘤細(xì)胞的融合適合性，小鼠的BALB/c系統(tǒng)，大鼠的Low系統(tǒng)作為被免疫動(dòng)物特別合適。另外這些小鼠或大鼠在免疫時(shí)的周齡優(yōu)選為5～12周齡。
動(dòng)物的免疫可以通過將作為免疫原的傳代人肝細(xì)胞約104～108個(gè)注射到動(dòng)物的皮下或腹腔內(nèi)進(jìn)行。免疫原投給的程序因被免疫動(dòng)物的種類、個(gè)體差異等而有所不同，一般來說，投給免疫原次數(shù)為1～6次，多次投給時(shí)投給間隔優(yōu)選1～2周。
c)細(xì)胞融合在無(wú)菌條件下從上述投給程序的最終免疫日后1～5天的被免疫動(dòng)物取出含有抗體產(chǎn)生細(xì)胞的脾臟細(xì)胞或淋巴細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)眾所周知的方法從這些脾臟細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
然后，對(duì)抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞沒有特別限制，可以從眾所周知的細(xì)胞株中選用合適的。但考慮到從融合細(xì)胞選擇雜交瘤時(shí)的便利性，優(yōu)選使用其選擇已經(jīng)確立的HGPRT(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損株。即，來自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS-1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/O-Ag14(SP2/O)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO，BU.1等，來自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，來自人的U266AR(SKO-007)、GM1500·GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合根據(jù)眾所周知的方法可以在不使細(xì)胞存活率極度降低的條件下適宜實(shí)施。這樣的方法如可以使用在聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中對(duì)抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行混合的化學(xué)方法，利用電刺激的物理方法等。
融合細(xì)胞和非融合細(xì)胞的選擇優(yōu)選是通過例如眾所周知的HAT(次黃嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷)選擇法進(jìn)行。該方法在使用在氨甲蝶呤存在下不能存活的HGPRT缺損株的骨髓瘤細(xì)胞，獲取融合細(xì)胞是有效的。即，通過將未融合細(xì)胞和融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，有選擇地保留了對(duì)氨甲蝶呤具有抗性的融合細(xì)胞，而且可以使其增殖。
d)雜交瘤的篩選對(duì)產(chǎn)生目的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選可以通過眾所周知的酶免疫檢定法(EIAEnzyme Immunoassay)、放射線免疫測(cè)定法(RIARadio Immunoassay)、熒光抗體法等進(jìn)行。
通過這樣篩選，可以得到分別產(chǎn)生與非人肝細(xì)胞不結(jié)合，而只與人肝細(xì)胞特異結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞群。
通過這樣篩選后的雜交瘤細(xì)胞可以通過甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、有限稀釋法等眾所周知的方法進(jìn)行篩選，用于產(chǎn)生抗體。
通過以上那樣方法得到的雜交瘤細(xì)胞可以在液氮中或-80℃以下的冷庫(kù)中以冷凍狀態(tài)保存。作為這樣的雜交瘤細(xì)胞的具體例子，本申請(qǐng)?zhí)峁┬∈?小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)。
2單克隆抗體的獲取和純化通過用眾所周知的方法對(duì)上述1制作的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲取不識(shí)別非人肝細(xì)胞，而只與人肝細(xì)胞特異結(jié)合的單克隆抗體。
培養(yǎng)可以在例如在上述克隆法中使用的同樣組成的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或?yàn)榱耸箚慰寺】贵w大量生產(chǎn)，也可以向小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞，從腹水中採(cǎi)取單克隆抗體。
這樣得到的單克隆抗體可以通過硫銨鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等進(jìn)行純化。
作為單克隆抗體的具體例子，本申請(qǐng)?zhí)峁┥鲜鲭s交瘤(小鼠-小鼠雜交瘤K8216)產(chǎn)生的單克隆抗體。
