專(zhuān)利名稱：靶向?qū)巳烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用人乙型肝炎病毒很的的嗜肝細(xì)胞特性和擁有肝細(xì)胞特異的基因表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，通過(guò)基因重組技術(shù)，將人乙型肝炎病毒改建成病毒基因載體，攜帶目的基因，從而生產(chǎn)出靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物的生產(chǎn)方法。
人類(lèi)所有的疾病都是基因受損所致，基因治療將帶來(lái)人類(lèi)疾病的治療史上的一次革命，而基因工程藥物的研制、生產(chǎn)已經(jīng)成為全球投資大熱門(mén)。截止1998年1月11日，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)218項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)方案。其中189項(xiàng)應(yīng)用載體基因治療項(xiàng)目中，逆轉(zhuǎn)錄病毒(107項(xiàng))仍是最常用的載體，而脂質(zhì)體(327項(xiàng))和腺病毒(27項(xiàng))居次，裸DNA(脫氧核糖核酸)也已開(kāi)始應(yīng)用。但是，它們對(duì)作為靶細(xì)胞的人體細(xì)胞都不具有高度靶向選擇性和高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)目的基因的性能。而且，逆轉(zhuǎn)錄病毒有插人突變及激活癌基因的危險(xiǎn)，腺病毒也存在引起宿主體液免疫和細(xì)胞免疫的副作用。
本發(fā)明的目的是提供一種利用人乙型肝炎病毒很好的嗜人肝細(xì)胞特性和擁有肝細(xì)胞特異的基因表達(dá)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，通過(guò)基因重組技術(shù)，將人乙型肝炎病毒構(gòu)成可全身應(yīng)用，對(duì)人肝細(xì)胞具有高度靶向選擇性、高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)目的基因的載體，攜帶目的基因，如腫瘤抑制基因P16基因、凝血因子Ⅷ基因、凝血因子Ⅸ基因，低密度脂蛋白(LDL)受體基因等。從而生產(chǎn)出靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物的方法。
為上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是將目的基因插入到已經(jīng)克隆的人乙型肝炎病毒基因組的多聚酶(pol)基因開(kāi)放讀碼框架的tether區(qū)，構(gòu)成重組乙型肝炎的病毒基因單體，再通過(guò)分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)，使該重組基因單體兩端為限制性內(nèi)切酶ECORⅠ識(shí)別位點(diǎn)(ECORⅠ-ECORⅠ)，最后，將兩個(gè)ECORⅠ-ECORⅠ單體頭尾串聯(lián)后，克隆到病毒基因表達(dá)載體質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞后，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，就可以大量收獲到基因組中含有目的基因的完整的重組人乙型肝炎病毒顆粒，其具體步驟是
一、克隆人乙型炎病毒全基因1、從乙型肝炎病毒陽(yáng)性血清中提純乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)2、以HBVDNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)特異擴(kuò)增乙型肝炎病毒全基因；3、用合適的限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，將乙型肝炎病毒全基因插入質(zhì)粒載體；4、轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿菌，培養(yǎng)后選取陽(yáng)性克隆。
二、特異擴(kuò)增用于基因治療的目的基因，如腫瘤抑制基因P16基因，凝血因子Ⅷ基因，凝血因子Ⅸ基因，低密度脂蛋白(LDL)受體基因等。
