專利名稱：應(yīng)答H₂O₂的miRNA-397及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)答H2O2的miRNA-397及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
過氧化氫(H2O2)是一種雙功能分子，在植物體內(nèi)起雙重作用，既是一種毒性分子 能導(dǎo)致細胞氧化損傷，又是一種信號分子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用(Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. ,2002,7 405-410.； Mittler R, Vanderauwera S, Gollery Μ, Breusegem F V. Reactiveoxygen gene network of plants. Trends Plant Sci. ,2004,9 =490-498.) H2O2 的雙功能性決定了植物體內(nèi)必 然存在著H2O2相關(guān)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，使它的濃度處于相對穩(wěn)態(tài)。在H2O2引起氧化脅迫的條件 下，網(wǎng)絡(luò)中許多基因或蛋白都會對H2O2產(chǎn)生應(yīng)答，自身的表達發(fā)生變化從而影響植物多種 生理活動，最終使植物對H2O2脅迫產(chǎn)生適應(yīng)。目前，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)已經(jīng)揭示 出植物中相當(dāng)多的應(yīng)答H2O2的基因和蛋白，主要集中在細胞防御、氧化還原平衡等功能 (Vanderauwera S，Van Der Kelen K，Dat J，Gadjev I，Boonefaes T，Morsa S，Rottiers P，Slooten L，Van Montagu M，ZabeauM. et al. A comprehensive analysis of hydrogen peroxide-regulated geneexpression in tobacco.Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2003，100 16113-16118. ；Wan X Y,Liu J Y. Comparative proteome analysis reveals an intimate proteinnetwork provoked by hydrogen peroxide stress in rice seedling leaves. Mol. CellProteomics，2008，7 1469-1488. )。Wan等通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出144個 在H2O2處理的水稻幼苗葉片中差異表達的蛋白，這些蛋白大多與細胞防御、氧化還原平衡、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白合成和降解、光合成和光呼吸以及能量代謝相關(guān)，通過這些差異表達的蛋白 以及它們的功能和參與的生理過程，構(gòu)建了水稻幼苗應(yīng)答H2O2的蛋白網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)闡明了 水稻幼苗葉片通過提高抗氧化相關(guān)蛋白的表達和抑制代謝相關(guān)蛋白的表達來適應(yīng)氧化脅 迫(Wan X Y, Liu J Y. Comparative proteome analysis revealsan intimate protein network provoked by hydrogen peroxide stress in riceseedling leaves. Mol. Cell Proteomics,2008,7 :1469_1488.)。miRNA(microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內(nèi)源單鏈非編碼小分子 RNA，在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年來大量研究表明，miRNA參與調(diào)控植物生長 發(fā)育以及應(yīng)答生物和非生物脅迫等許多重要生物學(xué)過程(Bushati N,Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. ,2007, 23 175-205.；金龍國，王川，劉進元.植物 MicroRNA.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2006，22 =609-614.)。因此，有理由相信miRNA — 定在植物應(yīng)答H2O2的過程中起著關(guān)鍵作用。但是，目前的植物應(yīng)答H2O2的相關(guān)研究主要集 中在基因和蛋白，還很少涉及到植物小分子RNA、特別是miRNA領(lǐng)域。植物中是否存在著應(yīng) 答H2O2的miRNA，這些miRNA的作用是什么，目前還沒有明確的答案。尋找和鑒定植物體內(nèi) 應(yīng)答H2O2的miRNA，對于完善植物H2O2相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面解析植物應(yīng)答H2O2的分子機制具有重要意義。