第8發(fā)明的單克隆抗體可以用于上述第2發(fā)明和第4發(fā)明的方法中從小鼠肝臟只分離人肝細(xì)胞。而本第8發(fā)明的單克隆抗體由于不識(shí)別非人肝細(xì)胞，可以用于在小鼠以外的非人動(dòng)物的體內(nèi)使人肝細(xì)胞增殖時(shí)，或?qū)Ψ侨烁渭?xì)胞和人肝細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)時(shí)，對(duì)人肝細(xì)胞進(jìn)行分離、純化。
另外，本申請(qǐng)發(fā)明中使用的「特異識(shí)別增殖性人肝細(xì)胞的單克隆抗體」除了在篩選工序中選擇產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤，可以用與上述同樣的方法作成(參照實(shí)施例6)。本申請(qǐng)作為那樣的單克隆抗體的具體例子提供小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
實(shí)施例以下給出了實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)而且具體的說明，但本申請(qǐng)發(fā)明并不限定于以下例子。
實(shí)施例1使人肝細(xì)胞增殖的嵌合小鼠的作成制作將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在肝臟內(nèi)使人肝細(xì)胞增殖的嵌合小鼠。作成的材料、方法以及各種試驗(yàn)結(jié)果如下所述。
1材料(a)清蛋白尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑轉(zhuǎn)基因小鼠(uPA-Tg)B6SJL-TgN(AlblPlau)144Bri(b)SCID小鼠(Scid)C.B-17/Icr Scidjcl(c)nafamostat mesilate(d)倒千里光堿(e)人肝細(xì)胞小鼠(a)從The Jackson Laboratory購(gòu)入，小鼠(b)從日本クレア購(gòu)入。藥品(c)從鳥居制藥公司(商品名フサン)購(gòu)入，(d)從SIGMA公司購(gòu)入。
而細(xì)胞(e)象下述那樣制備。與進(jìn)行肝切除手術(shù)的患者簽訂協(xié)議書，得到承諾后，從切除的肝獲取正常組織，用UW液進(jìn)行灌流，在4℃下進(jìn)行搬運(yùn)。通過膠原酶處理由正常肝臟組織得到肝臟分散液。通過低速離心法(50g，2分鐘)分離為沉淀和上清，將他們含有的細(xì)胞(上清小型肝細(xì)胞，沉淀肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞)分別用培養(yǎng)基洗凈后，對(duì)肝細(xì)胞計(jì)數(shù)。進(jìn)行冷凍保存時(shí)加冷凍保存液(クラボウ生產(chǎn))，用程序(控制)冷凍機(jī)進(jìn)行冷凍。保存在液氮的沉淀或上清的肝細(xì)胞于37℃的恒溫水槽中融解，對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。在移植前用培養(yǎng)基調(diào)整到4×107個(gè)/ml。
2方法與結(jié)果2.1免疫缺陷肝損傷小鼠的制作使uPA-Tg小鼠(hemizygote，+/-)和SCID小鼠(homozygote，+/-)交配，獲取具有兩方性狀的小鼠uPA-Tg(+/-)/SCID(+/-)的幾率是35.2％。Tg(+/-)和Tg(-/-)的識(shí)別使用對(duì)Tg基因特異的序列作為引物，通過基因組PCR法進(jìn)行。另外SCID(+/-)和SCID(-/-)的識(shí)別通過PCR-RFLP法進(jìn)行。
使得到的Tg(+/-)/SCID(+/-)與SCID(+/+)逆轉(zhuǎn)交配，得到Tg(+/-)/SCID(+/+)。結(jié)果，出現(xiàn)37.9％的Tg(+/-)，和52.8％的SCID(+/+)。使Tg(+/-)/SCID(+/+)相互間交配，得到目的Tg(+/-)/SCID(+/+)和Tg(+/+)/SCID(+/+)。
而uPA基因的純合和雜合的識(shí)別通過以下方法進(jìn)行。
將出生后8～10日的小鼠的尾巴切下5mm，使用Qiagen DNeasyTissue試劑盒提取基因組DNA。用分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA濃度和純度。向master mix 25μl，引物F 1μl，引物R 1μl，Taqman探針1μl中加入DNA和蒸餾水，將總量調(diào)整到50μl，進(jìn)行定量性PCR(ABI7700，Sequencer Detector，PE Applied Biosystems)。引物和Taqman探針以用于uPA基因?qū)胗幂d體中含有的人生長(zhǎng)激素的編碼序列作為對(duì)象象下面那樣設(shè)計(jì)。
引物Fgtcttggctcgctgcaatc(SEQ ID No1)引物Rcgggagactgaggcaggag(SEQ ID No2)Taqman探針ccgcctcctgggttcaagcga(SEQ ID No3)作為對(duì)照，使用以小鼠G3PDH為對(duì)象的引物和Taqman探針。
引物Fggatgcagggatgatgttc(SEQ ID No4)引物Rtgcaccaccaactgcttag(SEQ ID No5)Taqman探針cagaagactgtggatggccctc(SEQ ID No6)PCR條件為95℃下變性10分鐘后，每一個(gè)循環(huán)為95℃下變性15秒鐘，60℃下延伸1分鐘，共進(jìn)行50循環(huán)。通過用內(nèi)部對(duì)照的小鼠G3PDH編碼序列的擴(kuò)增片段量除人生長(zhǎng)激素的編碼序列的擴(kuò)增片段量得到的相對(duì)值，對(duì)基因組中導(dǎo)入DNA的量進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用樣品中的雜合或純合小鼠的基因組的稀釋系列。將標(biāo)準(zhǔn)中使用的小鼠的值作為1，當(dāng)該小鼠為雜合小鼠時(shí)，雜合表示接近1的數(shù)值，純合表示接近2的數(shù)值。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)中使用的小鼠是純合時(shí)，純合表示接近1的數(shù)值，雜合表示接近0.5的數(shù)值。通過解剖時(shí)的肉眼所見，利用該方法的正確率推定為約90％。