1、從人組織細(xì)胞中提純總RNA(總核糖核酸)，以此為模板逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)；2、以CDNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)特異擴(kuò)增目的基因，并使其兩端帶上限制性內(nèi)切酶BstEⅡ的識(shí)別位點(diǎn)，以便于將目的基因插入乙型肝炎病毒(HBV)基因中；三、基因重組乙型肝炎病毒(HBV)基因和目的基因1、用限制性內(nèi)切酶BstEⅡ分別消化、切開(kāi)HBV基因和目的基因；2、用DNA連接酶，使目的基因插入到HBV基因組中的多聚酶(pol)基因開(kāi)放讀碼框架的tether區(qū)的BstEⅡ位點(diǎn)中，位于前外膜蛋白(S蛋白)基因(pres1)啟動(dòng)子下游，構(gòu)成重組HBV基因單體；3、再用限制性內(nèi)切酶ECORⅠ和DNA連接酶，使帶有目的基因的重組HBV基因單體兩端為限制性內(nèi)切酶ECORⅠ識(shí)別位點(diǎn)(ECORⅠ-ECORⅠ)，并且將兩個(gè)(ECORⅠ-ECORⅠ)單體頭尾串聯(lián)；四、重組人乙型肝炎病毒的表達(dá)、純化1、用限制性內(nèi)切酶ECORⅠ和DNA連接酶，使ECORⅠ-ECORⅠ串聯(lián)體插入到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體PT7-1的ECORⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建重組乙型肝炎病毒表達(dá)質(zhì)粒；2、將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿菌BL21(DE3)中，培養(yǎng)后選取陽(yáng)性克隆并提純；
3、純化的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞；4、從細(xì)胞培養(yǎng)液中，提純基因組中含有目的基因的完整的重組人乙型肝炎病毒顆粒；5、真空冷凍干燥，靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物，置2-8℃貯藏備用。
采用本發(fā)明生產(chǎn)的靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物，具有以下優(yōu)點(diǎn)一、各類(lèi)肝臟疾病十分常見(jiàn)，對(duì)人類(lèi)健康危害極大，尤其我國(guó)是“肝病大國(guó)”，因此，為他們的防治提供高效基因工程藥物，將具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。如1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌全世界每年新發(fā)現(xiàn)病人約26萬(wàn)例，其中我國(guó)就有11萬(wàn)例，并且每年死亡人數(shù)高達(dá)10萬(wàn)以上。
2、病毒性肝炎全世界大約20億感染乙型肝炎病毒，其中有35億為慢性感染，另有1億感染丙型肝炎病毒。我國(guó)現(xiàn)有乙型肝炎病人2800萬(wàn)人，每年新增病人約250萬(wàn)人，1.2億以上的人為乙型肝炎病毒攜帶者。
3、肝臟代謝性遺傳性疾病如苯丙酮酸尿癥(發(fā)病率為1/16000新生兒)，血友病(發(fā)病率為6/100萬(wàn))，家族性高膽固醇血癥(低密度脂蛋白受體缺乏癥)等等。
二、很好地解決了目前基因治療的關(guān)健性難題--不能將目的基因特異性地靶向?qū)肴烁渭?xì)胞，由于乙型肝炎病毒大蛋白(L-蛋白)中，含有聚合人血清蛋白受體(PHSA)和肝細(xì)胞受體識(shí)別序列，而人肝細(xì)胞膜也有PHSA。這樣，人血液中的血清白蛋白與乙型肝炎病毒結(jié)合后，又能再與人肝細(xì)胞膜結(jié)合，使得乙型肝炎病毒特異地與人肝細(xì)胞結(jié)合，決定了它的嗜人肝細(xì)胞的特性。而基因重組乙型肝炎病毒仍然具有人血清白蛋白受體和肝細(xì)胞受體識(shí)別序列，仍然具有很好地嗜人肝細(xì)胞特性，能將目的基因靶向?qū)肴烁渭?xì)胞中，并整合到人基因組上。
三、很好地解決了目前基因治療無(wú)法持續(xù)高效表達(dá)目的基因，治療費(fèi)用高而療效低的問(wèn)題。
以往基因治療的目的基因僅僅只能在體內(nèi)短暫表達(dá)，而基因重組乙型肝炎病毒中目的基因的表達(dá)，受乙型肝炎病毒Core-Pd基因表達(dá)啟動(dòng)子、Pres基因表達(dá)啟動(dòng)子、以及基因表達(dá)增強(qiáng)子的調(diào)控，能高效表達(dá)目的基因，同時(shí)基因重組乙型肝炎病毒仍然能在人肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，復(fù)制合成的子代基因重組乙型肝炎病毒又能重復(fù)特異感染其他的肝細(xì)胞。因此，僅需要很少量的(即低滴度)基因重組乙型肝炎病毒，就可以持續(xù)高效表達(dá)目的基因，使普通民眾都能享受到高效的基因治療。
