專(zhuān)利名稱(chēng)：7、8-脫氫酶基因的克隆與表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及7、 8-脫氫酶基因的克隆與表達(dá)。
背景技術(shù)：
維生素D3是人與動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、維持生命和保持健康必不可少的一種脂溶性維 生素。它的主要作用是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，促進(jìn)腸內(nèi)鈣磷吸收和骨質(zhì)鈣化，維持血鈣和血磷的平衡， 可用作藥物制劑、食品和飼料添加劑等，在臨床上還可用于治療佝僂病、老年骨質(zhì)疏松、甲狀 腺機(jī)能減退癥等。目前維生素D3是采用光化學(xué)法生產(chǎn)，即以7-脫氫膽固醇(7—DHC)為原料， 經(jīng)紫外照射后轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3前體(PreD3)，再熱異構(gòu)化而得。作為主生產(chǎn)原料的7-脫氫膽固醇， 可采用多種不同的原料和工藝路線(xiàn)，通過(guò)化學(xué)合成法制備。如可從羊毛脂提取膽固醇，再進(jìn)行 酯化、氧化生成7-酮膽固醇酯，后者可還原成7ff和7i9-羥基膽固醇酯，再通過(guò)消除反應(yīng)生成7-脫氫膽固醇。我國(guó)中科院感光化學(xué)所(現(xiàn)為理化所)張建成等人的工藝路線(xiàn),則以膽固醇為基本 原料，經(jīng)氧化、加成等一系列反應(yīng)得到7-脫氫膽固醇。
隨著世界人口的不斷增加和各國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，以及人們生活水平的提高，市場(chǎng)對(duì)維生 素D3的需求量也呈上升趨勢(shì)。但迄今，無(wú)論采用何種化學(xué)合成法制備原料7-脫氫膽固醇，都有 反應(yīng)步驟長(zhǎng)，總產(chǎn)率不高，副反應(yīng)多，條件難控制，效率偏低，成本高等缺點(diǎn)，從而影響維生 素D3的生產(chǎn)成本、銷(xiāo)售價(jià)格、市場(chǎng)推廣。因此，目前研究開(kāi)發(fā)工藝路線(xiàn)短、成本低的7-脫氫 膽固醇生產(chǎn)方法變得十分迫切和必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，采用生物工程方法，研究開(kāi)發(fā)工 藝路線(xiàn)短、成本低的7-脫氫膽固醇生產(chǎn)路線(xiàn)。
本發(fā)明是從果蠅cDNA文庫(kù)中克隆一種編碼7、 8-脫氫酶的基因，其目的是提供一種克隆與表 達(dá)7、 8-脫氫酶的方法,該發(fā)明可以獲得有酶活的7、 8-脫氫酶。
目前有關(guān)蛻皮激素合成機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，某些昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，在蛻皮激素生物合成的第一步， 其體內(nèi)有種脫氫酶，先將膽固醇7、 8號(hào)位上的氫原子脫除，得到中間產(chǎn)物7-脫氫膽固醇，進(jìn)而 在P450酶系其它酶的作用下，經(jīng)多步酶促反應(yīng)合成蛻皮激素。基于這種理論，我們從果蠅cDNA 文庫(kù)中克隆一種編碼7、 8-脫氫酶的基因，并成功表達(dá)。通過(guò)控制合適的酶反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)該7、 8-脫氫酶能將膽固醇轉(zhuǎn)化為7-脫氫膽固醇。這樣的結(jié)果，十分有利于下一步研究高酶活、低成本
4的脫氫酶制造方法，從而開(kāi)發(fā)一種全新的、生物法合成7-脫氫膽固醇工藝路線(xiàn)，并最終實(shí)現(xiàn)大幅 度降低7-脫氫膽固醇和維生素D3生產(chǎn)成本的目的。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
1、 從果蠅中獲取cDNA文庫(kù)和pSE380質(zhì)粒，保存于實(shí)驗(yàn)室中。
2、 基因的克隆與測(cè)序，自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢 測(cè)，回收后與pGM-T vector連接，得到重組質(zhì)粒，用連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)￡ co力'DH5 a ,在含Amp、 IPTG、 X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切 驗(yàn)證、測(cè)序。
3、 根據(jù)上述擴(kuò)增得到的片段，釆用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行片段的擴(kuò)增。以重組克隆載體為模板 進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物和pSE380分別經(jīng)過(guò)EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收后連接，轉(zhuǎn) 化f. 7/DH5a， A即抗性篩選，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR，酶切鑒定，將鑒定后的重組質(zhì)粒測(cè)序， 進(jìn)一步驗(yàn)證。