2.2人肝細(xì)胞向uPA-Tg/SCID小鼠的移植將出生后14～48日的Tg(+/+)/SCID(+/+)小鼠用乙醚麻醉，將側(cè)腹切開約5mm，由脾頭一次注入4-8×107個(gè)/ml濃度的細(xì)胞懸浮液10-12.5μl(4-10×105個(gè)/ml)后，進(jìn)行止血。向腹腔一次注入40μl的濃度為0.02g/ml的止血?jiǎng)〆-氨基己酸(SIGMA)，將脾臟放回腹腔、縫合。由于Tg小鼠肝細(xì)胞中產(chǎn)生的uPA向細(xì)胞外分泌，所以血中的uPA濃度高。uPA催化蛋白質(zhì)分解和將纖溶酶原活化為纖溶原，具有分解血纖蛋白塊的作用。因此，出生后，許多小鼠在腸道或腹腔內(nèi)發(fā)生出血，所以出生后4日以內(nèi)就死了。為了避免由于手術(shù)時(shí)出血導(dǎo)致死亡，投給有抑制纖溶酶原激活物和纖溶原作用的止血效果的e-氨基己酸。
已知用于交配的SCID/C.B-17小鼠不帶有T細(xì)胞、B細(xì)胞，但帶有NK細(xì)胞。因此，為了使移植的人肝細(xì)胞不受到NK細(xì)胞的攻擊，在移植前一天和移植翌日向腹腔內(nèi)注入抑制NK活性的asialo GM1抗體。在出生后4周斷奶，從出生后5周開始在不同的籠子飼養(yǎng)雌雄。
2.3小鼠血中的人清蛋白的監(jiān)測(cè)從移植人肝細(xì)胞后第1周開始，每周1次或2次從小鼠尾巴採(cǎi)取10μl血液，使用定量ELISA免疫分析(Bethyl laboratories Inc.)測(cè)定人清蛋白濃度。
移植了人肝細(xì)胞的19只Tg(+/+)/SCID小鼠中有11只小鼠血中人清蛋白增加(圖1)，高的可達(dá)到8mg/ml以上，該值相當(dāng)于小鼠血中清蛋白的62％。
另外，對(duì)分別移植了人肝細(xì)胞經(jīng)低速離心分離得到的上清中的細(xì)胞(小型肝細(xì)胞)和沉淀中的細(xì)胞(肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞)時(shí)的血中人清蛋白濃度進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞移植小鼠相比，小型肝細(xì)胞移植小鼠一方清蛋白濃度的上升更多(圖2)。
2.4由人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體和補(bǔ)體抑制劑的投給發(fā)現(xiàn)存在著血中人清蛋白超過3mg/ml的小鼠狀態(tài)急劇惡化后死亡的情況(圖1)。在死亡動(dòng)物中觀察到肺出血，證實(shí)是由于人肝細(xì)胞的補(bǔ)體產(chǎn)生造成的影響。使用針對(duì)人補(bǔ)體C3的抗體對(duì)小鼠肝臟組織中的人肝細(xì)胞進(jìn)行免疫染色時(shí)，確認(rèn)在人肝細(xì)胞中存在C3。因此，將200μl的2mg/ml濃度的補(bǔ)體抑制劑(フサン(鐮菌素、鐮孢素))投給人清蛋白濃度變高了的小鼠。投給頻率開始為每2日一次。每日觀察體重的變化，如果發(fā)現(xiàn)體重減少，增加投給頻率和濃度(圖3)。結(jié)果對(duì)于血中人清蛋白濃度超過2mg/ml的小鼠隔日投給一次補(bǔ)體抑制劑(フサン)，對(duì)于超過4mg/ml的小鼠每日投給一次，對(duì)于超過6mg/ml的小鼠1日投給2次(圖3)。通過這樣處理，血中人清蛋白濃度即使超過3mg/ml，小鼠也能長(zhǎng)期生存，高的可以檢測(cè)到8mg/ml的人清蛋白(圖1)。
另外，通過ELISA法分別測(cè)定了沒有投給補(bǔ)體抑制劑(フサン)的嵌合小鼠和投給抑制劑的嵌合小鼠的血中人補(bǔ)體(hC3a)。結(jié)果確認(rèn)投給補(bǔ)體的嵌合小鼠的hC3a濃度比沒有投給的嵌合小鼠的低(圖4)。
2.5維生素C和SCID小鼠血清的投給由于人肝細(xì)胞不能合成維生素C，帶有用人肝細(xì)胞置換的肝臟的小鼠有成為維生素C缺乏癥的可能性。因此，對(duì)于移植了人肝細(xì)胞的小鼠要投給溶解了1mg/ml濃度的抗壞血酸-2-磷酸的飲料水(參考日本クレア、抗壞血酸合成能力缺乏大鼠的飼養(yǎng)方法)。
另外，移植了人肝細(xì)胞的Tg(+/+)/SCID小鼠與Tg(+/-)/SCID小鼠相比，體重增加緩慢，毛色也不好。由于認(rèn)為可能是小鼠肝臟中的人肝細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)和酶等對(duì)小鼠的成長(zhǎng)和身體的維持不充分，所以每周一次向小鼠皮下注射50μl的SCID小鼠血清。投給SCID小鼠血清的與沒有投給血清的Tg(+/+)/SCID小鼠的體重增加量進(jìn)行比較，投給血清的小鼠一方體重增加。
2.6小鼠肝臟的肉眼病理檢查和組織學(xué)的病理檢查在乙醚麻醉下採(cǎi)集小鼠血，測(cè)定血清中的清蛋白和GPT值。摘出肝臟和脾臟，測(cè)定重量，拍照后取樣用于冷凍切片包埋、石蠟切片包埋，從剩下的樣品中提取微粒體級(jí)分。確認(rèn)隨著人清蛋白濃度變高，血清清蛋白量增加和GPT值降低(圖5)。
在人清蛋白為高值的小鼠中，可以看到整個(gè)肝臟呈桃色，在一部分殘留著作為Tg(+/+)/SCID小鼠特征的白色部位的小鼠。另外。也看到了一部分呈紅色的肝臟，認(rèn)為該部位可能是由于uPA導(dǎo)入基因的缺損而正常化的小鼠的肝細(xì)胞。
