專利名稱：一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因克隆與鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法。該基因參與植物氮素同化、轉(zhuǎn)移與利用，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法選育氮高效品種提供了材料。
背景技術(shù)：
氮素是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要元素，無(wú)論是直接來(lái)源于硝酸鹽、氨離子、微生物固定氮還是植物代謝過(guò)程中釋放的氨，都必須經(jīng)過(guò)谷氨酰胺合成酶(GS)催化才能同化為氨基酸。大麥、玉米、水稻、擬南芥等許多植物的GS基因已被克隆，GS功能研究已經(jīng)成為提高氮素利用效率的研究熱點(diǎn)之一。高等植物中有兩類GS，一類定位于胞液中，稱為胞液型GSjP GS1，主要參與種子萌發(fā)時(shí)儲(chǔ)存氮源的轉(zhuǎn)運(yùn)及葉片衰老時(shí)氮源的轉(zhuǎn)移及再利用；另一類定位于質(zhì)體中，稱為質(zhì)體型GS，即GS2，主要參與光呼吸、硝酸還原產(chǎn)生的氨(初級(jí)氮)的同化過(guò)程[。前人研究表明豌豆GSl轉(zhuǎn)化的煙苗在氮脅迫時(shí)能提高葉片的光合速率，增加植株的生物產(chǎn)量，促進(jìn)氮素的轉(zhuǎn)移與再利用(Fuentes，2001)。轉(zhuǎn)GSl基因玉米的穗粒數(shù)及千粒重增加，氮素利用率提高(Martin，20006)。高效表達(dá)GSl和GS2基因能提高水稻對(duì)土壤氮素缺乏的耐性，促進(jìn)氮的吸收與再利用(孫輝等，2005)。

發(fā)明內(nèi)容
在前期研究工作基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)克隆小麥GSl和GS2基因的全長(zhǎng)cDNA引物及相應(yīng)的PCR循環(huán)，得到了 GSl和GS2基因的全長(zhǎng)cDNA。并設(shè)計(jì)特異性引物，利用半定量PCR鑒定GSl和GS2在小麥不同組織中的表達(dá)狀態(tài)。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，該方法包括以下步驟利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；cDNA合成采用20 ii L反應(yīng)體系，42 V溫浴Ih ；GSl 全長(zhǎng) cDNA 克??；GS2 全長(zhǎng) cDNA 克隆；利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達(dá)的方法，通過(guò)獲得cDNA，利用表I中的弓I物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進(jìn)一步，cDNA合成采用 20 ilL 反應(yīng)體系為RNA，2u g ;M_MLV，200U ；dNTP,125pmol ；oligodT,IOOpmol ;RNasin,25U。進(jìn)一步，GSl全長(zhǎng)cDNA克隆方法為GSl 全長(zhǎng)正向引物GSlQF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物GSlQR :5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循環(huán)預(yù)變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火61 °C,45s ；延伸72°C，IOmin ;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，4°C，5min。PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶(圖1A)，連接PMD-19載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP IO，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序鑒定。進(jìn)一步，GS2全長(zhǎng)cDNA克隆方法為GS2 全長(zhǎng)正向引物 GS2QF :5，-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’ 和反向引物 GS2QR 5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’ ；PCR 循環(huán):預(yù)變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，4°C，5min ；
PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶(圖1B)，連接PMD-19載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序鑒定。進(jìn)一步，利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達(dá)的方法為通過(guò)獲得cDNA，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)變性94°C，2min，變性94°C，30s ;退火54°C,30s ;延伸72°C，30s ;擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，延伸72°C，5min，產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進(jìn)一步，所述引物設(shè)計(jì)為(I)GSl全長(zhǎng)cDNA的引物設(shè)計(jì)；正向引物GSlQF :
5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 ' 和反向弓I 物 GSlQR 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'，(2) GS2 全長(zhǎng) cDNA 的弓丨物設(shè)計(jì)；正向引物 GS2QF 5 ’ -CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3 ’ 和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCITTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’(3) GSl半定量PCR特異性引物。正向引物5' -TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'和反向引物 5' -CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'；(4) GS2 半定量 PCR 特異性引物。正向引物 5' -GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'和反向引物 5' -ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'。本發(fā)明首次從普通小麥栽培品種葉片中克隆了 GSl和GS2的全長(zhǎng)cDNA，探索了GSl和GS2在小麥不同組織中轉(zhuǎn)錄與表達(dá)特點(diǎn)，不僅為進(jìn)一步研究其在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控方式及在氮素利用中的作用奠定了基礎(chǔ)。更為通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法選育氮高效品種提供了材料。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的小麥谷氨酰胺合成酶全長(zhǎng)cDNA的PCR擴(kuò)增圖。A、GS1基因擴(kuò)增；B、GS2基因擴(kuò)增。圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用半定量PCR鑒定小麥谷氨酰胺合成酶基因在小麥苗期葉片中的表達(dá)特點(diǎn)。A、GS1基因；B、GS2基因。1-6分別表示小麥出苗后2、4、8、20、28及30天。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。在前期研究工作基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)克隆小麥GSl和GS2基因的全長(zhǎng)cDNA引物及相應(yīng)的PCR循環(huán)，得到了 GSl和GS2基因的全長(zhǎng)cDNA。并設(shè)計(jì)特異性引物，利用半定量PCR鑒定GSl和GS2在小麥不同組織中的表達(dá)狀態(tài)。本發(fā)明的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的I、利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。2、cDNA 合成采用 20 yL 反應(yīng)體系(RNA，2u g ;M_MLV，200U ；dNTP, 125pmol ；oligodT, IOOpmol ;RNasin，25U)，42°C溫浴 lh。3、GSl全長(zhǎng)cDNA克隆。GSl全長(zhǎng)正向引物GSlQF :
