專利名稱：一種釀酒酵母Rav1p基因的克隆與表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Ravlp基因的克隆與表達(dá)，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
V-ATP酶通過水解ATP產(chǎn)生的能量將H+從細(xì)胞質(zhì)泵到胞外或者從細(xì)胞質(zhì)泵到一些膜包圍細(xì)胞器腔內(nèi)，來維持細(xì)胞質(zhì)的中性pH、囊腔內(nèi)的酸性pH和胞外的酸性pH。同時也為某些特殊的生化反應(yīng)提供特殊的PH環(huán)境。以釀酒母為例，V-ATP酶由兩大結(jié)構(gòu)復(fù)合體V1和V0構(gòu)成。V1暴露在膜表面，是水溶性的呈球狀，屬于催化ATP水解產(chǎn)生質(zhì)子的區(qū)域，由A、B、C、D、E、F、G和H八種亞基組成'N0包埋于膜內(nèi)，呈柄狀，屬于傳遞質(zhì)子的區(qū)域，由a、c、c’、c”、d和e六種亞基組成。研究表明V-ATP酶在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、分泌蛋白的儲存、蛋白降解、細(xì)胞內(nèi)的膜運輸、某些細(xì)胞器的膜融合、Na+的吸收、腎酸化、男性精子的成熟、破骨細(xì)胞的骨重吸收等生理過程中起到了重要的作用。同時許多人類疾病如骨癥、腎小管性酸中毒和腫瘤轉(zhuǎn)移等都與V-ATP酶的生理功能有著重要關(guān)系。V-ATP酶的調(diào)節(jié)機(jī)制主要包括三種途徑=V1和Vtl的可逆分解；V_ATP酶的選擇性定位；改變ATP水解與質(zhì)子轉(zhuǎn)移之間偶聯(lián)效率。V1從脂雙層中的Vtl上的可逆脫落是V-ATP酶重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。這種調(diào)節(jié)機(jī)制在酵母細(xì)胞和一些昆蟲的中腸細(xì)胞中比較常見。單獨的V1不能水解ATP，單獨的Vtl不能旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移質(zhì)子。這種調(diào)節(jié)機(jī)制在葡萄糖水平降低時產(chǎn)生，是對葡萄糖水平降低的一種節(jié)能反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞中葡萄糖水平降低時，V1從Vtl上脫落下來，當(dāng)細(xì)胞中葡萄糖水平回升時，V1又重新與Vtl結(jié)合形成有活性的V-ATP酶而不需要重新合成各個小亞基組裝成V-ATP酶。這種調(diào)控作用是通過Ravlp、Rav2p、Skplp所構(gòu)成的RAVE復(fù)合物與'的可逆相互作用來完成的。在殺滅食品飲料中釀酒酵母細(xì)胞的食品加工過程中，如果是利用高壓二氧化碳?xì)玑劸平湍富罴?xì)胞，釀酒酵母的V-ATP酶的活性越高，其二氧化碳耐受性就越高，越難被 殺死。如果將釀酒酵母的Ravlp敲除使其V-ATP酶的活性降低，就可以構(gòu)建高壓二氧化碳敏感性菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種釀酒酵母Ravlp亞基的基因克隆與表達(dá)。針對釀酒酵母中RAVE復(fù)合物的最大亞基Ravlp亞基的基因(4074bp)設(shè)計了引物1:5’ -ACCG￡MII￡ATGTCATTGAACTTTCTTCCAGGACGCC-3’ (EcoR I)引物2:5’ -CTACGCGTCGACTACAAAGTCATCTAGTAAGTTCTTG-3’ (Sal I)，建立了釀酒酵母Ravlp基因的克隆方法、釀酒酵母Ravlp基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法、Ravlp在大腸桿菌中的高效表達(dá)的方法和Ravlp的純化方法。本發(fā)明的技術(shù)方案:在GenBank中查找釀酒酵母的Ravlp基因序列，設(shè)計出特異性引物，以釀酒酵母基因組DNA為模板克隆出Ravlp基因序列。將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28a同時進(jìn)行雙酶切，然后將其連接到表達(dá)載體上。經(jīng)過PCR驗證、單酶切驗證、雙酶切驗證、測序驗證篩選陽性重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)宿主中，實現(xiàn)Ravlp的原核表達(dá)。