古日古木-13促進(jìn)肝再生的應(yīng)用及作用機(jī)制評價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供古日古木?13在促進(jìn)肝再生上的應(yīng)用及其作用機(jī)制的評價(jià)方法，(1)將實(shí)驗(yàn)鼠分為分為12組；(2)對PH手術(shù)組的小鼠進(jìn)行70％肝大部切除術(shù)，假手術(shù)組采用剖腹探查術(shù)，空白對照組不進(jìn)行處理；(3)對所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按分組給古日古木高、中、低劑量試劑和溶劑，每天1次；(4)灌胃第1、3、5、7、9天分別斷頭取血，完整切取肝臟稱重；(5)取一小部分肝稱重，用鹽水勻漿，測SOD、MDA、NO，另取部分肝組織福爾馬林固定后，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測；(6)檢測血請中各種生化指標(biāo)、細(xì)胞因子表達(dá)情況、計(jì)算肝指數(shù)、觀察小鼠肝臟細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。本發(fā)明的有益效果是豐富了古日古木的藥用價(jià)值。
【專利說明】
古曰古木-13促進(jìn)肝再生的應(yīng)用及作用機(jī)制評價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種古日古木-13促進(jìn)肝再生的應(yīng)用及作用機(jī)制評價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]古日古木-13(別名紅花清肝十三味丸)是蒙醫(yī)傳統(tǒng)藥方，出自《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(蒙藥分冊)。本藥氣香，味苦、澀，性涼，由紅花、丁香、蓮子、麥冬、木香、訶子、川楝子、梔子、紫檀香、麝香、水牛角濃縮粉、牛黃、銀朱組成。具有清熱、解毒、涼血之功效。該藥對各種肝熱癥、配毒癥及肝功減退都有作用，尤以血熱引起的眼病為甚，亦對“亞瑪病”之腎傷、尿頻有效。目前，對蒙藥古日古木-13研究主要集中在酒精性肝病、病毒性肝炎、膽汁淤積性肝炎、高血壓病、藥物性肝損傷、急性肝損傷傷、老年性高血脂等病，而對肝再生的研究鮮有報(bào)道。
[0003]本發(fā)明擬通過對小鼠進(jìn)行肝大部分切除術(shù)從而建立動(dòng)物模型，分別給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物高、中、低劑量蒙藥古日古木-13，一周后檢測血中各種生化指標(biāo)、細(xì)胞因子的表達(dá)情況、計(jì)算肝指數(shù)、觀察動(dòng)物肝臟細(xì)胞的增殖、凋亡和分化的指標(biāo)，并對對動(dòng)物的肝臟進(jìn)行油紅O染色；同時(shí)分別用不同劑量的蒙藥古日古木-13處理肝癌細(xì)胞HepG2，觀察其對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面，探討蒙藥古日古木-13對肝再生的影響及可能機(jī)制，為蒙藥古日古木-13的進(jìn)一步藥用開發(fā)開拓新的途徑，為豐富肝再生的理論及臨床上肝衰竭的治療提供新的思路。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]古日古木-13在促進(jìn)肝再生上的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的另一方面還包括古日古木-13影響肝再生作用機(jī)制的評價(jià)方法，包括以下步驟:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(l)C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，隨機(jī)分為12組，每組5只，分為PH手術(shù)-古日古木高劑量組，PH手術(shù)-古日古木中劑量組，PH手術(shù)-古日古木低劑量組，PH手術(shù)-溶劑對照組，假手術(shù)-古日古木高劑量組，假手術(shù)-古日古木中劑量組，假手術(shù)-古日古木低劑量組，假手術(shù)-溶劑對照組，和空白對照-古日古木高劑量組，空白對照-古日古木中劑量組，空白對照-古日古木低劑量組，空白對照-溶劑對照組；
[0008](2)對PH手術(shù)組的小鼠進(jìn)行經(jīng)典的70%肝大部切除術(shù)，假手術(shù)組采用剖腹探查術(shù)，空白對照組不進(jìn)行手術(shù)處理；