四、很好地解決了目前基因治療存在的安全性問(wèn)題1、目前基因治療過(guò)程中，將病人從未接觸過(guò)的逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒成份引入到人體內(nèi)，有引起插入突變和免疫反應(yīng)等危險(xiǎn)，而用乙型肝炎病毒作基因治療載體，治療肝癌和肝炎等疾病就不存在這些危險(xiǎn)。
2、目前基因治療過(guò)程中通常是將人肝細(xì)胞取出，在體外導(dǎo)入目的基因，然后植入肝臟內(nèi)，使患者受到了多次組織損傷，并有感染其它微生物的危險(xiǎn)。而基因重組乙型肝炎病毒通過(guò)自然感染過(guò)程(如針刺患者手指，耳垂或者直接靜脈注射)，進(jìn)入人體，然后在體內(nèi)將目的基因靶向?qū)敫渭?xì)胞，完成治療過(guò)程。
下面結(jié)合腫瘤抑制基因P16與乙型肝炎病毒基因重組，生產(chǎn)特異性抗肝癌基因工程藥物的實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例一、采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Cherin Reaction,PCR)特異擴(kuò)增克隆人乙型肝炎病毒全基因1、準(zhǔn)備PCR模板--乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV DNA)的提取①、100ul HBV陽(yáng)性血清，加300ul TES(10m M/L Tris-HCl,PH8.0,5mM/L EDTA,0.5％SDS,50ug蛋白酶K)②、混勻后，65℃水浴3小時(shí)；③、加入等體積的酚/氯仿，劇烈振蕩；④、15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘；⑤、取上層液相，加入1/10體積的3M/L醋酸鈉和2倍體積的冷無(wú)水乙醇；⑥、混勻后，置-70℃3小時(shí)；⑦、15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘；⑧、棄上清，低溫真空干燥沉淀物3分鐘；⑨、加入20ul TES(10M M/L Tris-HCl,1mM/LEDTA)，溶解沉淀的HBV DNA，待用；2、PCR擴(kuò)增人乙型肝炎病毒基因①全自動(dòng)核酸合成儀人工合成4條PCR引物，引物核苷酸序列如下引物P1含SpeⅠ酶切位點(diǎn)5＇--GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTG-3＇SepⅠ引物P2含SpeⅠ酶切位點(diǎn)5＇--CACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCC-3＇SepⅠ引物S1含SalⅠ和SapⅠ酶切位點(diǎn)5＇--CCGGCGTCGACGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3＇SalⅠSapⅠ引物S2含SalⅠ和SapⅠ酶切位點(diǎn)5＇--CCGGCGTCGACGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3＇SalⅠSapⅠ②、取兩個(gè)PCR反應(yīng)管，分別標(biāo)上反應(yīng)管1和反應(yīng)管2③、反應(yīng)管1總反應(yīng)體積100ul，含下列成分引物S1100PM/L引物P2100PM/LdATP0.2mM/LdGTP0.2mM/LdCTP0.2mM/LdTTP0.2mM/LMgCl21.5mM/L
10×PCR緩沖液 10ulTaqDNA聚合酶2.5UPCR模板(HBVDNA) 10ul④、反應(yīng)管2與反應(yīng)管1只是引物不同，其它完全一樣，它的引物是引物S2和引物P1；⑤、將反應(yīng)管1和反應(yīng)管2同時(shí)放入PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件設(shè)定為94℃4分鐘后，94℃50秒、50℃90秒、72℃90秒一個(gè)循環(huán)，30個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸10分鐘；⑥、用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、將人乙型肝炎病毒基因插入到質(zhì)粒載體PUC19中。