水稻不僅是世界最重要的糧食作物之一，同時也是一種重要的模式生物，在植物 研究特別是單子葉植物研究中占有重要地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)答H2O2的miRNA-397及其應(yīng)用。本發(fā)明保護的miRNA-397的序列如下(5，一 3，)UUGAGUGCAGCGUUGAUGAAC (序列表的序列 1)。本發(fā)明還保護序列1所示RNA在抑制漆酶基因(0s05g0458600)表達中的應(yīng)用；所 述漆酶如序列表的序列2所示。所述漆酶基因可如序列表的序列3自5’末端第67至1791 位核苷酸所示。所述漆酶基因也可如序列表的序列3所示。本發(fā)明還保護序列1所示RNA在促進漆酶基因(0s05g0458600)的mRNA降解中的 應(yīng)用；所述漆酶如序列表的序列2所示。所述漆酶基因可如序列表的序列3自5’末端第67 至1791位核苷酸所示。所述漆酶基因也可如序列表的序列3所示。序列表的序列1所示的RNA可用于水稻種質(zhì)改良。本發(fā)明采用國際上先進的Solexa高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析、 Northern雜交、實時定量PCR等多種生物學(xué)手段，首次從基因組水平鑒定到應(yīng)答H2O2的 miRNA-397,并且證實該miRNA在植物體內(nèi)調(diào)控的靶基因。H2O2脅迫下，miRNA-397表達上調(diào) 抑制了木質(zhì)素合成，實際上起到了延緩生長發(fā)育的效果，有利于植株適應(yīng)H2O2脅迫。本發(fā)明 將miRNA-397的表達變化、靶基因的表達變化以及靶基因功能聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)H2O2脅迫下應(yīng) 答H2O2的miRNA-397主要是通過延緩生長發(fā)育來幫助水稻幼苗適應(yīng)氧化脅迫。植物應(yīng)對外 界脅迫條件的有效策略之一是延緩生長發(fā)育，這一措施不僅可以增加能量儲備以更好地抵 御脅迫，還能減少氧化損傷向新生細胞擴散的危險(May MJ, Vernoux Τ, Leaver C，Montagu M V, InzeD. Glutathione homeostasis in plants !implications for environmental sensing and plant development. J. Exp. Bot.，1998,49 649-667.)。本發(fā)明揭示了應(yīng)答H2O2的miRNA-397在植物應(yīng)對氧化脅迫所起的重要作用。將 miRNA-397基因轉(zhuǎn)入水稻中過量表達或?qū)iRNA-397基因缺失，就可能獲得在耐受氧化脅 迫能力方面有明顯變化的轉(zhuǎn)基因植株，并有望通過改造獲得對氧化脅迫、干旱、高鹽等有較 強耐受性的植株，造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。


圖1為Northern雜交檢測不同濃度H2O2處理的水稻幼苗中miRNA-397的表達。圖2為miRNA-397的的靶基因5’ RACE驗證；序列上方的箭頭表示發(fā)生切割的位 點，數(shù)值表示該切點處發(fā)生切割的克隆數(shù)與克隆總數(shù)比值。圖3為實時定量RT-PCR檢測靶基因的表達；誤差桿表示相對標準偏差。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中所用水稻品種均為秈稻品種93_ll(0ryza sativaL. ssp indica cv. 93-11)，水稻種子購自國家農(nóng)作物種質(zhì)保存中心(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，郵 編100081聯(lián)系電話010-68919715)。該水稻品種已經(jīng)由中國北京基因組研究所完成基因
組測序工作。實施例1、miRNA-397的發(fā)現(xiàn)一、H2O2 處理水稻種子經(jīng)表面消毒后，37°C浸泡24h，然后催芽萌發(fā)45h。萌發(fā)后將水稻轉(zhuǎn)移 到光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱條件設(shè)定為溫度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h)，光照強度 400μ mol/m2 · s，相對濕度70%，由Hogland營養(yǎng)液提供水稻生長所需的全部營養(yǎng)，營養(yǎng)液 每2天更換一次。12天齡的水稻幼苗采用H2O2處理分別浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中，將浸泡在蒸餾水中的水稻幼苗作為對照；各種處理的幼苗同時置于25°C搖床中處理 6h。處理完畢后，將各個處理的水稻樣品按0. 5g分裝，液氮速凍后保存于-80°C備用。二、miRNA-397 的發(fā)現(xiàn)1、RNA 提取將水稻樣品在液氮中研磨，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA，操作步驟 按TRIZOL試劑盒自帶的說明書進行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(Amersham Biosciences)測定提取的RNA在260nm(OD26tl)和280nm(OD28tl)波長的吸光度值以確定RNA 的純度和濃度。質(zhì)量合格的RNA濃度應(yīng)在1 μ g/μ 1以上，OD26tZOD28tl的比值在1. 8-2. 