制作肝臟的各個(gè)葉的冷凍切片，與人特異的細(xì)胞角蛋白8/18抗體(ICN Pharmaceuticals，Inc，Ohio)反應(yīng)后，用過氧化物酶標(biāo)記DAKOEnvision+TM(DAKO CORPORATION，CA)染色。算出各個(gè)葉的每一切片面積的細(xì)胞角蛋白8/18陽(yáng)性部位的比例(圖6、7)。在人清蛋白分泌量多的小鼠中細(xì)胞角蛋白8/18陽(yáng)性肝細(xì)胞的面積的比例高。還觀察到陽(yáng)性細(xì)胞超過80％的小鼠。
2.7微粒體中P450分子種類的解析使用針對(duì)P450分子種類的抗體(第一化學(xué)藥品株式會(huì)社，東京)，通過Western blot分析檢測(cè)在從小鼠採(cǎi)取的微粒體級(jí)分中的P450分子種類的表達(dá)。結(jié)果在人清蛋白高的小鼠中，作為P450的人特異的分子種類的CYP2C9的表達(dá)被證實(shí)(圖8)。
另外，為了研究從小鼠採(cǎi)取的微粒體級(jí)分中的CYP2C9的活性，向微粒體中添加雙氯酚酸鈉，測(cè)定雙氯酚酸鈉的羥基化。結(jié)果在uPA(-/-)/SCID小鼠中幾乎看不到雙氯酚酸鈉的羥基化活性，也沒有看到投給補(bǔ)體抑制劑引起的誘導(dǎo)。然而，在移植了人肝細(xì)胞的嵌合小鼠中，看到向人細(xì)胞的置換率越高，雙氯酚酸鈉的羥基化活性也越高，在置換率89％的嵌合小鼠中，看到超過供體(人)的微粒體中的活性(圖9)。
2.8嵌合小鼠肝臟中的P450各個(gè)分子種類的mRNA表達(dá)和用利福平的誘導(dǎo)從嵌合小鼠肝臟提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成針對(duì)6種人型P450分子種類(CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)的各個(gè)基因cDNA的引物，使用PRISM7700 Sequence Detector(ABI公司)，對(duì)各個(gè)mRNA的表達(dá)量進(jìn)行定量。結(jié)果置換率0％的對(duì)照小鼠幾乎沒有表達(dá)人型P450，而在嵌合小鼠肝臟中所有的人型P450分子種類都表達(dá)，他們的表達(dá)圖式近似于供體(人)的表達(dá)圖式(圖10)。
另外，在4日內(nèi)向3只嵌合小鼠腹腔內(nèi)注入利福平(50μg/kg b.w.)，在第5天採(cǎi)取肝臟，向上述那樣對(duì)6種人型P450的各個(gè)表達(dá)進(jìn)行定量。眾所周知利福平只誘導(dǎo)人的CYP3A4表達(dá)。結(jié)果，確認(rèn)在投給利福平的嵌合小鼠的肝臟中與沒有投給利福平的小鼠相比，前者的人型CYP3A4的表達(dá)大約是后者的5.7倍(圖10)。
實(shí)施例2嵌合小鼠的人肝細(xì)胞的分離和通過單克隆抗體進(jìn)行人肝細(xì)胞純化通過膠原酶灌流法從實(shí)施例1作成的嵌合小鼠分離肝細(xì)胞。膠原酶的濃度為0.05％，處理時(shí)間為9分鐘。認(rèn)為肝細(xì)胞中可能混入人肝細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞，但小鼠肝細(xì)胞與人肝細(xì)胞相比，由于膠原酶造成的毒性高，所以分離的許多肝細(xì)胞(80％)都是人肝細(xì)胞。
另外，為了提高人肝細(xì)胞的純度，使用不識(shí)別小鼠肝細(xì)胞，而特異識(shí)別人肝細(xì)胞的表面的小鼠單克隆抗體(實(shí)施例6作成的雜交瘤K8216產(chǎn)生的單克隆抗體)，只分離人肝細(xì)胞。使上述抗體與通過膠原酶灌流分離的人肝細(xì)胞占有的比例約為80％的小鼠肝細(xì)胞反應(yīng)，再使FITC標(biāo)記小鼠IgG抗體反應(yīng)，使用FACS分離與FITC標(biāo)記小鼠IgG抗體反應(yīng)的細(xì)胞。結(jié)果人肝細(xì)胞的純度達(dá)到95％以上。
實(shí)施例3由嵌合小鼠分離的人肝細(xì)胞向uPA-Tg/SCID小鼠的再移植將實(shí)施例2分離的肝細(xì)胞與實(shí)施例1一樣移植到另外的uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠，進(jìn)行飼養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血中人清蛋白量增加(圖11)。
實(shí)施例4由于uPA導(dǎo)入基因的缺失導(dǎo)致的正常化小鼠肝細(xì)胞的增殖抑制向uPA-Tg(+/-)/SCID和uPA-Tg(+/+)/SCID腹腔內(nèi)注入倒千里光堿30或60mg/kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在uPA-Tg(+/-)/SCID小鼠中由于uPA導(dǎo)入基因的缺失(uPA-Tg(-/-)/SCID)造成的正常化肝細(xì)胞的集落減少(圖12)。
接下來，與實(shí)施例1同樣操作將人肝細(xì)胞移植到腹腔內(nèi)注入了60mg/kg的倒千里光堿的uPA-Tg(+/-)/SCID和uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠中，作成嵌合小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使在接受uPA-Tg(+/-)/SCID小鼠的嵌合小鼠中血中人清蛋白濃度增加的程度與來自u(píng)PA-Tg(+/+)/SCID小鼠的嵌合小鼠同等程度。
