專(zhuān)利名稱(chēng):乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用，屬于食品工業(yè)生 物技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA)，又叫氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成 的天然氨基酸，為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理功 能，如降低血壓、利尿、鎮(zhèn)痛安神、改善腦機(jī)能、增進(jìn)腦活力、促進(jìn)長(zhǎng)期記憶、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、 改善更年期綜合癥等。當(dāng)大腦長(zhǎng)期缺乏GABA將會(huì)導(dǎo)致癲癇、帕金森等疾病。同時(shí)GABA還與 腦衰老有關(guān)，其缺乏將導(dǎo)致老年人“耳不聰、目不明”。另外，GABA能促進(jìn)精子的穿卵能力，提 高受精率，以及可以提高飼料利用率和日增重。Y-氨基丁酸正被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品保 健、化工及農(nóng)業(yè)等行業(yè)。GABA的生產(chǎn)可以通過(guò)化學(xué)合成和生物合成。由于化學(xué)合成反應(yīng)條 件劇烈，化學(xué)原料和溶劑具有毒性或腐蝕性，副產(chǎn)物多，缺乏安全性，主要應(yīng)用于化工行業(yè)， 不適宜作為食品添加劑和醫(yī)藥。生物合成條件溫和、專(zhuān)一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、安全性高，因此以 生物合成法生產(chǎn)食品或醫(yī)藥級(jí)GABA是一條較理想的途徑。
谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)是生物體內(nèi)催化谷氨酸發(fā)生 α -脫羧生成GABA的唯一的酶。谷氨酸脫羧酶是一種依賴(lài)于5’-磷酸吡哆醛的脫羧酶，將 L-谷氨酸的α-羧基脫去，反應(yīng)產(chǎn)物為CO2和Y-氨基丁酸，其催化反應(yīng)如下圖。
HOOC-CH2-CH2-CH (NH2) -COOH — CO2+HOOC-CH2-CH2-CH2-NH2
目前已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了 GAD的存在，利用微生物中的GAD催化谷氨酸生產(chǎn)GABA，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)檢索，查到下列利用不同微 生物生產(chǎn)Y-氨基丁酸的文獻(xiàn)
文摘
用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌細(xì)胞制成固定化細(xì) 胞，與1 %谷氨酸溶液進(jìn)行間歇反應(yīng)、連續(xù)攪拌式反應(yīng)及連續(xù)柱式反應(yīng)生產(chǎn)GABA，間歇反 應(yīng)5小時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 100% ；連續(xù)攪拌式反應(yīng)在三角瓶反應(yīng)器中進(jìn)行，以6ml/h的流速 輸入底物溶液和輸出反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率達(dá)85% ；在連續(xù)柱式反應(yīng)器中反應(yīng)，控制流速12ml/ h，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。趙景聯(lián)等，生物工程學(xué)報(bào)，1989，5 (2) :124_128。
文摘
用海藻酸鈣包 埋法將大腸桿菌細(xì)胞制成固定化細(xì)胞，對(duì)后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進(jìn)行轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)GABA，GABA含量達(dá)到了 98. 94%，收率為49. 65%。章汝平等，長(zhǎng)沙電力學(xué)院學(xué)報(bào)(自然 科學(xué)版)，1998，13 (4) :433-435。
文摘
介紹了對(duì)Koji制作中GABA的變化，GABA含量達(dá) 至 Ij 了 120yg/g。Kono I 等，Biosci. Biotechnol. Bioenchem.，2000，64 (3) :617_619。
文 摘
利用 Monascus purpuresuNTU601 進(jìn)行固體發(fā)酵，GABA 含量達(dá)到了 5004mg/kg。Wang JJ 等，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2003，30 :669_676。