①、取2個(gè)1.5ml離心管，分別標(biāo)上1和2，離心管1用限制性內(nèi)切酶酶切乙型肝炎病毒基因，離心管2用同樣的內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒PUC19；②、離心管1反應(yīng)總體積20ul含無(wú)菌去離子水 14.8ul10×酶切緩沖液2ul乙酰化牛血清白蛋白 0.2ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物2ug2ul限制性內(nèi)切酶SalⅠ 0.5ul限制性內(nèi)切酶SpeⅠ 0.5ul混勻后37℃水溶2小時(shí)③、離心管2反應(yīng)總體積20ul含無(wú)菌去離子水 16.3ul10×酶切緩沖液2ul乙酰化牛血清白蛋白 0.2ul質(zhì)粒Puc191ul 1ug限制性內(nèi)切酶SalⅠ 0.5ul混勻后37℃水溶2小時(shí)④、用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳純化離心管1和2的酶切物(HBVDNA和PUC19)；
⑤、用T4DNA連接酶使HBVDNA插入到PUC19的SalⅠ酶切位點(diǎn)、反應(yīng)總體積20ul，含無(wú)菌去離子水 15.5ulHBVDNA(已酶切純化) 1ug/1ulPUC19(已酶切純化)0.55ug/1ulL0×連接緩沖液 2ulT4DNA連接酶 0.5ul混勻后，16℃溫溶過(guò)夜；⑥、按常規(guī)方法，將HBVDNA與PUC19連接混合物轉(zhuǎn)化到工程菌大腸桿菌JM109中；⑦、按常規(guī)方法，提取質(zhì)粒DNA，用酶切法及核苷酸自動(dòng)測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，并大量收獲PUC-HBV。
二、PCR擴(kuò)增目的基因-腫瘤抑制基因，并使其兩端帶上BstEⅡ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
1、用美國(guó)Promega公司總RND(總核糖核酸)分離試劑盒，按其說(shuō)明書(shū)載明的方法，從培養(yǎng)的Hela細(xì)胞中提取總RNA；2、用美國(guó)MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按其說(shuō)明書(shū)載明的方法，以總RNA為模板合成CDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)第一鏈；3、PCR特異擴(kuò)增腫瘤抑制基因P16CDNA①、PCR引物用自動(dòng)核酸合成儀合成，其核苷酸序列如下16A:5＇--GGGGTCACCATGGAGCCGGCGGCGGGGA-3＇BstEⅡ16B＇:5＇--GGGGTCACCATCGGGGATGTCTGAGGA-3＇BstEⅡ②、PCR反應(yīng)總體積為100ul含CDNA(PCR模板) 1ug引物16A 100PM/L引物16B 100PM/LDATP 0.2mM/L
dGTP 0.2mM/LdCTP 0.2mM/LdTTP 0.2mM/LMgCl21.5mM/L10×PCR反應(yīng)緩沖液10ulTaq DNA聚合酶2U混勻后，97℃變性8分鐘，然后，95℃變性60秒，52℃退火90秒，72℃延伸90秒，這樣即為一個(gè)循環(huán)，28個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸10分鐘；③、用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物，即P16CDNA三、基因重組乙型肝炎病毒基因(PUC-HBV)和腫瘤抑制基因，即將P16CDNA插入到PUC-HBV中的BstEⅡ酶切位點(diǎn)①、BstEⅡ分別酶切P16CDNA和PUC-HBV，反應(yīng)條件如下總體積20ul，含無(wú)菌去離子水 17ul10×酶切緩沖液2ul待酶切DNA1ug 1ulBstEⅡ酶5U5U混勻后，37℃水浴2小時(shí)②、用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳純化酶切產(chǎn)物③、T4DNA連接酶連接酶切后的P16CDNA和PUC-HBV，重組成PUC-HBVP16，反應(yīng)總體積20ul，含無(wú)菌去離子水15.5ulP16CDNA 1ul(1ug)PUC-HBV 1/ul(1ug)10×連接緩沖液 2ulT4DNA連接酶 0.5ul混勻后，16℃溫溶過(guò)夜；⑥、按常規(guī)方法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到工程菌大腸桿菌JM109中；
⑦、按常規(guī)方法，提取質(zhì)粒酶切鑒定和核苷酸自動(dòng)測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，并大量收獲PUC-HBVp16；四、將基因重組乙型肚炎病毒基因(即HBVp16)插入到真核表達(dá)載體質(zhì)粒PT7-1的限制性內(nèi)切酶ECORⅠ中，構(gòu)建基因表達(dá)質(zhì)粒PT7-(HBVp16)2，即HBVp16基因單體頭尾串聯(lián)成2倍體。