實(shí)施例5將抗小鼠Fas抗體投給人肝細(xì)胞嵌合小鼠對(duì)于1只實(shí)施例1制作的嵌合小鼠，在從人肝細(xì)胞移植后經(jīng)過100天時(shí)，每隔1周腹腔內(nèi)注入與小鼠肝細(xì)胞的Fas抗原反應(yīng)，誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡的抗小鼠Fas抗體(0.2μg/g b.w.)，共注入2次。
結(jié)果就象圖13所表示的那樣。該嵌合小鼠從人肝細(xì)胞移植后約80天以后，血中的人清蛋白表現(xiàn)出減少的傾向，但通過投給抗小鼠Fas抗體，血中人清蛋白濃度顯著上升。
以上結(jié)果確認(rèn)在本發(fā)明的方法中，將抗小鼠Fas抗體投給人肝細(xì)胞移植后的嵌合小鼠對(duì)于人肝細(xì)胞的增殖和/或活化是有效的。
實(shí)施例6識(shí)別人增殖性肝細(xì)胞的單克隆抗體的制作1.人肝細(xì)胞的培養(yǎng)通過膠原酶灌流法從人肝臟組織得到細(xì)胞分散液。將細(xì)胞分散液經(jīng)低速離心分離(50g，2分鐘)，將該沉淀級(jí)分用添加了胎牛血清、人血清、EGF、尼克酰胺、活性持續(xù)型維生素C的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，與經(jīng)絲裂霉素C處理后的Swiss 3T3細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)。Swiss 3T3細(xì)胞每10日添加一次。從培養(yǎng)第7天時(shí)開始觀察到人肝細(xì)胞的集落。將增殖到鋪滿的肝細(xì)胞用EDTA/Trypsin進(jìn)行傳代。傳代如用小孩的肝細(xì)胞可以傳代6-9次，而60歲以上的患者的肝細(xì)胞只能傳代3-4次(圖14)。將表現(xiàn)出更高增殖能力的小孩(12歲)的肝細(xì)胞用作抗原(圖15)。
2.動(dòng)物的免疫利用上述方法，在培養(yǎng)皿上使3-5次傳代培養(yǎng)的小孩(12歲)肝細(xì)胞增加。將增殖至鋪滿的細(xì)胞(約1×107個(gè))用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗凈后，除去PBS，用細(xì)胞刮棒攪和回收，懸浮于約1ml PBS中。然后將他注入6周齡的Balb/c小鼠的腹腔內(nèi)。再于20天后或30天后用同樣方法進(jìn)行免疫。
3.細(xì)胞融合經(jīng)2次免疫后，看到抗體效價(jià)上升，第3次免疫(boost)72小時(shí)后，從1只免疫動(dòng)物摘出脾臟，採(cǎi)取脾臟細(xì)胞。對(duì)該脾臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(細(xì)胞名NS-1)進(jìn)行細(xì)胞融合，于96孔板播種372孔進(jìn)行培養(yǎng)。
4.雜交瘤的篩選1次篩選(ELISA、組織染色)通過ELISA測(cè)定得到的融合細(xì)胞的培養(yǎng)上清對(duì)抗原的反應(yīng)性。測(cè)定通過以下方法實(shí)施。將作為抗原使用的傳代培養(yǎng)肝細(xì)胞播種到96孔板，培養(yǎng)后用PBS洗凈，使其干燥，保存在-80℃下，使培養(yǎng)上清與其反應(yīng)。然后使酶標(biāo)記的抗小鼠IgG或抗小鼠IgM抗體反應(yīng)，加入底物，發(fā)色，測(cè)定其吸光度。結(jié)果融合細(xì)胞372個(gè)樣品的吸光度的平均值為0.149(SD0.099)，將其中吸光度在0.20以上(81個(gè)樣品，約20％)的樣品作為陽(yáng)性。另外通過目視，吸光度在0.15以上就可確認(rèn)發(fā)色，所以對(duì)于0.15～0.20的樣品(46樣品)進(jìn)行組織染色確認(rèn)了反應(yīng)性。只將其中感興趣的表現(xiàn)出深的染色帶作為陽(yáng)性樣品13。將選擇的陽(yáng)性樣品的94個(gè)樣品進(jìn)一步培養(yǎng)、擴(kuò)大，回收培養(yǎng)上清后，將細(xì)胞冷凍保存。
5. 2次篩選(ELISA、組織染色)通過與1次篩選同樣的ELISA測(cè)定來自在1次篩選中選擇的94樣品的擴(kuò)大后培養(yǎng)上清對(duì)抗原的反應(yīng)性，選擇陽(yáng)性樣品88個(gè)。再通過組織染色研究這些樣品在組織中的反應(yīng)性。就其中含有與肝細(xì)胞的細(xì)胞膜或門靜脈區(qū)的肝細(xì)胞特異反應(yīng)的雜交瘤的樣品，或通過從其中克隆得到的集落的培養(yǎng)上清對(duì)剛分離的人肝細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行研究。
就組織中門靜脈區(qū)的肝細(xì)胞膜染色的雜交瘤培養(yǎng)上清(No.23)(圖16)在剛分離的肝細(xì)胞表面中的反應(yīng)性使用FACS(Fluorescenceactivated cell sorting)進(jìn)行解析。將通過膠原酶灌流、低速離心從成年人男性(46歲和49歲)肝臟得到的細(xì)胞用該樣品的培養(yǎng)上清在4℃下處理30分鐘，然后再于4℃下進(jìn)行30分鐘FITC標(biāo)記小鼠IgG抗體處理，可以用FACS進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞集團(tuán)的一部分(1～2％)細(xì)胞與該樣品反應(yīng)(圖17)。在此將這些細(xì)胞集團(tuán)作為R2收集，沒有反應(yīng)的細(xì)胞集團(tuán)作為R3收集，進(jìn)行培養(yǎng)。另外分類收集前的肝細(xì)胞也同樣進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果在分類收集前的肝細(xì)胞中，就象上述那樣，從培養(yǎng)到第7天時(shí)觀察到集落形成。