5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 ' 和反向弓I 物 GSlQR 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循環(huán)預(yù)變性 94°C，2mi n ;變性 94°C，45s ;退火61°C，45s ;延伸72°C，IOmin ;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，4°C，5min。PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接PMD-19載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序鑒定。4、GS2 全長(zhǎng) cDNA 克隆。GS2 全長(zhǎng)正向引物 GS2QF :5’ -CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCTITTAATAACGTAGTTCTCCG-3’。PCR 循環(huán)預(yù)變性 94°C，2min ；變性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ;擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)，4°C，5min。PCR 產(chǎn)物于
I%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接PMD-19載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序鑒定。5、利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達(dá)的方法。通過(guò)步驟I和2獲得cDNA，利用表I中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增:預(yù)變性94°C，2min，變性94°C，30s ;退火54°C，30s ；延伸72°C，30s ;擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，延伸72°C，5min，產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。表I半定量PCR引物
權(quán)利要求
1.一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性； cDNA合成采用20 ii L反應(yīng)體系，42 °C溫浴Ih ； GSl全長(zhǎng)cDNA克??； GS2全長(zhǎng)cDNA克?。? 利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達(dá)的方法，通過(guò)獲得cDNA，利用表I中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
2.如權(quán)利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，cDNA 合成采用 20 ii L 反應(yīng)體系為RNA, 2 u g ；M-MLV, 200U ；dNTP, 125pmol ；oligodT,IOOpmol ;RNasin,25U。
3.如權(quán)利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，GSl全長(zhǎng)cDNA克隆方法為 GSl 全長(zhǎng)正向引物 GSl QF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 '和反向引物 GSIQR :5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循環(huán)預(yù)變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火61。。，45s ;延伸72°C，IOmin ;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，4°C，5min。PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定；利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接PMD-19載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序鑒定。
4.如權(quán)利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，GS2全長(zhǎng)cDNA克隆方法為 GS2 全長(zhǎng)正向引物 GS2QF :5，CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3，和反向引物 GS2QR 5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’ ； PCR 循環(huán):預(yù)變性 94°C，2min ;變性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ;擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，4°C，5min ； PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定； 利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接PMD-19載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序鑒定。
5.如權(quán)利要求I所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，利用半定量PCR鑒定小麥GSl和GS2基因表達(dá)的方法為 通過(guò)獲得cDNA，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)變性94°C，2min，變性94°C，30s ;退火54°C，30s ;延伸72°C，30s ;擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，延伸72°C，5min，產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
6.如權(quán)利要求5所述的小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，其特征在于，所述引物設(shè)計(jì)為 (1)GSl全長(zhǎng) cDNA 的引物設(shè)計(jì)；正向引物 GSlQF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物 GSIQR : 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'， (2)GS2全長(zhǎng)cDNA的引物設(shè)計(jì)；正向引物GS2QF:5’-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’ (3)GSl半定量PCR特異性引物；正向引物5'-TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'和反向引物 5' -CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'； (4 )GS2半定量PCR特異性引物；正向引物5' -GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'和反向引物 5' -ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種小麥谷氨酰胺合成酶基因的克隆與鑒定方法，該方法包括以下步驟利用Trizol試劑盒提取小麥組織總RNA，DNaseI處理后DEPC處理水定容，利用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；cDNA合成采用20μL反應(yīng)體系，42℃溫浴1h；GS1全長(zhǎng)cDNA克??；GS2全長(zhǎng)cDNA克隆；利用半定量PCR鑒定小麥GS1和GS2基因表達(dá)的方法，通過(guò)獲得cDNA，利用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳鑒定。本發(fā)明首次從普通小麥栽培品種葉片中克隆了GS1和GS2的全長(zhǎng)cDNA，探索了GS1和GS2在小麥不同組織中轉(zhuǎn)錄與表達(dá)特點(diǎn)，不僅為進(jìn)一步研究其在小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控方式及在氮素利用中的作用奠定了基礎(chǔ)。更為通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法選育氮高效品種提供了材料。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102965383SQ201210492359
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者王小純, 馬新明, 李高飛 申請(qǐng)人:王小純