專利名稱：一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量rt-pcr快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法
一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明所涉及的一種特異檢測(cè)鴨黃病毒野毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法，屬于病毒核酸檢測(cè)領(lǐng)域，適用于臨床及科研中對(duì)鴨黃病毒的快速定性檢測(cè)。
背景技術(shù)：
自2010年以來，我國(guó)上海、浙江和江蘇等地首次出現(xiàn)了鴨黃病毒感染引起產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降及蛋鴨的死亡。該病原造成的鴨疫情在世界范圍也屬首次。同年在湖北省一些養(yǎng)鴨場(chǎng)也出現(xiàn)不明原因的產(chǎn)蛋下降，臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋嚴(yán)重下降甚至停止，并有一定的致死率， 剖檢病鴨脾臟呈現(xiàn)明顯腫大，卵巢肉變，卵泡嚴(yán)重充血，出血。該病的爆發(fā)給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
本課題組對(duì)該病進(jìn)行了系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查、病原分離、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、病毒部分基因的測(cè)序與分析。證 實(shí)該疾病是由一種新的黃病毒引起，根據(jù)病毒命名的通行規(guī)則， 參照病毒分尚地點(diǎn)，將其命名為HBJL株。初步序列分析結(jié)果表明該病毒屬于黃病毒科 (Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群(Ntaya virus group, NTAV 群)。
鴨黃病毒的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，約由11000個(gè)核苷酸組成。在2010 年我省蛋鴨群首次爆發(fā)產(chǎn)蛋下降疫情時(shí)，本課題組進(jìn)行了大量流行病學(xué)調(diào)查并進(jìn)行了病原的分離鑒定工作，參照Tembusu virus NS5基因序列自主設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)引物，將檢測(cè)出陽(yáng)性的病料進(jìn)行SPF雞胚接種分離出鴨黃病毒湖北毒株HBJL。目前已完成了鴨黃病毒湖北毒株HBJL株部分基因NS5的測(cè)定，并提交至美國(guó)國(guó)家生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI，登錄號(hào) JF423123)，參考HBJL株的NS5基因設(shè)計(jì)了引物DFV-F: atgaataaggtggtgaaggtaatgc ；DFV-R cagattcgtgaaagtgttgagagc ；DFV-P: catgactgttttcccatcacgtcccgg。產(chǎn)物長(zhǎng)度為 130bp。
由于該病為動(dòng)物新發(fā)疾病，現(xiàn)有的診斷方法非常有限，多是通過傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)(Virus Isolation, VI)、聚合酶鏈擴(kuò)增法(Polymerase Chain Reaction, PCR)來進(jìn)行該病的確診。因此建立一種快速診斷檢測(cè)方法是個(gè)迫切需要解決的問題。
熒光定量PCR (Fluorogenetic Quatitative PCR, FQ-PCR)方法是 20 世紀(jì) 90 年代中期發(fā)展起來的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特定核酸的技術(shù)，是在普通PCR的基礎(chǔ)上增加了一條具有高特異性的熒光標(biāo)記DNA探針，通過始點(diǎn)定量和熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測(cè)的。是目前國(guó)際上用在病毒檢測(cè)上最先進(jìn)的檢測(cè)方法之一，與普通 PCR擴(kuò)增技術(shù)相比具有無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)具有靈敏度高、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、無須凝膠電泳、可高通量高效率、定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用應(yīng)該熒光定量PCR技術(shù)的特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法，該試劑盒能夠特異靈敏地檢測(cè)出鴨黃病毒抗原，從而達(dá)到快速診斷的目的。
本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a)RNA裂解液、b)熒光定量反應(yīng)液、c)鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、d)陰性質(zhì)控品，熒光定量反應(yīng)液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及突光探針DFV-P,上游引物DFV-F序列為atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt ;下游引物 DFV-R 序列為cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt ;突光探針 DFV-P 序列為catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt,突光探針DFV-P 5 ;端標(biāo)記的是突光報(bào)告基團(tuán)FAM，3 ;端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
按上述方案，熒光定量反應(yīng)液由IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各O. 2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O. 2 μ Μ。
按上述方案，所述的鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品為高滴度的鴨黃病毒監(jiān)利株，其在鴨胚上增殖，經(jīng)滅活后得到 ，經(jīng)測(cè)量ELD5tl為103 7/mL。
按上述方案，所述的陰性質(zhì)控品是采集健康的且無病原的鴨組織，按體積比1:5 加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存?zhèn)溆谩?br> 一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟1)鴨黃病毒基因組RNA的提取分別向200μI待檢測(cè)標(biāo)本、鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品中加入ImlRNA裂解液，靜置5min后，加入200 μ I氯仿，高速離心后吸取上清， 上清中加入等體積的異丙醇，再進(jìn)行冰浴并高速離心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗滌后，用 20 μ I滅菌水溶解，所得溶液即為RNA模板；2)分別取步驟I)得到的RNA模板加入到熒光定量反應(yīng)液中，用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)并實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)過程中釋放的熒光強(qiáng)度，PCR反應(yīng)得到鴨黃病毒特異性擴(kuò)增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴(kuò)增目的基因序列為atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。
