專利名稱：一種雙加氧酶基因及其克隆表達和對芘和苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境有機污染物微生物修復技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及為一種雙加氧酶基因及其克隆表達和對芘和苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴是一類在環(huán)境中廣泛存在的有機污染物，其中許多種類都具有致癌、致畸、致突變的“三致”效應(yīng)。而高環(huán)多環(huán)芳烴因其具有更低的水溶性和更強的吸附性，使之在環(huán)境中生物有效性不高，從而導致持久性殘留。在自然環(huán)境中，多環(huán)芳烴的主要消除方式是微生物降解，包括真菌和細菌的作用。真菌對多環(huán)芳烴的降解并不徹底，往往只是將其轉(zhuǎn)化成一水溶性更高的產(chǎn)物。相對真菌而言，細菌則具有可以將多環(huán)芳烴徹底礦化成二氧化碳的能力，因此更具修復潛能。細菌礦化多環(huán)芳烴是一個由多種酶類共同參與的生物化學代謝過程。其中涉及到雙加氧、脫氫、開環(huán)雙加氧等多種生化反應(yīng)。在這個礦化途徑中，由雙加氧酶所催化的雙加氧步驟是多環(huán)芳烴礦化過程中的第一步，也是多環(huán)芳烴礦化中的限速步驟。因此多環(huán)芳烴雙加氧效率控制著整個多環(huán)芳烴的礦化過程。因此，獲取對高環(huán)多環(huán)芳烴進行雙加氧作用的雙加氧酶具有重要的理論研究和實際應(yīng)用的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于克隆可轉(zhuǎn)化高環(huán)多環(huán)芳烴的雙加氧酶基因，將該酶進行表達并利用工程菌驗證其對芘和苯并k]芘的轉(zhuǎn)化作用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于
一、一種雙加氧酶基因，其特征在于該酶基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；其對應(yīng)的氨基酸序列由SEQ ID NO :2所示的小亞基序列和SEQ ID NO :3所示的大亞基序列組成。二、本發(fā)明所述雙加氧酶基因的克隆與表達，具體包括以下步驟
(1)以芘降解菌分支桿菌Ico如Cteri sp. NJS-P基因組為模板，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的雙加氧酶保守序列，設(shè)計簡并引物，通過PCR技術(shù)擴增出包含雙加氧酶基因完整閱讀框的基因片段，進行TA克隆，進行測序；再設(shè)計引物，從包含雙加氧酶基因完整閱讀框的TA載體中擴增出雙加氧酶基因完整閱讀框，得到如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，其對應(yīng)的氨基酸序列由SEQ ID NO 2所示的小亞基序列和SEQ ID NO 3所示的大亞基序列組成；
(2)將含有雙加氧酶基因完整閱讀框的TA載體進行酶切，與同樣酶切的pETMb表達載體進行連接，構(gòu)建得雙加氧酶表達載體；然后再將質(zhì)粒/7^5-1 和提供電子載體蛋白的PBRCD共轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建基因工程菌，在培養(yǎng)基中誘導表達出 PdoAB可溶性蛋白，即為本發(fā)明所述的雙加氧酶。三、本發(fā)明所述的工程菌對芘和苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化。
具體方法為
1)離心收集經(jīng)過蛋白誘導的工程菌，用約1/10體積的M9培養(yǎng)基清洗并重新懸浮菌
體；
2)按10%的量將重懸菌體接入硅油-水雙相體系中，其轉(zhuǎn)化體系組分包括25mL M9培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素和慶大霉素)和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；
3)培養(yǎng)2天。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化方法為全細胞轉(zhuǎn)化體系，免除了酶的提取步驟；而且本發(fā)明獲取的雙加氧酶不僅能夠轉(zhuǎn)化四環(huán)多環(huán)芳烴-芘，而且還能轉(zhuǎn)化五環(huán)的苯并[a]芘，在高環(huán)多環(huán)芳烴的基因工程菌修復研究方面具有一定研究價值。


圖1為本發(fā)明所述的的雙加氧酶對芘的轉(zhuǎn)化質(zhì)譜檢測圖。圖2為本發(fā)明所述的雙加氧酶對苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化質(zhì)譜檢測圖。
具體實施例方式實施例中所涉及基因操作方法參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克 D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學出版社)
實施例1
本實施例說明本發(fā)明的雙加氧酶基因序列的獲得方法。以芘降解菌分支桿菌Ico如Cteri^B sp. NJS-P (該菌株于2011年1月10日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，編號為CCTCC NO =M 2011011)基因組為模板， 根據(jù)已報道的雙加氧酶(NCBI數(shù)據(jù)庫http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)保守序列，設(shè)計簡并引物，通過PCR技術(shù)擴增出包含雙加氧酶基因完整閱讀框的基因片段，進行TA克隆，進行測序；再設(shè)計引物，從包含雙加氧酶基因完整閱讀框的TA載體中擴增出雙加氧酶基因完整閱讀框，具體操作如下
1)提取分支桿菌NJS-P基因組DNA。2)設(shè)計簡并引物召-F和召-R，用高保真酶I^rimerSTAR HS (Takara)通過 PCR技術(shù)擴增出《/ ^基因完整閱讀框。引物序列為
pdoAB-Y.. 5’ -TAGGATCCAGAGGAGTTCGRTKTGATGAAC-3’ pdoAB-R\ 5’ -TAGAATTCCAGAAKCKTCATCRAGCAC-3’。3)對 PCR 擴增產(chǎn)物進行加 A 處理，用Simple Cloning Kit (Transgen) 進行TA克隆，測序。4)再設(shè)計簡并引物位召-F和位召-R，上下游引物兩端分別引入AfcoI和漢3 HI酶切位點，用高保真酶I^rimerSTAR HS (Takara)從步驟3中所獲取的TA克隆中擴增出雙加氧酶基因完整閱讀框，得到如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，可知該雙加氧酶基因具有分別如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的大小亞基的氨基酸序列。其中，引物序列為
