低表達(dá)或不表達(dá)perv的肝細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，尤其設(shè)及一種低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)今，重型肝炎、肝衰竭W及肝癌是我國肝病死亡的主要原因，肝移植是治療此類 疾病最有效的方法。但是，人類同種器官移植供體卻早已日益短缺，大多患者在等待器官 供體的過程中喪失生命。尋找肝衰竭患者在肝移植前替代手段成為重中之重。生物人工 肝度AL)是目前國內(nèi)外公認(rèn)的最接近自然肝臟，功能也最全面的人工肝臟支持系統(tǒng)。生物 人工肝由反應(yīng)器和細(xì)胞材料組成，肝細(xì)胞是整個(gè)生物人工肝系統(tǒng)的核屯、材料。在生物人工 肝領(lǐng)域中，因豬解剖、生理特點(diǎn)與人類相似，豬細(xì)胞來源廣泛，經(jīng)濟(jì)適用，因此目前應(yīng)用最多 的生物部分是豬肝臟細(xì)胞。但目前已知，作為異種細(xì)胞豬肝細(xì)胞內(nèi)存在著豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄 病毒（porcineendogenousretrovirus,陽RV)，有引起生物人工肝治療患者陽RV感染的危 險(xiǎn)。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、假型實(shí)驗(yàn)和感染性實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)PERV可W感染人源細(xì)胞。 陽00引陽RV是一種RNA病毒，其前DNA整合到豬的基因組中。它在豬的基因組中多拷貝 而且與mRNA的表達(dá)量在不同豬種有很大的差異?，F(xiàn)有的PERV減活或消除手段都未能很好 地降低PERV的感染風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞 的制備方法。 陽0化]為達(dá)到W上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法，其包括W下步驟：
[0007] (1)分別制備含有應(yīng)用于RNA干擾技術(shù)的SiRNA的重組載體、應(yīng)用于CRIPRS/Cas9 技術(shù)的曲NA的重組載體和含有應(yīng)用于所述CRIPRS/Cas9技術(shù)的化s9的載體；
[0008] (2)將所述=種載體共同轉(zhuǎn)染至豬體細(xì)胞，培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的豬體細(xì)胞，篩選并鑒 定W獲得單克隆轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞；
[0009] (3)利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得含有所述轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞的核基因的轉(zhuǎn)基因豬；
[0010] (4)提取所述轉(zhuǎn)基因豬的肝細(xì)胞。
[0011] 優(yōu)選地，所述含有SiRNA的重組載體、含有曲NA的重組載體和含有化s9的載體W 1 :1 :1的比例混合W進(jìn)行共同轉(zhuǎn)染。
[0012] 進(jìn)一步地，所述SiRNA根據(jù)陽RV基因的編碼區(qū)POl和gag片段進(jìn)行設(shè)計(jì)。
[0013] 優(yōu)選地，用于將所述SiRNA轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞的載體為PsiIencerf. I-Hl-Neo。
[0014] 更進(jìn)一步地，所述曲NA的序列為SEQNo. 1所示。所述曲NA的PCR引物的序列為 沈QNo. 2和沈QNo. 3所示。
[0015] 再進(jìn)一步地，用于將所述曲NA轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞的載體為U6-gRNA。
[0016] 優(yōu)選地，所述含有化s9的載體為pCMV-hCAS9。
[0017] 優(yōu)選地，所述豬體細(xì)胞為豬胚胎成纖維細(xì)胞。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0019] (1)本發(fā)明的低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法，通過RNA干擾技術(shù)和 CRIPRS/tas9技術(shù)相結(jié)合，既抑制了PERV的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，又實(shí)現(xiàn)了對(duì)PERV的轉(zhuǎn)錄前敲除，有 效降低了轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞的PERV的活性；
[0020] 似本發(fā)明的低表達(dá)或不表達(dá)陽RV的肝細(xì)胞的制備方法，對(duì)陽RV的保守編碼區(qū)進(jìn) 行重組載體的設(shè)計(jì)，幾乎實(shí)現(xiàn)完全沉默，由此可W應(yīng)用于不同品種的豬種，增加了可提供異 源肝細(xì)胞的豬的品種； 陽02U (3)本發(fā)明的低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法，將S種質(zhì)粒載體共同轉(zhuǎn) 染到目標(biāo)細(xì)胞，節(jié)約了轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞的制備時(shí)間，提高了轉(zhuǎn)基因豬體細(xì)胞的制備效率；
[0022] (4)本發(fā)明的低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法所獲得的轉(zhuǎn)基因豬因其 自身的PERV具有低表達(dá)或不表達(dá)的特性，該轉(zhuǎn)基因豬的其他細(xì)胞、組織或器官都可W用于 作為人的異源供體。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)陽RV的肝細(xì)胞的制備方法中含有SiRNA的重組載 體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖2為圖1所示的載體的酶切鑒定結(jié)果示意圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法中用于連接曲NA的載體 的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 圖4為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法中所使用的化s9載體的 結(jié)構(gòu)不意圖。