文摘
報(bào)道 了采用 Monascus purpureus CCRC31615 進(jìn)行固體發(fā)酵，GABA 含量達(dá)到 了 1200mg/kg。Su YC 等，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.，2003，30(1) :41_46。
文摘
介紹了從生產(chǎn)奶酪的菌株中分離到 一株Lactococcus Iactis 01-7，用于奶酪生產(chǎn)，奶酪的GABA含量達(dá)到了 250mg/100ml。許 建軍，博士學(xué)位論文，江南大學(xué)，2004年2月。
文摘
也對(duì)高產(chǎn)GABA乳酸菌篩選和發(fā)酵條件進(jìn)行了報(bào)道，發(fā)酵液中的GABA達(dá)到3. lg/1。劉清等，氨基酸和生物資源，2004，26(1) 40-43。
文摘
報(bào)道了利用Lactobacillus brevisIF012005對(duì)酒糟進(jìn)行發(fā)酵，GABA含量達(dá) 到了 10. 18mM，通過(guò)離心、絮凝、脫色和脫臭處理獲得了較好的GABA溶液，可用于食品強(qiáng)化 GABA。 Yokoyama S J. Biosci. Bioeng. , 2002,93 (1) :95_97。
^；才||
$_ Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)GABA，在干粉中含量達(dá)到了 5%。愛(ài)宕世 高等，食品科學(xué)，2001，No.8，81-85。
文摘
從韓國(guó)傳統(tǒng)食品Kimchi中分離的Lactobacillus brevis 0PK-3合成GABA的能力為84. 292mg/L/h。將其谷氨酸脫羧酶基因克隆并在大腸桿 菌UT481中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量為53. 4kDa，GAD的活力顯著提高。Park K. B.，Oh S. H.， Biores. Technol.，2007，98 :312_319。
文摘
將 Lactobacillus brevis 的谷氨酸脫羧羧酶 基因與大腸桿菌_芽孢桿菌穿梭載體PLip連接后轉(zhuǎn)化枯草桿菌168，得到的重組芽孢桿菌 合成GABA的能力明顯高于對(duì)照。將重組芽孢桿菌接入韓國(guó)傳統(tǒng)食品Chungkukjang后，也 提高了食品中 GABA 的含量。Park K. B.，OhS. H.，Biotechnol. Lett.，2006，28 :1459_1463。
本發(fā)明課題組專(zhuān)利“利用唾液鏈球菌嗜熱亞種生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法”， 公開(kāi)號(hào)CN1710088，
公開(kāi)日2005. 12. 21，該專(zhuān)利公開(kāi)了以唾液鏈球菌嗜熱亞種 (StreptococcusthermophiIus)為菌種，作用于谷氨酸、谷氨酸鹽、含谷氨酸或谷氨酸鹽的 物質(zhì)，使谷氨酸的α-羧基發(fā)生脫羧作用，從而生成Y-氨基丁酸，該法屬于生物合成法。本 發(fā)明涉及的谷氨酶脫羧酶基因即來(lái)自該菌株。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是提供一種乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因、表達(dá)產(chǎn)物及其用途。來(lái)自于 唾液鏈球菌嗜熱亞種谷氨酸脫羧酶基因的表達(dá)產(chǎn)物重組谷氨酸脫羧酶，用于生產(chǎn)Y-氨基 丁酸。
技術(shù)方案
一種乳酸菌谷氨酸脫羧酶全長(zhǎng)基因，其序列為SEQ ID Ν0. 1，來(lái)自唾液鏈球菌嗜熱 亞種Str印tococcus thermophilus，長(zhǎng)1380bp。該基因是一個(gè)以前沒(méi)有人發(fā)現(xiàn)過(guò)的DNA序 列，其堿基組成為
堿基數(shù)目百分比
A 401 29. 06
C 229 16.59
G 350 25. 36
T 400 28. 99
G+C 579 41.96
該基因編碼的推導(dǎo)氨基酸序列為SEQ ID N0. 2。其表達(dá)產(chǎn)物重組谷氨酸脫羧酶，分 子量為52. 4kDa。重組谷氨酸脫羧酶在生產(chǎn)Y -氨基丁酸方面的應(yīng)用，可高效地將谷氨酸轉(zhuǎn) 變?yōu)閅 "氨基丁酸，其最佳反應(yīng)溫度為55°C，最佳反應(yīng)pH為5. O。
有益效果
目前谷氨酸脫羧酶基因已公布的乳酸菌有Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum 禾口 Lactococcus lactis，H明入胃隆的唾液鏈球菌嗜熱亞種谷氨酸脫羧酶基因?yàn)閲?guó)際上首次報(bào)道。