4、 ￡ co7i BL21 (DE3) plysS的轉(zhuǎn)化和7、 8-脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)，將重組pSE380轉(zhuǎn)化感受態(tài) 的BL21，取160uL轉(zhuǎn)化液涂布于LB平板上，35 — 38'C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，并用含有空白載體 pSE380的菌株作為空白對(duì)照。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落到5 rrL LB液體培養(yǎng)基中，35 — 38'C 220 r/min搖床培養(yǎng)至0D6。。=0. 6左右，添加IPTG至終濃度為1咖ol/L，同時(shí)將含有空白載體pSE380 的菌株作為空白對(duì)照。通過(guò)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)。
5、 重組菌粗酶液提取，按照上述方法進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)誘導(dǎo)所得菌液8000 r/min離心 5min，取菌體沉淀懸浮于PBS緩沖液中，超聲波破壁，離心取上清液即得粗酶液。取上清液300 ml通過(guò)切向流膜過(guò)濾分離系統(tǒng)濃縮純化分離蛋白酶，最終獲得粗酶液20 ml，用于酶學(xué)性質(zhì)等方 面的研究。
6、 以膽固醇為底物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)鑒定，將lg膽固醇溶解于含Tween 80、 pH 7. 4的磷酸緩沖溶 液中，與10ml粗酶液混合，常溫避光反應(yīng)12h，反應(yīng)液用有機(jī)溶劑萃取，萃取劑與反應(yīng)液體積比為 5: 1，萃取溫度38 — 40'C，萃取時(shí)間50—80 min，用反相高效液相色譜法檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，檢測(cè) 發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液中有7-脫氫膽固醇，其出峰時(shí)間與標(biāo)品7-脫氫膽固酵一致；所述的萃取的有機(jī)溶劑是 石油醚。所述的檢測(cè)條件為C18柱(5ura， 250咖X4.6鵬)，流動(dòng)相乙腈-異丙醇(7:3), 柱溫30。C，流速l.O mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm 。
上述第2步中，從己構(gòu)建的果蠅cDNA文庫(kù)中獲得一種編碼7、 8-脫氫酶的基因以及該基因編 碼的酶，該酶特征在于此酶由438個(gè)氨基酸組成，其分子量為51307.89 Da。此酶被命名為7、 8-脫氫酶。且由下列氨基酸序列組成
5MTSYSRFWMSLLE隨WKPISNDFViaWTLAVTFIRIYWIFFVPLEWKKDLDNEKWSFLRKTENVVCLAHKRD nNRLRKLKIQKIIELPPPYPNGWYGILKSSQLKAGEATCVSCLGEDLKLVIFRSKKDIVFILDAYCPHLGAN SRIGRRVADDCRICPFHQWKFRGGDGLCINIPYSTSVPKVTKLKKWISQVMDGFIFIWYHAEQTELPWDLPVP MGEIADTFVYHGHNEFYTVCHIQEIPENGADEAHFNAAHKKNFINGSWAQKKRLFGLGSH冊(cè)KARWSPFTNLS YGKLKYLAEVNLSHTFKLKGKFGCFRMEVSGKQIGPSIVCLEVNSYTFGKIKVFQYITRVEPMLQKVVRSFYG PRWIAPLIPIFIYGEVLMFERDMEIFHHFVF畫(huà)PILAKEDAS服FRLWFSQFYSSNSKIYSE細(xì)IGWSLQ 上述編碼7、 8-脫氫酶的基因，其核苷酸序列如下
atgacatca/tactcgcgattttggatg￡LgCatgactggaagccgataaca
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3gtagt朋ttcacagatcagcagcgaggcaaccaatsttggttggtcgttgc犯本發(fā)明的有益效果
1、從果蠅中獲取7、 8-脫氫酶基因；
2、 涉及到7、 8-脫氫酶基因的cDNA序列及克隆、與之相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列及其在大腸桿 菌中的表達(dá)，并且該酶可以轉(zhuǎn)化膽固醇為7-脫氫膽固醇，為生物法合成7-脫氫膽固醇提供一 種新方法。
3、 該方法簡(jiǎn)單高效，實(shí)現(xiàn)7-脫氫膽固醇直接轉(zhuǎn)化，即一步酶法轉(zhuǎn)化膽固醇為7 脫氫 膽固醇，既提高其轉(zhuǎn)化效率、縮短維生素D3的工藝路線(xiàn)、降低生產(chǎn)成本又減少環(huán)境污染。


圖1為重組質(zhì)粒EcoR I 、 BamH I雙酶切和降落PCR鑒定圖。
圖2為表達(dá)載體物理圖譜。
圖3為酶促反應(yīng)液高效液相色譜圖。
圖4為標(biāo)品7-脫氫膽固醇高效液相色譜圖。
本發(fā)明是一種7、 8-脫氫酶的基因克隆與表達(dá)，將結(jié)合附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明 圖1為重組質(zhì)粒EcoR I 、 BamH I雙酶切和降落PCR鑒定圖
以重組克隆載體為模板進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物和pSE380分別經(jīng)過(guò)EcoR I和BamH I進(jìn) 行雙酶切，其結(jié)果通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 圖2為表達(dá)載體物理圖譜