而在R3級(jí)分中沒有觀察到形成集落的細(xì)胞，但在與No.23反應(yīng)的R2級(jí)分中，觀察到許多集落(圖18)。另外，通過FACS研究對(duì)傳代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的反應(yīng)性時(shí)，約80％的細(xì)胞呈陽(yáng)性(圖19)。即，認(rèn)為不識(shí)別傳代培養(yǎng)細(xì)胞中在培養(yǎng)過程中分化的細(xì)胞，只識(shí)別增殖性肝細(xì)胞。由此表明，在No.23中可能含有特異識(shí)別形成集落的細(xì)胞的雜交瘤。就通過克隆從No.23樣品得到的集落也利用FACS對(duì)在剛分離的肝細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析。結(jié)果得到3個(gè)表現(xiàn)出同樣反應(yīng)性的克隆。將來自其中的一個(gè)克隆(小鼠-小鼠雜交瘤K8223)作為專利微生物于2002年3月6日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(委托號(hào)FERMP-18752)，另外于2003年3月20日進(jìn)行了國(guó)際保藏(委托號(hào)FERM BP-8334)。
6.單克隆抗體的制作通過培養(yǎng)上述的雜交瘤(K8223)細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)，通過從腹水採(cǎi)集單克隆抗體，得到與增殖性人肝細(xì)胞特異結(jié)合的單克隆抗體。
實(shí)施例7特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體的制作通過肝臟組織的組織染色從實(shí)施例6的1次篩選選擇的94個(gè)樣品中ELISA為陽(yáng)性的88個(gè)樣品中選擇產(chǎn)生不識(shí)別非人肝細(xì)胞，只識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體的雜交瘤。就肝細(xì)胞的細(xì)胞膜與區(qū)域沒有關(guān)系一樣染色的雜交瘤培養(yǎng)上清3樣品利用FACS對(duì)培養(yǎng)人肝細(xì)胞或剛分離的人肝細(xì)胞和非人動(dòng)物(小鼠、大鼠)肝細(xì)胞的細(xì)胞表面的反應(yīng)性進(jìn)行解析。將通過膠原酶灌流、低速離心從成年人男性(46歲或68歲)肝臟得到的細(xì)胞用選擇的3個(gè)樣品的培養(yǎng)上清在4℃下處理30分鐘，然后于4℃下進(jìn)行30分鐘FITC標(biāo)記小鼠IgG抗體處理，可以用FACS進(jìn)行檢測(cè)。利用FACS篩選，結(jié)果選擇出1個(gè)只與人的肝細(xì)胞反應(yīng)，不與小鼠和大鼠肝細(xì)胞反應(yīng)的雜交瘤(克隆前)樣品。由此得到的單克隆的雜交瘤培養(yǎng)上清、2克隆都表現(xiàn)出同樣的反應(yīng)性(圖20)。在用選擇的雜交瘤培養(yǎng)上清的組織染色中，認(rèn)為是人肝組織的毛細(xì)膽管的部位染色，在其染色性中看不到區(qū)域差別。另外小鼠和大鼠肝組織無(wú)論哪一個(gè)對(duì)該雜交瘤培養(yǎng)上清都表現(xiàn)為陰性。由以上結(jié)果得到產(chǎn)生不識(shí)別非人動(dòng)物的肝細(xì)胞，而特異識(shí)別人肝細(xì)胞的抗人肝細(xì)胞單克隆抗體的雜交瘤。這個(gè)雜交瘤K8216株作為專利微生物于2002年3月6日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(委托號(hào)FERM P-18751)，另外于2003年3月20日進(jìn)行了國(guó)際保藏(委托號(hào)FERM BP-8333)。
用與實(shí)施例6同樣的方法從該K8216株得到了單克隆抗體。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性就象以上詳細(xì)說明的那樣，通過本申請(qǐng)發(fā)明，可以以保持其功能的狀態(tài)使人肝細(xì)胞大量增殖。另外提供肝臟內(nèi)的許多細(xì)胞置換為人肝細(xì)胞的嵌合小鼠?？梢允褂迷撉逗闲∈蠛腿烁渭?xì)胞進(jìn)行化合物的藥物代謝試驗(yàn)和安全性試驗(yàn)。
序列表<110>Japan Science and Technology Corporation andHiroshima Industrial Technology Organization<120>人肝細(xì)胞增殖方法和人肝細(xì)胞的獲取方法<130>03-F-014<150>JP 2002-84280<151>2002-03-25<160>6<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>1gtcttggctc gctgcaatc 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>2cgggagactg aggcaggag 19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>3ccgcctcctg ggttcaagcg a 21<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>4ggatgcaggg atgatgttc 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>5tgcaccacca actgcttag 19<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>6cagaagactg tggatggccc tc 2權(quán)利要求