[0009](3)待小鼠蘇醒恢復(fù)后對所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按分組給古日古木高、中、低劑量試劑和溶劑，每天I次；
[0010](4)灌胃第1、3、5、7、9天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)后分別斷頭取血，并完整切取小鼠肝臟并稱重；[0011 ] (5)取一小部分肝稱重，用-4°c的鹽水勻漿，按說明書的方法測S0D、MDA、N0。另取部分肝組織用10%福爾馬林固定后，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測；
[0012](6)檢測血請中各種生化指標(biāo)、細(xì)胞因子的表達(dá)情況、計(jì)算肝指數(shù)、觀察小鼠肝臟細(xì)胞的增殖、凋亡和分化的情況；
[0013]細(xì)胞實(shí)驗(yàn):同時(shí)分別用不同劑量的蒙藥古日古木-13處理肝癌細(xì)胞HepG2，觀察其對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。
【附圖說明】
[0014]圖1a-圖1g，利用所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) ALT，AST，GLU，TG，CHOL，HDL，LDL。
[0015]圖2a-圖2g，除去藍(lán)色底紋(極端值)和黑鼠值后ALT，AST，GLU，TG，CHOL，HDL，LDL的統(tǒng)計(jì)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0017]1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理
[0018]C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，隨機(jī)分為12組，每組5只，分為PH手術(shù)-古日古木高劑量組，PH手術(shù)-古日古木中劑量組，PH手術(shù)-古日古木低劑量組，PH手術(shù)-溶劑對照組，假手術(shù)-古日古木高劑量組，假手術(shù)-古日古木中劑量組，假手術(shù)-古日古木低劑量組，假手術(shù)-溶劑對照組，和空白對照-古日古木高劑量組，空白對照-古日古木中劑量組，空白對照-古日古木低劑量組，空白對照-溶劑對照組，古日古木高、中、低劑量組分別為1600mg/(kg.d—工)，800mg/(kg.d—工)，400mg/(kg.d—工)。對所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按分組給古日古木高、中、低劑量試劑和溶劑，每天I次，共灌胃7天。
[0019]然后對PH手術(shù)組的小鼠進(jìn)行經(jīng)典的70%肝大部切除術(shù)，假手術(shù)組采用剖腹探查術(shù)，空白對照組不進(jìn)行手術(shù)處理，待小鼠蘇醒恢復(fù)后對所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按分組給古日古木高、中、低劑量試劑和溶劑，每天I次，灌胃第1、3、5、7、9天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)后分別斷頭取血，并完整切取小鼠肝臟并稱重。取一小部分肝稱重，用-4°C的鹽水勻漿，按說明書的方法測S0D、MDA、NO。另取部分肝組織用10%福爾馬林固定后，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。檢測血請中各種生化指標(biāo)、細(xì)胞因子的表達(dá)情況、計(jì)算肝指數(shù)、觀察小鼠肝臟細(xì)胞的增殖、凋亡和分化的情況。
[0020]2、肝大部切除術(shù)
[0021]PH手術(shù)組小鼠饑餓過夜，用體重計(jì)稱重，并標(biāo)記。用Iml無菌空針抽取4%水合氯醛溶液，按8yl/g在腹腔內(nèi)注射，小鼠完全麻醉倒后(約l-3min)，采取仰臥位，將其固定于操作臺(tái)上，注意觀察小鼠胸廓起伏情況，以此來判斷其呼吸及心跳情況。麻醉后用用小剪刀或脫毛劑去除小鼠胸部至下腹部毛發(fā)，安爾碘消毒腹部三次，后一次消毒范圍應(yīng)小于前一次強(qiáng)力碘消毒區(qū)域，消毒好的小鼠從劍突下做橫行正中切口，切口長約l-2cm，充分顯露肝臟，剪開鐮狀韌帶至下腔靜脈前方。擠出小鼠肝臟，用棉簽抬起左外葉，剪開肝臟臟面的肝胃韌帶和部分肝左側(cè)冠狀韌帶，此時(shí)肝左外葉基本游離。取I號絲線置于肝臟臟面，繞過左外葉，在肝臟膈面盡量靠近根部結(jié)扎，剪下肝左外葉。同時(shí)抬起肝左中葉和右中葉，從臟面繞過I號絲線，在肝臟膈面靠近根部處結(jié)扎，剪下這兩葉。這樣就達(dá)到了肝臟大部切除(近70 % )。用棉簽清除腹腔內(nèi)出血，查看無活動(dòng)性出血后，用O號絲線分別縫合腹膜和腹壁。用酒精棉球擦去小鼠切口處血液，防止小鼠咬破切口處縫線。術(shù)后將PH實(shí)驗(yàn)組小鼠放回鼠籠，并置于燈光下促進(jìn)小鼠蘇醒。保持室內(nèi)溫度于25°C-30°C，并給與自由進(jìn)食水，觀察小鼠的存活狀態(tài)。