將重組基因轉(zhuǎn)化入五co7i(DE3)plysS所用的質(zhì)粒載體是pSE380，該質(zhì)粒具有如下特征帶有 Amp選擇標(biāo)記；4476 bp;被克隆的基因受控于TRC啟動(dòng)子；帶有多克隆位點(diǎn)(ploylinker site)。 圖3為酶促反應(yīng)液高效液相色譜圖
將酶促反應(yīng)液預(yù)處理后，用反相高效液相色譜法檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，檢測(cè)條件為C18柱(5ixtn， 250 mmX4.6咖)，流動(dòng)相乙腈-異丙醇(7:3)，柱溫30。C，流速1. 0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 ntn 。 圖4為標(biāo)品7-脫氫膽固醇高效液相色譜圖
標(biāo)品7-脫氫膽固醇的反相高效色譜法檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)條件為C18柱(5ym， 250 mmX4. 6mm)， 流動(dòng)相乙腈-異丙醇(7 : 3)，柱溫30。C,流速l.O mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm 。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述 實(shí)施例l
1文庫(kù)來(lái)源和質(zhì)粒
7果蠅cDNA文庫(kù)和pSE380均由本實(shí)驗(yàn)室保存。 2主要試劑
pGM-TSimple連接試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，BioSpin膠回收試劑盒、BioSpinPCR 產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自杭州博日科技有限公司。EcoR I和BamH I酶均購(gòu)自Fermentas公司。 3方法
3.1基因的克隆與測(cè)序
以自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5- GGGGMTTCCCTACTAGAAAATGACTGGMGC -3，下游引物為5-GGGGGATCCTTTTGCAACATAGGTTCGACC-3。采用25uL的反應(yīng)體系10Xbuffer 2. 5 uL， dTNPO. 5txL，正反向引物各0. 5 n L， cDNA模板0.5yL， rTaq酶0. 25uL，補(bǔ)水至25uL。 降落PCR條件為95'C 5 min, 94°C 50 s， 59'C 45 s， 72'C 2 min;先循環(huán)5次，每次下降 一度；然后94°C 50 s, 54'C 45 s， 72'C 2 min循環(huán)25次。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)，回收后與pGM-Tvector連接，得到重組質(zhì)粒。連接體系為pGM-T vector 1 u L, PCR產(chǎn)物5 UL， 10XT4 ligase buffer 1 u L, T4 DNA連接酶1 w L,雙蒸水2uL, 16°C連接過(guò)夜。用連接 液轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coh'DH5a ，在含Amp、 IPTG、 X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接種于含Amp的 LB培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證、測(cè)序。
3. 2 pSE380表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)上述擴(kuò)增得到的片段，采用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行片段的擴(kuò)增。以重組克隆載體為模板進(jìn)行 降落PCR擴(kuò)增，見(jiàn)附圖l。回收產(chǎn)物和pSE380分別經(jīng)過(guò)EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收后連 接，轉(zhuǎn)化f. cW/DH 5o， Amp抗性篩選，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR，酶切鑒定，將鑒定后的重組質(zhì) 粒測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證。
3.3 ￡coJ/ BL21(DE3)plysS的轉(zhuǎn)化和7、 8-脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)
將重組pSE380轉(zhuǎn)化感受態(tài)的BL21(DE3)plysS，取160yL轉(zhuǎn)化液涂布于LB(含氨芐青霉素 0. lg/tnl)平板上，37'C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，并用含有空白載體pSE380的菌株作為空白對(duì)照。從轉(zhuǎn)化 平板上挑取單菌落到5mL LB (含Amp 100ng/mL)液體培養(yǎng)基中，37°C 220 r/min搖床培養(yǎng)至0D6。。 =0.6左右，添加IPTG (異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)將 含有空白載體PSE380的菌株作為空白對(duì)照。通過(guò)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)。
3.4重組菌粗酶液提取