按上述方案，熒光定量反應(yīng)液由IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各O. 2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O. 2 μ Μ。
按上述方案，用于熒光定量RT-PCR檢測(cè)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為42 °C反轉(zhuǎn)錄20min94°C預(yù)變性5min94°C變性IOs —— 60°C退火、延伸50s, 50個(gè)循環(huán)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)I特異性好，通過特異性引物高特異性擴(kuò)增和熒光探針的高特異雜交雙重控制，具有很高的準(zhǔn)確性，假陽(yáng)性低；42靈敏度高，反應(yīng)過程由熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控，熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)具有很高的檢測(cè)靈敏度；3檢測(cè)速度快，不需要另外制備cDNA，為一步法，僅需2個(gè)小時(shí)，加上核酸的提取，共需 3小時(shí)；4沒有后期處理，不用雜交、電泳、拍照等過程，所有試劑均是一次擴(kuò)增，毋需開蓋，不產(chǎn)生污染。


圖I是標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋進(jìn)行熒光定量PCR所得到的擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)代表循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度，圖中平行原理橫坐標(biāo)的直線代表熒光閥值，其中，① ⑦依次為10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品；圖2是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋進(jìn)行熒光定量結(jié)果所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)代表樣品稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光ct值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例I特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒1.試劑組成Trizol RNA 裂解液為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；Taq 酶(5U/μ L)、dNTPs (IOmM), MgCI2 (25禮)、] -]\0^酶(5(^/^1^均購(gòu)自Promega公司；PCR引物對(duì)DFV-F和DFV-R由上海生工生物工程公司合成；熒光探針由上?；瞪锕こ坦竞铣?；鴨黃病毒監(jiān)利株由本實(shí)驗(yàn)室保存；2.試劑配制A)熒光定量反應(yīng)液1 XPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV 酶 50U， Taq酶2U，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R各O. 2μΜ和熒光探針DFV-P O. 2 μ M 組成；其中上游引物DFV-F序列為atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt ；下游引物 DFV-R 序列為cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt ;突光探針 DFV-P 序列為 catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt,突光探針DFV-P 5 ;端標(biāo)記的是突光報(bào)告基團(tuán)FAM, 3 ’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
B)鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品為高滴度的鴨黃病毒監(jiān)利株，其在鴨胚上增殖，經(jīng)滅活后得到，經(jīng)測(cè)量ELD5tl為103 7/mL。
C)陰性質(zhì)控品采集健康的且無病原的鴨各組織，按體積比1:5加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存?zhèn)溆谩?br> D)自備試劑氯仿、異丙醇、DEPC處理的滅菌雙蒸水配制的75%乙醇。
實(shí)施例2特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的使用方法I、樣本的處理A)被檢樣本為組織樣品取待檢樣本50-100mg于潔凈、滅菌并烘干的勻衆(zhòng)器中，以I: 5體積比加入PBS液，充分勻漿，4000rpm離心lOmin，取100 μ L上清液(每一個(gè)反應(yīng))轉(zhuǎn)入無菌的I. 5mL離心管中，編號(hào)備用；B)被檢樣本為液體樣本(如全血、血清、鼻拭子等),直接取100μ L轉(zhuǎn)入無菌的1.5ml 離心管中，編號(hào)備用。
2、被檢樣本RNA的提取取η個(gè)滅菌的I. 5ml離心管，其中η為被檢樣品數(shù)與鴨黃病毒監(jiān)利株強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照及陰性質(zhì)控品對(duì)照的和；每管分別加入被檢樣本、鴨黃病毒監(jiān)利株陽(yáng)性對(duì)照及陰性質(zhì)控品對(duì)照各100 μ L，再分別加入500 μ L RNA裂解液，充分混勻，靜置5min ;再加入100 μ L氯仿， 振蕩混勻，4°C 12000rpm離心15min ;吸取上清至另一離心管，加入等體積的異丙醇，冰浴 15min,4°C 12000rpm 離心 IOmin ;棄盡上清，加入 Iml 75% 乙醇，混勻，4°C 12000rpm 離心 IOmin ;徹底棄上清。沉淀常溫干燥5min后，溶解于20 μ L DEPC處理過的滅菌雙蒸水，即得 RNA模板；3、熒光定量PCR反應(yīng)分別取熒光定量反應(yīng)液各19 μ L，取第3步所得的RNA模板各I μ L，分別加入不同的 PCR反應(yīng)管，在熒光定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為42°C 20min 94°C 5min 94°C IOs —— 60°C 50s 擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)定在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm ；PCR反應(yīng)得到鴨黃病毒特異性擴(kuò)增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴(kuò)增目的基因序列為atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt0
4、結(jié)果判斷A)結(jié)果分析條件設(shè)定循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶軟件分析檢測(cè)結(jié)果。循環(huán)域值(Threshold Cycle,Ct)設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況調(diào)整，以Ct值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)；B)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)在20左右并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；C)結(jié)果判定陰性結(jié)果判定無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性結(jié)果判定Ct值小于30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；實(shí)驗(yàn)灰區(qū)Ct值大于35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣本建議重做。重做結(jié)果出現(xiàn)Ct值和典型的擴(kuò)增曲線者為陽(yáng)性，否則為陰性。