本發(fā)明人在前期工作中分離到一株具有高活力谷氨酸脫羧酶的唾液鏈球菌嗜熱亞種，在分析數(shù)種細(xì)菌谷氨酸脫羧酶蛋白質(zhì)序列后，發(fā)現(xiàn)一些高度保守的氨基酸序列。通過(guò) 簡(jiǎn)并PCR以及SiteFinding PCR技術(shù)，克隆出嗜熱鏈球菌的谷氨酸脫羧酶全長(zhǎng)基因。
在該基因兩端分別加上NcoI和EcoRI限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的 PET-DsbA連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)pLysS,實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。
利用本發(fā)明基因，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的重組表達(dá)，克服了厭氧發(fā)酵的乳酸菌細(xì)胞 產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，可為人們提供大量的乳酸菌谷氨酸脫羧酶，也為以后構(gòu)建安全的谷氨酸脫 羧酶基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。而且該基因的表達(dá)產(chǎn)物最適反應(yīng)溫度為55°C，明顯高于其他 乳酸菌的谷氨酸脫羧酶，與現(xiàn)有技術(shù)中的谷氨酸脫羧酶相比，反應(yīng)時(shí)不易污染雜菌，在工業(yè) 應(yīng)用上具有優(yōu)勢(shì)。
四具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 唾液鏈球菌嗜熱亞種谷氨酸脫羧酶基因的克隆
將唾液鏈球菌嗜熱亞種(Sti^ptococcus thermophilus)(見(jiàn)參考文獻(xiàn)谷氨酸脫 羧酶活力測(cè)定中GABA比色定量方法研究，食品科學(xué)，2006，27 205-209)接入IOOml MRS培 養(yǎng)基，40°C靜置培養(yǎng)12小時(shí)。離心收集菌體，用上海賽百盛公司基因組DNA提取試劑盒提 取唾液鏈球菌嗜熱亞種的基因組DNA。
從NCBI網(wǎng)站中搜索幾種細(xì)菌谷氨酸脫羧酶，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，用C0DEH0P 程序(Timothy Μ. R. , Emily R. S. , Jorja G. H. et al. Consensus-degenerate hybrid οligonucleotideprimers for amplification of distantly related sequences. Nucleic Acids Res.，1998，26 :1628 1635.)設(shè)計(jì)出兩個(gè)簡(jiǎn)并引物
引物 15，GGTACATCTACAATTGGTTCTTCTGARGCNTGYATG 3，
引物 25，AAACCACCAGAAGCAGCRTCNACRTGNAT 3，
在100 μ 1體系中，引物終濃度各為1 μ Μ, dNTPs終濃度為0. 2mM,唾液鏈球菌嗜熱 亞種基因組DNA10ng，4U Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min ；30 X (94°C 30s, 59°C 50s, 72°C 40s) ；72°C IOmin0瓊脂糖凝膠電泳，切膠，采用天為時(shí)代試劑盒回收，將回收的PCR產(chǎn) 物與TaKaRa公司pMD 19-T vector連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，涂于含有IPTG、Χ-gal、氨芐 青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后 送到上海生工測(cè)序。
根據(jù)獲得的谷氨酸脫羧酶基因部分序列，設(shè)計(jì)以下引物，進(jìn)行SiteFinding PCR(TanG. ,Gao Y. ,Shi M. ,et al. SiteFinding-PCR :a simple and efficient PCR method for chromosomewalking. Nucleic Acids Res.，2005，33 :el22.)，以獲得全長(zhǎng)序列。
Finderl 5’ CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCAAGCGGC
CGCNNNNNNGCCT 3，
Finder2 5’ CACGACACGCTACTCAACACACCACCTCGCACAGCGTCCAAGCGGC
CGCNNNNNNATGC 3，
SFPl 5' CACGACACGCTACTCAACAC 3'
SFP2 5，ACTCAACACACCACCTCGCACAGC 3’[0036]gspFl 5， CGCCGATGGCAAGAAAAACGTAAAGC 3，
gspF2 5， ATGAGCTCGGCAGTTCAAGTTTGTTGG 3，