按照上述方法進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)誘導(dǎo)所得菌液8000 r/min離心5 min，取菌體沉淀懸浮于 PBS緩沖液中，超聲波破壁，離心取上清液即得粗酶液。取上清液300ml通過(guò)切向流膜過(guò)濾分離系 統(tǒng)濃縮純化分離蛋白酶，最終獲得粗酶液20 ml,用于酶學(xué)性質(zhì)等方面的研究。
3.5以膽固醇為底物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)鑒定將1 g膽固醇溶解于含Tween 80、 pH 7.4的磷酸緩沖溶液中，與10 ml粗酶液混合，常溫 避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)液用有機(jī)溶劑萃取，萃取劑(石油醚)與反應(yīng)液體積比為5: 1，萃取溫度38 一40'C，萃取時(shí)間50—80 min。為提高收率，可重復(fù)萃取2-3次。用反相高效液相色譜法檢測(cè)反 應(yīng)結(jié)果，檢測(cè)條件為C18柱(5um， 250mmX4.6mra)，流動(dòng)相乙腈-異丙醇(7:3)，柱溫3(TC， 流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm 。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液中有7-脫氫膽固醇，其出峰時(shí)間與標(biāo)品7-脫氫膽固醇一致，結(jié)果參見(jiàn)附圖3，圖4。
權(quán)利要求
1、一種編碼7、8-脫氫酶的基因，是從已構(gòu)建的果蠅cDNA文庫(kù)中獲得，其特征在于該基因編碼的酶由438個(gè)氨基酸組成，其分子量為51307.89Da，氨基酸序列組成如下MTSYSRFWMSLLENNWKPISNDFVICLWTLAVTFIRIYWIFFVPLEWKKDLDNEKWSFLRKTENVVCLAHKRDTINRLRKLKIQKIIELPPPYPNGWYGILKSSQLKAGEATCVSCLGEDLKLVIFRSKKDIVFILDAYCPHLGANSRIGRRVADDCRICPFHQWKFRGGDGLCINIPYSTSVPKVTKLKKWISQVMDGFIFIWYHAEQTELPWDLPVPMGEIADTFVYHGHNEFYTVCHIQEIPENGADEAHFNAAHKKNFINGSWAQKKRLFGLGSHHWKARWSPFTNLSYGKLKYLAEVNLSHTFKLKGKFGCFRMEVSGKQIGPSIVCLEVNSYTFGKIKVFQYITRVEPMLQKVVRSFYGPRWIAPLIPIFIYGEVLMFERDMEIFHHFVFNRNPILAKEDASIKKFRLWFSQFYSSNSKIYSEATNIGWSLQ
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼7、 8-脫氫酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如 下所示atgacatcat actcgcgatt ttggatgagc ctactagaaa atgactggaa gccgataaca aacgacttcg taatatgctt atggacattg gcggtaacct ttatacggat ttatctaatc ttttttgttc cactagaatg gaaaaaggat ttggacaacg aaaaatggtc atttttaagg aaaacagaaa atgtcgtttg cttggctcat aaacgagata ccataaaccg attaagaaaa ttaaaaattc aaaaaatcat cgaactacct cccccttatc caaeitggctg gtatggtatc ctcaaatcgt ctcagcttaa agctggggaa gcaacttgtg tgtcatgctt gggcg肪gat ctcaaactag tcatctttcg ttcaaagaaa gatatcgtgt ttattctgga tgcttattgc cctcacctag gagccaactc ccgtattggt aggcgcgttg ctgacgactg taggatatgc ccattccacc agtggaagtt cagaggcggt gatgggcaat gcattaacat accgtactca accagtgtgt tgaaggtaag aaagctgaag aaatggatca gtcaagtcat ggatggcttc atattcatct ggtaccacgc agagcacacg gagctgccat gggacctccc tgtcccaatg ggggagattg ccgatacatt tgtctatcac ggacacaatg agttttacac cgtttgccat attcaagaga taccggaaaa cggcgctgat gaagcgcact ttaatgccgc tcacaagaaa aattttatta atggcagttg ggctcaaa犯aaaagattgt ttggacttgg atctcatcat tggaaagcga ggtggtcccc atttaccaat cttagctacg gaaaattaaa atacttggcg gaagtaaacc taagtcatac atttaaacta aaaggaaagt tcggctgttt "tcgtatggaa gtttctggca aacagattgg accatcaatc gtgtgccttg犯gttaattc atatacattt ggaaaaatta aagttttcca atatattaca cgggtcgaac ctatgttgca aaaagttgtt cgatcgtttt atggtcctcg ttggattgcg ccacttatcc caatatttat ttatggagag gtcctgatgt ttgagcgtga catggagatc ttccaccact tcgtcttcaa tcgaaacccg attctggcaa acgaggacgc gagcatga犯aaattcagac tctggtttag ccagttatac agtagtaatt cacagatcag cagcgaggca accaatattg gttggtcgtt gcaa