實(shí)驗(yàn)例3特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的應(yīng)用 I、靈敏度試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋的(103 7 10_7 7 ELD5(l/mL)做為模板，在熒光定量PCR儀上檢測(cè)，得到實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見附圖I和附圖2。檢測(cè)出最低病毒量為6I (Γ2· 7ELD5(l/mL。
2、特異性試驗(yàn)采用特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒對(duì)禽流感、禽白血病、禽大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、新城疫、減蛋綜合癥等進(jìn)行特異性試驗(yàn)，對(duì)上述7種病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。另外，對(duì)水及鴨的各種組織檢測(cè)結(jié)果均為陰性。以上結(jié)果充分證明該試劑盒在臨床樣品的檢測(cè)中具有很好的特異性。
3、重復(fù)性試驗(yàn)取3份不同病毒水平的鴨黃病毒樣品進(jìn)行組間重復(fù)性檢測(cè)，得到表1，算得重復(fù)性檢測(cè)的組間變異系數(shù)β值分別為4. 4%、4. 8%、3· 7%，均小于5%，證明該檢測(cè)方法具有很好的特異性。
表I樣品的組間重復(fù)性檢測(cè)病毒滴度結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒包括a) RNA裂解液、b)突光定量反應(yīng)液、c)鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、 d)陰性質(zhì)控品，熒光定量反應(yīng)液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及熒光探針 DFV-P,上游引物 DFV-F 序列為atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt ；下游引物 DFV-R 序列為cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt ;突光探針 DFV-P 序列為 catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt,突光探針DFV-P 5 ;端標(biāo)記的是突光報(bào)告基團(tuán)FAM, 3 ’端標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
2.按權(quán)利要求I所述的特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于熒光定量反應(yīng)液由 IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq 酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各0.2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O.2 μ M。
3.按權(quán)利要求I所述的特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于所述的鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品為高滴度的鴨黃病毒監(jiān)利株，其在鴨胚上增殖，經(jīng)滅活后得到，經(jīng)測(cè)量ELD5tl為103 7/mL。
4.按權(quán)利要求I所述的特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒，其特征在于所述的陰性質(zhì)控品是采集健康的且無病原的鴨組織，按體積比1:5加入PBS液，充分勻漿破碎，離心去除沉淀，上清保存?zhèn)溆谩?br> 5.權(quán)利要求I所述的特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于包括以下步驟1)鴨黃病毒基因組RNA的提取分別向200μ I待檢測(cè)標(biāo)本、鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品中加入ImlRNA裂解液，靜置5min后，加入200 μ I氯仿，高速離心后吸取上清， 上清中加入等體積的異丙醇，再進(jìn)行冰浴并高速離心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗滌后，用 20 μ I滅菌水溶解，所得溶液即為RNA模板；2)分別取步驟I)得到的RNA模板加入到熒光定量反應(yīng)液中，用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)并實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)過程中釋放的熒光強(qiáng)度，PCR反應(yīng)得到鴨黃病毒特異性擴(kuò)增目的基因，所述的鴨黃病毒特異性擴(kuò)增目的基因序列為atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。
6.按權(quán)利要求5所述的一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量RT-PCR快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于熒光定量反應(yīng)液由IXPCR Buffer, MgCl2 4mM, dNTPs O. 5mM, M-MLV酶50U，Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R為各O. 2 μ M，所述的熒光探針DFV-P為O. 2 μ Μ。
7.按權(quán)利要求5或6所述的特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于，用于熒光定量RT-PCR檢測(cè)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為·42 °C反轉(zhuǎn)錄20min·94°C預(yù)變性5min·94°C變性IOs —— 60°C退火、延伸50s, 50個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明所涉及的一種特異檢測(cè)鴨黃病毒感染的熒光定量PCR快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法，試劑盒包括a)RNA裂解液、b)熒光定量反應(yīng)液、c)鴨黃病毒強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、d)陰性質(zhì)控品，熒光定量反應(yīng)液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R以及熒光探針DFV-P，適用于臨床及科研中對(duì)鴨黃病毒的快遞定量檢測(cè)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)特異性好,通過引物高特異性擴(kuò)增和熒光探針的高特異雜交雙重控制,具有很高的準(zhǔn)確性,假陽(yáng)性低；靈敏度高；檢測(cè)速度快，僅2小時(shí)，加上核酸的提取，共需3小時(shí)左右；沒有后處理，不用雜交、電泳、拍照等過程，不產(chǎn)生污染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925592SQ201210493140
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者張蓉蓉, 溫國(guó)元, 羅青平, 邵華斌, 王紅琳, 楊峻, 艾地云, 羅玲 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所