[0022]3、剖腹探查假手術(shù)組
[0023]假手術(shù)組(剖腹探查術(shù)組)小鼠饑餓過夜，用體重計(jì)稱重，并標(biāo)記。用Iml無菌空針抽取4%水合氯醛溶液，按8yl/g在腹腔內(nèi)注射，小鼠完全麻醉倒后(約l-3min)，采取仰臥位，將其固定于操作臺(tái)上，注意觀察小鼠胸廓起伏情況，以此來判斷其呼吸及心跳情況。用小剪刀或脫毛劑去除小鼠胸部至下腹部毛發(fā)，安爾碘消毒腹部三次，后一次消毒范圍應(yīng)小于前一次強(qiáng)力碘消毒區(qū)域。消毒好的小鼠從劍突下做橫行正中切口，切口長約l-2cm，充分顯露肝臟，。再將小鼠肝臟重新放回小鼠腹腔內(nèi)，注意觀察有無出血情況的發(fā)生。用O號絲線分別縫合腹膜和腹壁。用酒精棉球擦去小鼠切口處血液，防止小鼠咬破切口處縫線。術(shù)后將假手術(shù)組小鼠放回鼠籠，并置于燈光下促進(jìn)小鼠蘇醒。保持室內(nèi)溫度于25°C-30°C，并給與自由進(jìn)食水，觀察小鼠的存活狀態(tài)。
[0024]4、生化指標(biāo)的檢測
[0025]取得的血液在3500r/min，離心1min，血清測ALT，AST，總蛋白和白蛋白；取一小部分肝稱重，用_4°C的鹽水勻漿，按說明書的方法測S0D、MDA、N0。另取部分肝組織用10%福爾馬林固定后，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。
[0026]5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0027]如圖1a-圖lg，圖2a_圖2g所示，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，ALT，AST，GLU，TG，CHOL，HDL，LDL等定量差異比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0028]以上對本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.古日古木-13在促進(jìn)肝再生上的應(yīng)用。2.古日古木-13影響肝再生作用機(jī)制的評價(jià)方法，其特征在于:包括以下步驟:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(I )C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后，隨機(jī)分為12組，每組5只，分為PH手術(shù)-古日古木高劑量組，PH手術(shù)-古日古木中劑量組，PH手術(shù)-古日古木低劑量組，PH手術(shù)-溶劑對照組，假手術(shù)-古日古木高劑量組，假手術(shù)-古日古木中劑量組，假手術(shù)-古日古木低劑量組，假手術(shù)-溶劑對照組，和空白對照-古日古木高劑量組，空白對照-古日古木中劑量組，空白對照-古日古木低劑量組，空白對照-溶劑對照組； (2)對PH手術(shù)組的小鼠進(jìn)行經(jīng)典的70%肝大部切除術(shù)，假手術(shù)組采用剖腹探查術(shù)，空白對照組不進(jìn)行手術(shù)處理； (3)待小鼠蘇醒恢復(fù)后對所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按分組給古日古木高、中、低劑量試劑和溶劑，每天I次； (4)灌胃第1、3、5、7、9天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)后分別斷頭取血，并完整切取小鼠肝臟并稱重； (5)取一小部分肝稱重，用-4°C的鹽水勻漿，按說明書的方法測SOD、MDA、NO，另取部分肝組織用10%福爾馬林固定后，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢測； (6)檢測血請中各種生化指標(biāo)、細(xì)胞因子的表達(dá)情況、計(jì)算肝指數(shù)、觀察小鼠肝臟細(xì)胞的增殖、凋亡和分化的情況； 細(xì)胞實(shí)驗(yàn):同時(shí)分別用不同劑量的蒙藥古日古木-13處理肝癌細(xì)胞HepG2，觀察其對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。
【文檔編號】A61K35/32GK105998616SQ201610447439
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】張海峰, 邊浩
【申請人】張海峰