[0027] 圖5為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法中單克隆轉(zhuǎn)基因豬體細(xì) 胞的PERV基因序列檢測(cè)結(jié)果，其中樣品號(hào)為P2-2。
[0028] 圖6為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法中單克隆轉(zhuǎn)基因豬體細(xì) 胞的PERV基因序列檢測(cè)結(jié)果，其中樣品號(hào)為P2-3。
[0029] 圖7為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法中單克隆轉(zhuǎn)基因豬體細(xì) 胞的PERV基因序列檢測(cè)結(jié)果，其中樣品號(hào)為P2-6。
[0030] 圖8為本發(fā)明低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法中單克隆轉(zhuǎn)基因豬體細(xì) 胞的PERV基因序列檢測(cè)結(jié)果，其中樣品號(hào)為P2-9。
【具體實(shí)施方式】
[0031] W下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0032] 本發(fā)明的低表達(dá)或不表達(dá)PERV的肝細(xì)胞的制備方法包括W下步驟：
[0033] 一、重組載體的設(shè)計(jì)與制備
[0034] (1)制備應(yīng)用于RNA干擾的重組載體 W35]RNA干擾（RNAinterference,RNAU是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。
[0036] 病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并 利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)運(yùn)些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其 胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(大約 21~23bp)，即siRNA。SiRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由 反義SiRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù) 合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū) 進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與SiRNA中 反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)運(yùn)些mRNA 的降解反應(yīng)。SiRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與祀RNA結(jié)合并 在RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合 成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)SiRNA,從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將 祀mRNA完全降解。
[0037] 所謂RNAi技術(shù)，就是人們?cè)谡婧思?xì)胞中引入針對(duì)特定基因的SiRNA,便可W特異 性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)所述特定基因的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。
[0038] 針對(duì)本發(fā)明所設(shè)及的PERV基因，查文獻(xiàn)獲得針對(duì)PERV編碼區(qū)POl和gag片段，設(shè) 計(jì)并篩選出四個(gè)干擾PERV表達(dá)相對(duì)高效的SiRNA,使用RNAi軟件，針對(duì)篩選到的SiRNA合 成shRNA并加入折疊序列的編碼DNA序列，四個(gè)片段分別為：gagl、gag4、pol2、pol3 ;每個(gè) 片段分別對(duì)應(yīng)連接一個(gè)啟動(dòng)子，連接后的長片段為gagl-Hl-gag4-h7sk-pol2-mU6-pol3,其 中Hl、h7sk和mU6分別為啟動(dòng)子。所述長片段兩端再連入化ndIII和BamhI酶切位點(diǎn)，連 入Psilencer3.I-Hl-Neo載體，最后得到如圖 1 所示的Psilencer3. 1-Hl-Neo-shRNA重組 載體。
[0039] 進(jìn)一步地，所述Psilencer3. 1-Hl-Neo-shRNA重組載體的酶切鑒定體系如下：
[0040] 質(zhì)粒IulHind III化如1 BamhI0. nuT Buffer Iul Water了地
[0041] 若鑒定結(jié)果出現(xiàn)如圖2所示的條帶，證明所述Psilencer3. 1-Hl-Neo-shRNA重組 載體構(gòu)建成功。 陽0創(chuàng) 似分別制備應(yīng)用于CRIPRS/化s9的曲NA重組載體和化s9載體
[0043]CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是 一種來自細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制。在細(xì)菌及古細(xì)菌中， CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中I類和III類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮 作用，