gspF3 5’ GGTGTGGTTGCCATCATGGGTGTG 3’
gspRl 5’ GGATCCCATCCAAAACTTTAGCAATCTTGTC 3’
gspR2 5’ CACACCCATGATGGCAACCACACC 3’
gspR3 5’ GCCATCGGCGTTTCAAAGCCAAACCACC 3’
SiteFinding PCR
擴(kuò)增上游部分?jǐn)U增下游部分
IOXPCRbuffer2μ 1 2μ 1
25mM MgCl21· 2 μ 1 1· 2 μ 1
10 μ M Finderl1 μ 1 Finder21 μ 1
2. 5mM dNTPs2 μ 1 2 μ 1
唾液鏈球菌嗜熱亞種基因組DNA 5ng5ng
ddH20up to 20 μ 1up to 20 μ 1
Taq DNA 聚合酶(IU/ μ 1)0. 5 μ 10. 5 μ 1
將上述混合液短暫離心，置于MJ Research PCR熱循環(huán)儀PTC-100中，PCR程序如 下92°C2min ；95°C Imin ；25°C Imin ；Slope+43°C，0. 2/sec ；68°C IOmin0
反應(yīng)結(jié)束后，置于冰上，往反應(yīng)液中加入
20 μ M SFPl 2. 5 μ 12. 5 μ 1
10 μ M gspRl 1 μ 1 gspFl 1 μ 1
25mM MgCl2 0. 3 μ 10. 3 μ 1
10 X PCR buffer 0. 5 μ 10. 5 μ 1
ddH20 0· 7 μ 10. 7 μ 1
將上述混合液短暫離心，置于MJ Research PCR熱循環(huán)儀PTC-100中，PCR程序如 下94°CImin ；30X (95°C IOs ；68°C 6min) ；72°C IOmin0 反應(yīng)結(jié)束后，從 PCR 產(chǎn)物中各取 1 μ 1，加入99 μ 1 ddH20,分別作為以下PCR擴(kuò)增的模板。
IOXPCRbuffer 5μ 15μ 1 5μ 15μ 1
10 μ M gsp primer 5 μ 1 gspR2 5 μ 1 gspR3 5 μ 1 gspF2 5 μ 1 gspF3
10 μ M SFP25μ 1 5μ 1 5μ 15μ 1
2. 5mM dNTPs4μ 1 4μ 1 4μ 14μ 1
25mM MgCl23μ 1 3μ 1 3μ 13μ 1
模板2μ 1 2μ 1 2μ 1 2μ 1
CldH2O 25 μ 1 25 μ 1 25 μ 1 25 μ 1
Taq DNA 聚合酶(IU/ μ 1) 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1
短暫離心，置于MJ Research PCR熱循環(huán)儀PTC-100中，PCR程序如下94°C Imin ； 30 X (950C IOs ；680C 6min) ；72°C IOmin0 PCR結(jié)束后各取5 μ 1反應(yīng)液走瓊脂糖凝膠電泳， 確定有特異性條帶出現(xiàn)。
將PCR產(chǎn)物純化后與TaKaRa公司的pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5a，涂于含有IPTG、X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后送到上海生工測(cè)序。
用計(jì)算機(jī)分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)1380bp的0RF，即唾液鏈球菌嗜熱亞種谷氨 酸脫羧酶基因gad，編碼一個(gè)由459個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2 谷氨酸脫羧酶基因原核表達(dá)載體構(gòu)建
根據(jù)獲得的谷氨酸脫羧酶基因序列，設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，上游引物加上NcoI識(shí)別序列 (為了加上NcoI識(shí)別序列CCATGG，在谷氨酸脫羧酶基因起始密碼子ATG與第二個(gè)密碼子 AAT之間插入了一個(gè)密碼子GGC，以使NcoI從該位點(diǎn)切割，重組谷氨酸脫羧酶氨基酸序列也 相應(yīng)地比天然酶的序列多了一個(gè)甘氨酸)，下游引物加上EcoRI識(shí)別序列(下劃線部分為限 制酶識(shí)別序列)
上游引物5，CGACCATGGGCAATGAGAAGCTATTCAGAG 3，
下游引物5，GACGAATTCTTAATGATGGAAGCCACTGCG 3，
按照下列PCR體系加入各成分，擴(kuò)增谷氨酸脫羧酶基因
IOXPfu PCR buffer 10 μ 1
10 μ M 上游引物10 μ 1
10 μ M 下游引物10 μ 1
2. 5mM dNTPs8 μ 1
嗜熱鏈球菌基因組DNAIOng
ddH20 up to 100 μ 1
Pfu DNA 聚合酶5U
PCR 程序?yàn)?94°C 2min ；30 X (94°C 45s ；58°C 50s ；72°C 4min) ；72°C IOmin0