1.一種人肝細(xì)胞增殖方法，其特征是是通過將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，使人肝細(xì)胞移植小鼠在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下進(jìn)行飼養(yǎng)，使移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中增殖。
2.權(quán)利要求1的人肝細(xì)胞增殖方法，其中防御來自人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)至少是以下的(a)和(b)中的一種狀態(tài)，(a)至少投給人肝細(xì)胞移植小鼠1次補(bǔ)體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠，使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(DAF/CD55)轉(zhuǎn)基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
3.權(quán)利要求1或2的人肝細(xì)胞增殖方法，其中免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配后得到的后代小鼠。
4.權(quán)利要求3的人肝細(xì)胞增殖方法，其中后代小鼠是半合子免疫缺陷肝損傷小鼠。
5.權(quán)利要求4的人肝細(xì)胞增殖方法，在將肝細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)投給半合子免疫缺陷肝損傷小鼠后，進(jìn)行人肝細(xì)胞移植。
6.權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)的人肝細(xì)胞增殖方法，將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細(xì)胞的免疫缺陷肝損傷小鼠。
7.權(quán)利要求1的人肝細(xì)胞增殖方法，其中移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的人肝細(xì)胞是增殖性人肝細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的人肝細(xì)胞增殖方法，其中增殖性人肝細(xì)胞是被特異識(shí)別形成集落的同時(shí)增殖的人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的人肝細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的人肝細(xì)胞增殖方法，其中單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
10.人肝細(xì)胞大量增殖方法，其特征是由以下步驟(1)～(3)組成，并且將步驟(2)和(3)重復(fù)一次以上，(1)通過將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下對(duì)人肝細(xì)胞移植小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，使移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中增殖的步驟；(2)從小鼠肝臟分離增殖的人肝細(xì)胞的步驟；以及(3)將分離的人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟，使人肝細(xì)胞移植小鼠在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下飼養(yǎng)50天以上的步驟。
11.權(quán)利要求10的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中防御來自步驟(1)和/或步驟(3)的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)至少是以下的(a)和(b)中的一種狀態(tài)，(a)至少投給人肝細(xì)胞移植小鼠一次補(bǔ)體抑制劑；(b)作為免疫缺陷肝損傷小鼠使用免疫缺陷肝損傷小鼠和衰變加速因子(DAF/CD55)轉(zhuǎn)基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
12.權(quán)利要求10或11的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中在步驟(1)和/或步驟(3)中，免疫缺陷肝損傷小鼠是遺傳性免疫缺陷小鼠和遺傳性肝損傷小鼠交配得到的后代小鼠。
13.權(quán)利要求12的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中后代小鼠是半合體免疫缺陷肝損傷小鼠。
14.權(quán)利要求13的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中，將肝細(xì)胞增殖抑制物質(zhì)投給半合體免疫缺陷肝損傷小鼠后，進(jìn)行肝細(xì)胞移植。