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明人的方法，采用酶解法提取釀酒酵母BY4742的基因組DNA,以其為模板克隆出Ravlp基因的全序列，并在兩端加上了 EcoR I和Sal I限制性內(nèi)切酶的識別位點，與經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理的pET28a表達(dá)質(zhì)粒相連并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)宿主，從而實現(xiàn)在大腸桿菌中的表達(dá)。利用本發(fā)明人構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步實現(xiàn)Ravlp在釀酒酵母細(xì)胞的基因敲除，從而可以構(gòu)建高壓二氧化碳敏感型的釀酒酵母菌株，此釀酒酵母菌株將在食品飲料發(fā)酵后，用高壓二氧化碳滅活，既達(dá)到了除菌的目的，又不會影響食品飲料的風(fēng)味物質(zhì)。
四

圖1.表達(dá)質(zhì)粒pET28a的不意圖。圖2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET_28a_Ravl的示意圖。圖3.pET28a_Ravl重組質(zhì)粒的雙酶切以及PCR鑒定。1，2:PCR鑒定結(jié)果；3 =EcoRI 和 Sal I 酶切重組質(zhì)粒；M1:Ikb DNA Ladder Marker。圖4.pET28a-Ravl重組質(zhì)粒的單酶切鑒定。4 =EcoR I酶切重組質(zhì)粒；5 =Xho I酶切重組質(zhì)粒；M2:lkb DNA Marker P。圖5.Ravlp誘導(dǎo)表達(dá)純化后的SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:40mmol/L咪唑的洗脫 蛋白樣品；2，3:60mmol/L咪唑的洗脫蛋白樣品；4，5:150mmol/L咪唑的洗脫蛋白樣品；6:300mmol/L咪唑的洗脫蛋白樣品；7，8:500mmol/L咪唑的洗脫蛋白樣品。
權(quán)利要求
1.一種釀酒酵母中Ravlp的基因的克隆方法。其特征是:針對釀酒酵母中RAVE復(fù)合物中的Ravlp亞基的基因，設(shè)計了引物引物 1:5’ ACCGeMII￡ATGTCATTGAACTTTCTTCCAGGACGCC-3’ (EcoR I)引物 2:5’ -CTACGCGTCGACTACAAAGTCATCTAGTAAGTTCTTG-3’ (Sal I)， 以提取的基因組DNA為模板，用引物I和引物2擴(kuò)增出長4074bp的目的基因，然后連接到表達(dá)載體pET28a上，從而構(gòu)建Ravlp基因的重組原核表達(dá)載體。具體操作方法見實例1
2.一種釀酒酵母Ravlp在大腸桿菌中的表達(dá)方法，其特征是:以權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)宿主中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，實現(xiàn)Ravlp的高效表達(dá)。具體操作見實例2。
3.一種純化含HisTag標(biāo)簽的Ravlp的方法，其特征是:用權(quán)利2所述的經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，高速離心后取上清用0.45 ii m的濾膜過濾，然后用His TrapHP Iml親和層析柱,利用GEHealthcare公司的蛋白純化儀AKTAavant純化Ravlp。具體操作方法 見實例3。
全文摘要
一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Rav1p基因的克隆與表達(dá)方法，本發(fā)明設(shè)計了一對特異性引物，引物15’-ACCGGAATTCATGTCATTGAACTTTCTTCCAGGACGCC-3’(EcoR I)引物25’-CTACGCGTCGACTACAAAGTCATCTAGTAAGTTCTTG-3’(Sal I)，構(gòu)建了釀酒酵母Rav1p的克隆方法和高效表達(dá)方法。RAVE復(fù)合物是調(diào)節(jié)釀酒酵母V-ATP酶活性的蛋白復(fù)合體，而Rav1p是RAVE復(fù)合物中分子量最大的一個亞基，利用本發(fā)明人構(gòu)建的重組質(zhì)?？梢詫崿F(xiàn)Rav1p在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的基因敲除，從而構(gòu)建高壓二氧化碳敏感型釀酒酵母菌株。在食品飲料發(fā)酵后，可用高壓二氧化碳滅活此酵母菌，既達(dá)到了除菌的目的，又不會影響食品的風(fēng)味。
文檔編號C12R1/865GK103160517SQ20111042276
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者張震宇, 徐燦 申請人:江南大學(xué)