Ex-pdoAB-Y·. 5’ - GTATCm^GCAACGCGGTCGCGGTGGAC-3 ‘Ex-pdoAB-R\ 5’ - ACGGATCCYCATCGAGCACCGCCGCGGAACTG-3，。實施例2
本實施例說明在實施例1的基礎(chǔ)上對雙加氧酶進行表達的方法。將含有雙加氧酶基因完整閱讀框的TA載體進行酶切，與同樣酶切的pETMb表達載體(Novagen)進行連接，構(gòu)建得雙加氧酶表達載體然后再將質(zhì)粒/7^5-1 和提供電子載體蛋白的PBRCD (由Dr. Jouanneau惠贈)共轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21 (DE3)(購自北京全式金公司)，構(gòu)建基因工程菌，在培養(yǎng)基中誘導表達出PdoAB可溶性蛋白，具體操作如下
1)提取實施例1中第4步獲取的TA克隆質(zhì)粒和表達載體質(zhì)粒pETMb。2)用AfcoI和漢3 HI (Fermentas)對兩質(zhì)粒進行酶切，回收所需DNA片段。3)按DNA:載體=1:3的比例，用DNA連接酶(Takara)將酶切片段過夜連接，構(gòu)建得細菌漆酶表達載體/ WS-15b。4)將質(zhì)粒/7^3-1 與和pBRCD共轉(zhuǎn)化至表達宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，得到
基因工程菌。5)用含氨芐青霉素和慶大霉素的雙抗Luria-Bertani (LB)平板過夜活化工程菌， 挑取單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基(含抗生素)中，37 °C培養(yǎng)至OD6tltl= 0.6 0.8，加入 100 mg/L IPTG，于25 過夜誘導PdoAB酶蛋白表達。實施例3
本實施例說明所述的工程菌對芘和苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化方法。4)離心收集經(jīng)過蛋白誘導的工程菌，用約1/10體積的M9培養(yǎng)基清洗并重新懸浮菌體；
5)按10%的量將重懸菌體接入硅油-水雙相體系中，其轉(zhuǎn)化體系組分包括25mL M9培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素和慶大霉素)和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；
6)培養(yǎng)2天。在產(chǎn)物經(jīng)過硅烷衍生化之后，采用GC/MS進行產(chǎn)物分析，具體操作如下 1)轉(zhuǎn)化完畢，轉(zhuǎn)化液用等體積乙酸乙酯，分兩次進行萃取。2)合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法(30°C)將有機溶劑蒸干，加入1 mL正己烷溶解。溶解液過0.22 μ m濾膜，再用氮氣吹干，最終用100 yL正己烷溶解。3)加入100 yL TMS硅烷化試劑(supelco)，于60°C 1小時進行硅烷衍生化。4)硅烷化產(chǎn)物用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用進行產(chǎn)物分析，用離子選擇方式進行檢測(見附圖1和2)。芘的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物選擇離子為四0 (單羥基產(chǎn)物)和380 (二氫二醇產(chǎn)物);苯并[a] 芘的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物選擇離子為340 (單羥基產(chǎn)物)。
權(quán)利要求
1.一種雙加氧酶基因，其特征在于該基因具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；其對應(yīng)的氨基酸序列由SEQ ID NO :2所示的小亞基序列和SEQ ID NO :3所示的大亞基序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙加氧酶基因的克隆與表達，其特征在于具體包括以下步驟(1)以芘降解菌分支桿菌Ico如cteri sp. NJS-P基因組為模板，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的雙加氧酶保守序列，設(shè)計簡并引物，通過PCR技術(shù)擴增出包含雙加氧酶基因完整閱讀框的基因片段，進行TA克隆，進行測序；再設(shè)計引物，從包含雙加氧酶基因完整閱讀框的TA載體中擴增出雙加氧酶基因完整閱讀框；(2)將含有雙加氧酶基因完整閱讀框的TA載體進行酶切，與同樣酶切的pETMb表達載體進行連接，構(gòu)建得雙加氧酶表達載體；然后再將質(zhì)粒/7^5-1 和提供電子載體蛋白的PBRCD共轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21 (DE3)，構(gòu)建基因工程菌，在培養(yǎng)基中誘導表達出 PdoAB可溶性蛋白，即為雙加氧酶蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達雙加氧酶的工程菌對芘和苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化，其特征在于所述的具體方法為(1)離心收集經(jīng)過蛋白誘導的工程菌，用1/10體積的M9培養(yǎng)基清洗并重新懸浮菌體；(2)按10%的量將重懸菌體接入硅油-水雙相體系中，其轉(zhuǎn)化體系組分包括25mL含有氨芐青霉素和慶大霉素的M9培養(yǎng)基和5 mL含100 mg/L的芘或50 mg/L的苯并[a]芘；(3)培養(yǎng)2天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙加氧酶基因及其克隆表達和工程菌對芘和苯并[a]芘的轉(zhuǎn)化。該酶不僅能夠轉(zhuǎn)化四環(huán)多環(huán)芳烴-芘，而且還能轉(zhuǎn)化五環(huán)的苯并[a]芘，在高環(huán)多環(huán)芳烴的基因工程菌修復研究方面具有一定研究價值。
文檔編號C12N15/70GK102174543SQ20111004702
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月28日
發(fā)明者張晶, 曾軍, 朱弘, 李烜楨, 林先貴 申請人:中國科學院南京土壤研究所