15.權(quán)利要求10至14中的任一項(xiàng)的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中在步驟(1)和/或步驟(3)中，將抗小鼠Fas抗體投給移植了人肝細(xì)胞的免疫缺陷肝損傷小鼠。
16.權(quán)利要求10的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中在步驟(1)和/或步驟(3)中向免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟進(jìn)行移植的人肝細(xì)胞是增殖性人肝細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中增殖性人肝細(xì)胞是被特異識(shí)別形成集落的同時(shí)增殖的人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的人肝細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8223(FERM BP-8334)產(chǎn)生的單克隆抗體。
19.權(quán)利要求10的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中，通過在步驟(2)中至少進(jìn)行以下的(a)和(b)中的一種操作，實(shí)質(zhì)上只分離人肝細(xì)胞，(a)對(duì)從小鼠肝臟分離的肝臟組織進(jìn)行膠原酶處理，以及(b)對(duì)不識(shí)別非人肝細(xì)胞，而特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞進(jìn)行分離。
20.權(quán)利要求19的人肝細(xì)胞大量增殖方法，其中，單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產(chǎn)生的單克隆抗體。
21.一種嵌合小鼠，其在肝臟內(nèi)含有通過權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的人肝細(xì)胞增殖方法、或權(quán)利要求10至20中任一項(xiàng)的人肝細(xì)胞大量增殖方法增殖的人肝細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的嵌合小鼠，其中增殖的人肝細(xì)胞占肝臟內(nèi)細(xì)胞的70％以上。
23.權(quán)利要求21或22的嵌合小鼠，具有人型P450活性。
24.人肝細(xì)胞獲取方法，其特征是從權(quán)利要求21、22或23的嵌合小鼠的肝臟分離人肝細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的人肝細(xì)胞獲取方法，其中，至少進(jìn)行以下的(a)和(b)中的一種操作，實(shí)質(zhì)上只分離人肝細(xì)胞，(a)對(duì)從小鼠肝臟分離的肝臟組織進(jìn)行膠原酶處理，以及(b)對(duì)由不識(shí)別非人肝細(xì)胞，而特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體識(shí)別的細(xì)胞進(jìn)行分離。
26.權(quán)利要求25的人肝細(xì)胞獲取方法，其中，單克隆抗體是小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)產(chǎn)生的單克隆抗體。
27.通過權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)的方法獲取的人肝細(xì)胞。
28.含有權(quán)利要求27的人肝細(xì)胞的細(xì)胞試劑盒。
29.充填了權(quán)利要求27的人肝細(xì)胞的雜交型人工肝臟。
30.一種不識(shí)別非人肝細(xì)胞，特異識(shí)別人肝細(xì)胞的單克隆抗體。
31.權(quán)利要求30的單克隆抗體，是由小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERMBP-8333)產(chǎn)生的。
32.一種小鼠-小鼠雜交瘤K8216(FERM BP-8333)。
33.將候補(bǔ)物質(zhì)全身投給權(quán)利要求21、22或23的嵌合小鼠，試驗(yàn)候補(bǔ)物質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)或毒性的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及人肝細(xì)胞增殖方法和人肝細(xì)胞的獲取方法，通過將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷肝損傷小鼠的肝臟中，在防御來自人肝細(xì)胞產(chǎn)生的人補(bǔ)體的攻擊的狀態(tài)下，對(duì)人肝細(xì)胞移植小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，使移植的人肝細(xì)胞在小鼠肝臟中大量增殖。進(jìn)一步利用這樣增殖的人肝細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行上述操作，可以得到大量的人肝細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1643136SQ0380698
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月25日
發(fā)明者向谷知世, 吉里勝利 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 財(cái)團(tuán)法人廣島縣產(chǎn)業(yè)振興機(jī)構(gòu)