用天為時(shí)代PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，加NC0I、EC0RI雙酶切，滅活，乙醇 沉淀，ddH20重溶，與適量的用相同限制酶消化的載體pET-DsbA(購(gòu)自深圳勤寶升公司)連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取幾個(gè)菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)， 小量提取質(zhì)粒，電泳，以電泳滯后的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，確定連接成功后送到上海生 工測(cè)序。
實(shí)施例3 嗜熱鏈球菌谷氨酸脫羧酶在大腸桿菌中的表達(dá)
將含有唾液鏈球菌嗜熱亞種谷氨酸脫羧酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pET-gad轉(zhuǎn)化大腸桿 菌表達(dá)宿主菌株BL21 (DE3)pLysS(購(gòu)自深圳勤寶升公司)，在37°C培養(yǎng)10-11小時(shí)后挑取 小菌落，接入含有氨芐青霉素的50ml LB液體培養(yǎng)基，70-90rpm 30°C培養(yǎng)過(guò)夜，按照1 40 的體積比取種子液加入到含有氨芐青霉素的100ml LB液體培養(yǎng)基，350C ISOrpm振蕩2_3小 時(shí)至0D600約為0. 6時(shí)加IPTG (終濃度100 μ g/ml)誘導(dǎo)。1. 5小時(shí)后離心收集菌體。破碎 菌體，按照《酶工程》(郭勇主編，中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000年)所述方法提取谷氨酸脫羧酶， 將酶液與含谷氨酸或谷氨酸鹽的物質(zhì)混合(也可以不破碎菌體，直接利用菌體與谷氨酸或 谷氨酸鹽溶液反應(yīng))，在PH3. 2 8. 0，20 80°C下反應(yīng)，得到含、-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液，其 最佳反應(yīng)溫度為55°C，最佳反應(yīng)pH為5. 0。
序列表
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用
<1；30> 說(shuō)明書(shū)[0090]<140>00
<141>2007-05-09
<160>4
<170>PatentIn version 3. 1
<210>1
〈211>1380
<212>DNA
<213>Streptococcus thermophilus (嗜熱鏈球菌)
〈220〉
〈221〉嗜熱鏈球菌谷氨酶脫羧酶基因
〈222〉(1) · . (1380)
〈223〉
<400>1
atgaatgaga agctattcag agagattatg gagattaatc caatctatgc tcgccccgga 60
gaaaacactg aggcaccaag gtttaaaatg ccaacagatg cgatgttacc agagactgct 120
taccaaattg ttcatgacga atcaatgatg gatggtaatg cccgtttgaa tttggcaaca 180
tttgtttcca cttggatgga tgaacgagca gataaattgt atcgggaagc ttttgacaaa 240
aatgctattg ataaagacga gtatccagag actgctcgta tcgagaccta ttgttggaca 300
atgttggctg atttgtggca tgcaccgaaa ccaaaagaaa ctatcggctg ttctaccact 360
ggttcttcag aagcgtgtat gttaggtggt ttggctttga aacgccgatg gcaagaaaaa 420
cgtaaagcag aaggtaagcc tattgacaag ccaaatttgg taatgagctc ggcagttcaa 480
gtttgttgga aaaagttttg caattatttc gatgtggagc cacgttatgt accaatcagt 540
ttagaacaca aagttttaga tggatatgaa ttagaaaaat acgtggatga gaataccatt 600
ggtgtggttg ccatcatggg tgtgacttac actgggatgt atgaaccggt agacaagatt 660
gctaaagttt tggatgggat ccaagaaaaa actggactgg atatccaaat ccatgtggat 720
gctgcttccg gtggaatgat cgcacctttt tcacaaccgg ataatgtatg ggattttcgt 780
ttagaacgcg tagcttctat caatacttca ggtcataagt atgggttggt ttatcctgga 840
ttaggctggg tagtgtggcg tgattgtcag tcactgcctg acagtttgat ttttaaagta 900