0之 間，且經(jīng)電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫的構(gòu)建將質(zhì)量檢驗合格的水稻幼苗總RNA用于構(gòu)建小RNA文庫。3種濃度(0. 6mM、3. OmM 和15. OmDH2O2處理的水稻樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合，總共30 μ g用于構(gòu)建水 稻幼苗H2O2處理的小RNA文庫。對照樣品提取的RNA取30 μ g，用于構(gòu)建水稻幼苗對照小 RNA文庫。小RNA文庫的構(gòu)建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構(gòu)建方 法進行，構(gòu)建好的文庫采用Solexa高通量測序(北京華大基因研究中心)，獲得高質(zhì)量的 18-30nt的小RNA序列(兩個小RNA文庫均獲得了五百多萬條序列)。3、兩個小RNA文庫中應(yīng)答H2O2的miRNA的鑒定參考之前國外文獻對高通量測序數(shù)據(jù)分析的成功方法(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14 :787_799.)，建立一套計算機 分析方法用來發(fā)現(xiàn)和鑒定測序數(shù)據(jù)中的水稻miRNA。①將獲得的兩個小RNA文庫中的 原始序列通過計算機方法去掉3’接頭，并過濾掉序列長度在18nt以下的序列；②通過 SOAP 禾呈序(Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J. SOAP short oligonucleotidealignment program. Bioinformatics, 2008, 24 :713_714.)將序列與水稻 93-11 基因組(http //rice, genomics, org. cn/rice/)進行匹配，保留能與基因組完全匹配的序列，進行后續(xù)分析；③ 將與基因組匹配的序列與國際權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase (http //microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中公布的水稻miRNA成熟序列及前體序列進行BLAST，從而發(fā)現(xiàn)哪些序列來自于已知的水稻miRNA。鑒定出近300個水稻miRNA序列，分屬于100余個miRNA家族。由于高通量測序能給出每個miRNA的測序次數(shù)，通過比較水稻幼苗H2O2處理小RNA 文庫和對照小RNA文庫中miRNA的測序數(shù)(測序數(shù)已經(jīng)根據(jù)小RNA文庫測序總數(shù)進行了標 準化)，可以從中發(fā)現(xiàn)兩個庫中測序數(shù)相差較大的miRNA，這部分miRNA可能就是應(yīng)答H2O2 的miRNA?；诖朔椒?，比較了兩個小RNA文庫中miRNA的測序數(shù)，并采用以下兩個限制條 件來提高發(fā)現(xiàn)應(yīng)答H2O2的miRNA的成功率①miRNA在H2O2處理小RNA文庫或?qū)φ招NA 文庫中測序數(shù)要大于100，從而可以保證比較的可靠性；②miRNA在H2O2處理小RNA文庫和 對照小RNA文庫中測序數(shù)相對差異要大于30%。發(fā)現(xiàn)有7個miRNA家族的測序數(shù)存在顯著 差異，可能是應(yīng)答H2O2的miRNA家族，其中一個為osa_miR397 (miRNA_397 ；miR397)。osa-miR397 的序列如下(5，— 3，) :UUGAGUGCAGCGUUGAUGAAC (序列 1)。H2O2處理小RNA文庫的測序次數(shù)(Qh2q2)為275，對照小RNA文庫(Qw)的測序次 數(shù)為184，相對差異(Qh202A^-I) X 100%為+49. 4%0三、miRNA Northern 雜交為了進一步驗證osa_miR397具有應(yīng)答H2O2的表達模式，采用miRNA Northern雜 交檢測幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. 0,15. 0mM)miRNA的表達情況。1、制備探針檢測osa-miR397 的探針(5，一 3，)的序列GTTCATCAACGCTGCACTCAA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對上述序列末端磷酸基團進行 同位素(Y -32P ATP)標記，得到探針，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針，去 除未標記的同位素，純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中，每個泳道上樣量為20 μ g低分子量RNA，TO基因作為內(nèi)參，與 miRNA在同一張膜上檢測。TO基因的探針序列為TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。(1)分別提取步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。(2)采用 Park 等報道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park W, Li J, Song R, MessingJ， Chen X. CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol.，2002，12 :1484_1495.)