1、使HBVp16兩端為ECORⅠ酶切位點(diǎn)(1)、從質(zhì)粒PUC-HBVp16中，用限制性內(nèi)切酶SapⅠ酶切取下完整的HBVp16基因，反應(yīng)總體積20ul含無(wú)菌去離子水 15ul10×酶切緩沖液2ulPUC-HBVp162ul(2ug)SapⅠ1ul(1u)混合后，37℃水浴2小時(shí)②、用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳純化酶切產(chǎn)物(即HBVp16)③、T4DNA連接酶連接酶切后的HBVp16自我連接環(huán)化，反應(yīng)總體積50ul含線狀HBVp16 10ul(50ug)10×連接緩沖液5ul50％PEG4000 5ul無(wú)菌去離子水 29ulT4DNA連接酶 1ul混勻后，22℃水浴1小時(shí)④、用限制性內(nèi)切酶ECORⅠ分別酶切環(huán)狀HBVp16和質(zhì)粒PT7-1使它們兩端都為ECORⅠ酶切位點(diǎn)，反應(yīng)總體積20ul，含無(wú)菌去離子水 16.3ul1×酶切緩沖液 2ul乙?；Ｑ灏椎鞍?.2ul(2ug)HBVp16或PT7-1 1ul(1ug)ECORⅠ0.5ul(5U)
⑤、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳純化酶切產(chǎn)物2、用T4DNA連接酶將HBVp16插入PT7-1的ECORⅠ酶切位點(diǎn)反應(yīng)總體積20ul含無(wú)菌去離子水16.5ulHBVp16 1ul(1ug)PT7-1 1ul(0.5ug)10×連接緩沖液 2ulT4DNA連接酶0.5ul(2U)混勻后，22℃溫浴3小時(shí)3、按常規(guī)方法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到工程菌大腸桿菌BL21(DE3)中；4、按常規(guī)方法，提取質(zhì)粒酶切鑒定和核苷酸自動(dòng)測(cè)序鑒定，收獲陽(yáng)性克隆，即含質(zhì)粒PT7-(HBVp16)2的克隆，并大量收獲基因表達(dá)質(zhì)粒PT7-(HBVp16)2備用。
五、構(gòu)建生產(chǎn)抗肝癌基因工程藥物的細(xì)胞株，而質(zhì)粒PT7-(HBVp16)2轉(zhuǎn)染人HepG2細(xì)胞1、人HepG2細(xì)胞培養(yǎng)MEM Eagle培養(yǎng)基(含10mM碳酸氫鈉、2mML-谷氨酸、10％胎牛血清，50u/ml青霉素G鈉，0.01mg/ml鏈霉素和5u/ml制霉素)，培養(yǎng)條件37℃5％CO2培養(yǎng)箱20小時(shí)。
2、磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，采用美國(guó)promega公司的proFectiln哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，操作按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
3、收獲并純化抗肝癌的基因工程藥物，即含腫瘤抑制基因P16的基因重組乙型肝炎病毒。
①、收獲培養(yǎng)四天后的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液；②、4℃，5000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘；③、上清液加到25％蔗糖溶液上(含50mM Tris-HCl,PH8.0,150mM NaCl,10mM EDTA)④、4℃,SW41水平離心轉(zhuǎn)頭，150000g離心10小時(shí)。
⑤、沉淀重懸于50mM Tris-HCl,PH7.5,150mMNaCl和10mMEDTA的液體中；⑥、加入6mM MgCl2,100ug/ml DNaseⅠ，混勻后37℃,30分鐘；⑦、加入1/3體積的26％PEG8000,1.4mM NaCl,25mMEDTA,4℃15000g離心10小時(shí)；⑧、收獲基因重組的乙型肝炎病毒，真空冷凍干燥，即生產(chǎn)出了特異性抗肝癌的基因工程藥物，貯藏于4℃-8℃。
權(quán)利要求
1.靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物的生產(chǎn)方法，其特征是將目的基因插入到已經(jīng)克隆的人乙型肝炎病毒基因組的多聚酶(pol)基因開(kāi)放讀碼框架的tether區(qū)，構(gòu)成重組乙型肝炎的病毒基因單體，再通過(guò)分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)，使該重組基因單體兩端為限制性內(nèi)切酶ECORⅠ識(shí)別位點(diǎn)(ECORⅠ-ECORⅠ)，最后，將兩個(gè)ECORⅠ-ECORⅠ單體頭尾串聯(lián)后，克隆到病毒基因表達(dá)載體質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞后，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，就可以大量收獲到基因組中含有目的基因的完整的重組人乙型肝炎病毒顆粒，其具體步驟是(1)克隆人乙型炎病毒全基因a、從乙型肝炎病毒陽(yáng)性血清中提純乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)B、以HBVDNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)特異擴(kuò)增乙型肝炎病毒全基因；c、用合適的限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，將乙型肝炎病毒全基因插入質(zhì)粒載體；d、轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿菌，培養(yǎng)后選取陽(yáng)性克隆。(2)、特異擴(kuò)增用于基因治療的目的基因，如腫瘤抑制基因P16基因、凝血因子Ⅷ基因、凝血因子Ⅸ基因、低密度脂蛋白(LDL)受體基因等。a、從人組織細(xì)胞中提純總RNA(總核糖核酸)，以此為模板逆轉(zhuǎn)承合成CDNA(互補(bǔ)脫氧核糖核酸)；b、以CDNA為模板，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)特異擴(kuò)增目的基因，并使其兩端帶上限制性內(nèi)切酶BstEⅡ的識(shí)別位點(diǎn)，以便于將目的基因插入乙型肝炎病毒(HBV)基因中；(3)、基因重組乙型肝炎病毒(HBV)基因和目的基因a、用限制性內(nèi)切酶BstEⅡ分別消化，切化HBV基因和目的基因；b、用DNA連接酶，使目的基因插入到HBV基因組中的多聚酶(pol)基因開(kāi)放讀碼框架的tether區(qū)的BstEⅡ位點(diǎn)中，位于前外膜蛋白(S蛋白)基因(pres1)啟動(dòng)子下游，構(gòu)成重組HBV基因單體；c、再用限制性內(nèi)切酶ECORⅠ和DNA連接酶，使帶有目的基因的重組HBV基因單體兩端為限制性切酶ECORⅠ識(shí)別位點(diǎn)(ECORⅠ-ECORⅠ)，并且將兩個(gè)(ECORⅠ-ECORⅠ)單體頭尾串聯(lián)；(4)、重組人乙型肝炎病毒的表達(dá)，純化a、用限制性內(nèi)切酶ECORⅠ和DNA連接酶，使ECORⅠ-ECORⅠ串聯(lián)體插入到真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體DT7-1的ECORⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建重組乙型肝炎病毒表達(dá)質(zhì)粒；b、將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌大腸桿菌EL21(DE3)中，培養(yǎng)后選取陽(yáng)性克隆并提純；c、純化的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞；d、從細(xì)胞培養(yǎng)液中，提純基因組中含有目的基因的完整的重組人乙型肝炎病毒顆粒；f、真空冷凍干燥，得靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物，置2-8℃貯藏備用。
全文摘要
靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物的生產(chǎn)方法,其將目的基因插入克隆的人乙肝病毒基因組的多聚酶基因開(kāi)放讀碼框架tether區(qū),構(gòu)成重組乙肝的病毒基因單體,再通過(guò)生物學(xué)常規(guī)技術(shù),使該重組基因單體兩端為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn);單體頭尾串聯(lián)后,克隆到病毒基因表達(dá)載體質(zhì)粒中,并轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞后,從上清液中收獲含有目的基因的完整的重組人乙肝病毒顆粒。利用本發(fā)明生產(chǎn)的靶向?qū)肴烁渭?xì)胞的高效基因工程藥物,具有對(duì)人肝細(xì)胞的嗜性和在人肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力,低劑量就可以進(jìn)行靶向基因治療肝臟疾病,安全高效。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1313385SQ0011331
公開(kāi)日2001年9月19日 申請(qǐng)日期2000年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月9日
發(fā)明者李玉波 申請(qǐng)人:李玉波