agttatctgg gaggaacgat gccgacgttc gctttgaatt tctcacgtcc gggggcgcag 960
attctgttgc aatattgggc gtttttgcgt tacggttttg aaggttataa aaaagtacaa 1020
ggtgccacaa gtgatgtggc gcgttatttg gctaatgaga ttaaaaagat tggccccttt 1080
gagttgtgga atgatgcttc ggatattccg gtgtttgctt ggatgatgaa aaaagatcaa 1140
aaacacaatt gggggcttta tgatctatct gatcggttac ggatgaaagg ctggttgata 1200
ccagcgtatc cgatgccaac caatttaaca gatttgactg ttcaacgaat cgttgtgcga 1260
aacggtttgg ggatggatct agcggatcaa ttgattaacg atatgaaaac cgaagtcgct 1320
tatcttgaaa aattggatca gccactaccg gaaaatcatc gcagtggctt ccatcattaa 1380
<210>2
<211>459
<212> PRT[0129]<213>Str印tococcus thermophilus (嗜熱鏈球菌)
<220>
<221>嗜熱鏈球菌谷氨酸脫羧酶
<222>(1). . (459)<223>
<400>2
Met Asn Glu Lys Leu Phe Arg Glu lie Met Glu lie Asn Pro lie Tyr
151015
Ala Arg Pro Gly Glu Asn Thr Glu Ala Pro Arg Phe Lys Met Pro Thr
202530
Asp Ala Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln lie Val His Asp Glu Ser
354045
Met Met Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu Ala Thr Phe Val Ser Thr
505560
Trp Met Asp Glu Arg Ala Asp Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Phe Asp Lys
65707580
Asn Ala lie Asp Lys Asp Glu Tyr Pro Glu Thr Ala Arg lie Glu Thr
859095
Tyr Cys Trp Thr Met Leu Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Lys Pro Lys
100105110
Glu Thr lie Gly Cys Ser Thr Thr Gly Ser Ser Glu Ala Cys Met Leu
115120125
Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln Glu Lys Arg Lys Ala Glu
130135140
Gly Lys Pro lie Asp Lys Pro Asn Leu Val Met Ser Ser Ala Val Gln
145150155160
Val Cys Trp Lys Lys Phe Cys Asn Tyr Phe Asp Val Glu Pro Arg Tyr
165170175
Val Pro lie Ser Leu Glu His Lys Val Leu Asp Gly Tyr Glu Leu Glu
180185190
Lys Tyr Val Asp Glu Asn Thr lie Gly Val Val Ala lie Met Gly Val
195200205
Thr Tyr Thr Gly Met Tyr Glu Pro Val Asp Lys lie Ala Lys Val Leu
210215220
Asp Gly lie Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp lie Gln lie His Val Asp
225230235240
Ala Ala Ser Gly Gly Met lie Ala Pro Phe Leu Gln Pro Asp Asn Val
245250255
Trp Asp Phe Arg Leu Glu Arg Val Ala Ser lie Asn Thr Ser Gly His[0168]260265270
Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly Trp Val Val Trp Arg Asp
275280285
Cys Gln Ser Leu Pro Asp Ser Leu lie Phe Lys Val Ser Tyr Leu Gly
290295300
Gly Thr Met Pro Thr Phe Ala Leu Asn Phe Ser Arg Pro Gly Ala Gln