從總 RNA 中富 集低分子量RNA (有利于提高miRNA的檢測能力)。(3) miRNA Northern 雜交①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等體積的2 X RNA上樣緩沖液(95%甲 酰胺，18mM EDTA, 0. 1 %溴酚藍和0. 1 %二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉(zhuǎn)移裝置 (BIO-RAD)轉(zhuǎn)移到 Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。③轉(zhuǎn)移有RNA樣品的尼龍膜經(jīng)6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯(lián) (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉(zhuǎn)移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預(yù)雜交2h，然后加入探針，混勻，42°C雜交過夜。⑤雜交結(jié)束后，小心倒出雜交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次，每次IOmin。⑥洗膜結(jié)束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光1 周。⑦曝光結(jié)束后，沖洗X光片，進行光密度掃描，以對照組的雜交信號為1，計算各個 處理組雜交信號的相對強度。結(jié)果見圖1。Northern雜交結(jié)果和測序數(shù)據(jù)很吻合，osa-miR397受H2O2誘導(dǎo)表 達。實施例2、應(yīng)答H2O2的miRNA的靶基因預(yù)測與驗證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補，因此可以通過生物信息學(xué)方法預(yù)測 osa-miR397的靶基因。采用Schwab等描述的方法預(yù)測miRNA的靶基因(Schwab R，Palatnik J F, Riester Μ,Schommer C,Schmid Μ,Weigel D.Specific effects ofmicroRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell, 2005,8 :517_527.)。使用 Patscan程序在水稻 93-11 全長 cDNA和基因庫(http://rice. genomics, org. cn/rice/)中尋找能與miRNA序列近乎完全互 補的cDNA或基因，即為miRNA的靶標；參數(shù)設(shè)置為=Patscan程序參數(shù)為默認設(shè)置，允許最 大錯配數(shù)為3個，miRNA的第10和11位堿基不允許有錯配，靶標的功能通過NCBI (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進行注釋。預(yù)測結(jié)果見表1。表losa-miR397的靶基因及功能
miRNA家族NBb預(yù)測靶基因靶基因功能miR397個0s05g0458600漆酶 (Laccase)注(丨)表示在H2O2處理下表達量上調(diào)；bNB，Northern雜交分析得出的結(jié)果。osa-miR397 的靶標是漆酶(Laccase)基因 0s05g0458600 (GENBANK ACCESS10ΝΝ0. 0s05g0458600，見序列表的序列3 ；編碼序列表的序列2所示的蛋白質(zhì))。漆酶參與植物木 質(zhì)素合成過程。實施例3、miRNA對靶基因mRNA的切割osa-miR397對靶基因0s05g0458600 (見序列表的序列3)mRNA的切割用5，RACE TjfeiHiT^ilH (Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification ofplant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell,2004,14 787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其較為穩(wěn)定的3’切割產(chǎn)物5’端核苷酸磷酸集 團暴露，用T4RNA連接酶在該切割產(chǎn)物5’端連接上5’ RACE專用接頭；通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合 成cDNA ；通過靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進行第一輪PCR，靶基 因特異的巢式內(nèi)引物和試劑盒所帶的巢式內(nèi)引物進行第二輪PCR;將5’RACE獲得的PCR產(chǎn) 物連接到PMD 19-T載體后測序，就能知道精確的靶基因mRNA切割位點。1、分別提取實施例1的步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。2、按Firstchoice RLM-RACE試劑盒(Ambion)操作說明進行5’RACE，靶基因特異 的巢式外引物的序列為CGTAGGGGAGAAGATGGGGACGAT，靶基因特異的巢式內(nèi)引物的序列為 TGTACGGGCGAGCCAGCATGTAGTA。3、PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，回收250bp左右的特異條帶(圖2中泳道1所示)。