3、 一種重組質(zhì)粒，其特征在于它含有權(quán)利要求1或2所述的基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的基因連接在pSE380上。
5、 一種基因工程菌，其特征在于它被根據(jù)權(quán)利要求3或4所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
6、 根據(jù)1權(quán)利要求1所述的編碼7、 8-脫氫酶基因的克隆與表達(dá)的方法，其特征在于(1) 從果蠅中獲取cDNA文庫(kù)和pSE380質(zhì)粒，保存于實(shí)驗(yàn)室中；(2) 基因的克隆與測(cè)序，自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，回收后與pGM-T vector連接，得到重組質(zhì)粒，用連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)￡ co力'DH5 a ,在含 A卿、IPTG、 X-gal的LB平板上挑取白色菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR 和酶切驗(yàn)證、測(cè)序；(3) 根據(jù)上述擴(kuò)增得到的片段，釆用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行片段的擴(kuò)增。以重組克隆載體為模 板進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物和pSE380分別經(jīng)過(guò)EcoR I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收后連接， 轉(zhuǎn)化f co"DH5ci， Amp抗性篩選，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR，酶切鑒定，將鑒定后的重組質(zhì)粒測(cè) 序，進(jìn)一步驗(yàn)證；(4) 《co7iBL21(DE3)plysS的轉(zhuǎn)化和7、 8-脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)，將重組pSE380轉(zhuǎn)化感受態(tài) 的BL21，取160 uL轉(zhuǎn)化液涂布于LB平板上，35—38'C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，并用含有空白載體 pSE380的菌株作為空白對(duì)照。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，35 —38°C , 搖床培養(yǎng)至0D卿^0.6左右，添加IPTG至終濃度為l咖ol/L，同時(shí)將含有空白載體pSE380的菌株 作為空白對(duì)照。通過(guò)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)；(5) 重組菌粗酶液提取，按照上述方法進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將培養(yǎng)誘導(dǎo)所得菌液8000 r/min離 心5min，取菌體沉淀懸浮于PBS緩沖液中，超聲波破壁，離心取上清液即得粗酶液。取上清液300 ml通過(guò)切向流膜過(guò)濾分離系統(tǒng)濃縮純化分離蛋白酶，最終獲得粗酶液20 ml，用于酶學(xué)性質(zhì)等方 面的研究；(6) 以膽固醇為底物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)鑒定，將1 g膽固醇溶解于含Tween80、 pH 7. 4的磷酸 緩沖溶液中，與10 ml粗酶液混合，常溫避光反應(yīng)12 h，反應(yīng)液用有機(jī)溶劑萃取，萃取劑與反應(yīng) 液體積比為5: 1，萃取溫度38—40'C，萃取時(shí)間50—80 min，用反相高效液相色譜法檢測(cè)反應(yīng) 結(jié)果，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液中有7-脫氫膽固醇，其出峰時(shí)間與標(biāo)品7-脫氫膽固醇一致；所述的萃取的 有機(jī)溶劑是石油醚；所述的檢測(cè)條件為C18柱5um, 250 mX4.6 ran,流動(dòng)相乙腈-異丙醇 為7 : 3,柱溫3(TC，流速l.O mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm 。
全文摘要
本發(fā)明是針對(duì)一種7、8-脫氫酶基因的克隆與表達(dá)，該編碼7、8-脫氫酶的基因是從已構(gòu)建的果蠅cDNA文庫(kù)中獲得，該酶可以轉(zhuǎn)化膽固醇為7-脫氫膽固醇，為生物法合成7-脫氫膽固醇提供一種新方法，得到的可以縮短維生素D₃的工藝路線(xiàn)，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C12N1/00GK101509004SQ20091011393
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者何鑫平, 吳孔陽(yáng), 夏小斌, 超 康, 張?jiān)崎_(kāi), 李湘萍, 李燦明, 梁智群, 晟 汪, 陳桂光, 黃時(shí)海 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)