305310315320
lie Leu Leu Gln Tyr Trp Ala Phe Leu Arg Tyr Gly Phe Glu Gly Tyr
325330335
Lys Lys Val Gln Gly Ala Thr Ser Asp Val Ala Arg Tyr Leu Ala Asn
340345350
Glu lie Lys Lys lie Gly Pro Phe Glu Leu Trp Asn Asp Ala Ser Asp
355360365
lie Pro Val Phe Ala Trp Met Met Lys Lys Asp Gln Lys His Asn Trp
370375380
Gly Leu Tyr Asp Leu Ser Asp Arg Leu Arg Met Lys Gly Trp Leu lie
385390395400
Pro Ala Tyr Pro Met Pro Thr Asn Leu Thr Asp Leu Thr Val Gln Arg
405410415
lie Val Val Arg Asn Gly Leu Gly Met Asp Leu Ala Asp Gln Leu lie
420425430
Asn Asp Met Lys Thr Glu Val Ala Tyr Leu Glu Lys Leu Asp Gln Pro
435440445
Leu Pro Glu Asn His Arg Ser Gly Phe His His
450455
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>嗜熱鏈球菌谷氨酶脫羧酶基因上游引物
<222>(1). . (30)
<223>
<400>3
cgaccatggg caatgagaag ctattcagag 30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成[0207]<220>
<221>嗜熱鏈球菌谷氨酶脫羧酶基因下游引物
<222>(1). . (30)
<223>
<400>4
gacgaattct taatgatgga agccactgcg 30
權(quán)利要求
一種乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因，其序列為SEQ ID NO.1，來(lái)自唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)，長(zhǎng)1380bp。
2.按權(quán)利要求
1所述基因重組表達(dá)產(chǎn)生的乳酸菌谷氨酸脫羧酶，其特征為SEQID NO. 2。
3.權(quán)利要求
2所述的重組乳酸菌谷氨酸脫羧酶在生產(chǎn)Y-氨基丁酸方面的應(yīng)用。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及一種乳酸菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用，屬于食品工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域：
。該基因來(lái)自唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus thermophilus)，長(zhǎng)1380bp。通過(guò)PCR從基因組DNA中擴(kuò)增獲得，在該基因兩端分別加上NcoI和EcoRI限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的pET-DsbA連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3)pLysS，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物谷氨酸脫羧酶分子量為52.4kDa。重組酶可將L-谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸。該基因的表達(dá)為γ-氨基丁酸的酶法合成提供大量的、高活力的粗酶，降低酶法合成γ-氨基丁酸的成本。這種γ-氨基丁酸的合成方法屬于生物合成法，反應(yīng)條件溫和，作用專(zhuān)一，無(wú)副產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中均有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N9/88GKCN101063144 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710022222
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2007年5月10日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 林謙, 焦陽(yáng), 王煜, 鄒曉葵, 陸兆新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (2),