4、將回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α (TaKaRa)。5、挑單克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果確定靶基因mRNA的切割位點。測序結(jié)果顯示的切割位點見圖2。osa-miR397的靶基因在與其互補的區(qū)域發(fā)生了 切割，這個結(jié)果強有力的證明了 0s05g0458600確實是OSa-miR397體內(nèi)真正調(diào)控的靶基因 (圖2中，有兩個切割位點，切割概率比為7 1)。實施例4、靶基因的表達量分析為了進一步考察OSa-miR397的功能，用實時定量RT-PCR檢測靶基因 0s05g0458600在幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. 0,15. OmM)的水稻幼苗中的表達情況。1、分別提取實施例1的步驟一制備的各水稻樣品(2g)的總RNA。2、總RNA加入DNase I (TaKaRa)，室溫放置30min以除去基因組DNA的污染。3、加入終止緩沖液(50mM EDTA)后，70°C加熱IOmin以變性DNase I和RNA。4、采用TaKaRa RNA PCR Kit，用RNA合成cDNA模板，操作按試劑盒說明書進行。Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ^t iCycler iQ5Multicolor實時定量PCR檢測儀(Bio-Rad)上進行PCR擴增反應(yīng)，通過比較Ct值 法(Δ Δ Ct {t ^ )(Schmittgen T D. Real-Time Quantitative PCR. Methods,2001,25 383-385.)計算靶基因在不同樣品中的相對表達量(對照組基因的表達量設(shè)定為1)。靶 基因的檢測設(shè)置3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。以水稻β-tubulin基因作為內(nèi)參(Zhao B， Ge L, LiangR, Li W, Ruan K, Lin H, Jin Y. Members of miR-169 family are induced by highsalinity and transiently inhibit the NF-YA transcription factor. BMC Mol. Biol. ，2009，10 :29·)。擴增靶基因的引物如下(5，一 3’)上游引物GAGTGGTGGAACAACGACACGGAG；下游引物TGTACGGGCGAGCCAGCATGTAGTA。擴增β -tubulin基因引物如下(5，— 3，)上游引物CCTCCAAGGATTTCAAGTCTGC；下游引物TTGTAAGGTTCCACCACGGTA。結(jié)果見圖3。靶基因0s05g0458600在H2O2處理下表達量發(fā)生了明顯的變化，通過 和osa-miR397的表達(圖1)進行比較，發(fā)現(xiàn)0s05g0458600的表達和osa_miR397的表達呈 現(xiàn)出明顯的負相關(guān)性，即oSa-miR397表達上調(diào)的時候，0s05g0458600的表達就相應(yīng)下調(diào)， 這與miRNA對靶基因的負調(diào)控作用是完全一致的。OSa-miR397的表達隨著H2O2處理濃度 從0-3. OmM提高而增加，如果濃度進一步增大(3. 0-15. OmM), osa-miR397的表達會下降；相 應(yīng)地，0s05g0458600的表達隨著H2O2處理濃度增加而呈現(xiàn)出先下降后上升的表達模式，與 osa-miR397的表達完全負相關(guān)。實時定量PCR的結(jié)果進一步證明了 0s05g0458600確實是 osa-miR397的靶基因。
權(quán)利要求
序列表的序列1所示的RNA。
2.序列1所示RNA在抑制漆酶基因表達中的應(yīng)用；所述漆酶如序列表的序列2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述漆酶基因如序列表的序列3自5’末端 第67至1791位核苷酸所示。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述漆酶基因如序列表的序列3所示。
5.序列1所示RNA在促進漆酶基因的mRNA降解中的應(yīng)用；所述漆酶如序列表的序列2 所示。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述漆酶基因如序列表的序列3自5’末端 第67至1791位核苷酸所示。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述漆酶基因如序列表的序列3所示。
8.序列表的序列1所示的RNA在水稻種質(zhì)改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)答H2O2的miRNA-397及其應(yīng)用。本發(fā)明保護的miRNA-397是序列表的序列1所示的RNA。本發(fā)明還保護序列1所示RNA在抑制漆酶基因表達和/或促進漆酶基因的mRNA降解中的應(yīng)用；所述漆酶如序列表的序列2所示。應(yīng)用miRNA-397有望獲得對氧化脅迫、干旱、高鹽等有較強耐受性的植株，造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
文檔編號A01H5/00GK101892233SQ201010221439
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者劉進元, 朱梅, 李甜 申請人:清華大學(xué)