專(zhuān)利名稱(chēng)：耐熱植酸酶及其基因的克隆和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植酸酶，特別涉及一種植酸酶及其基因的克隆和表達(dá)。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)，農(nóng)村廣泛使用化肥，化肥可以增加土壤肥力，但連續(xù)使用化肥，肥效日減，不得不加大施肥量。而過(guò)量施用化肥，則會(huì)造成土壤板結(jié)，地力減弱，還破壞農(nóng)作物品質(zhì)。同時(shí)造成化學(xué)殘留公害，污染環(huán)境(如水體富營(yíng)養(yǎng)化)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，危及子孫后代。在七十年代，國(guó)際上成立了“有機(jī)農(nóng)業(yè)聯(lián)盟”，在世界范圍呼吁不用或盡量少用化肥，大力提倡使用有機(jī)肥料。在這種共識(shí)下，世界各國(guó)均在努力以生物菌肥來(lái)取代化肥?，F(xiàn)美國(guó)已有5％的農(nóng)場(chǎng)發(fā)展為不用化肥和農(nóng)藥的無(wú)化學(xué)農(nóng)場(chǎng)。德國(guó)正在鼓勵(lì)和發(fā)展不用化肥，已有3％的農(nóng)田采用生態(tài)農(nóng)業(yè)模式。前蘇聯(lián)也有1/2豆類(lèi)農(nóng)作物使用微生物肥料。
現(xiàn)有生物肥料的活性大多是礦化不溶性無(wú)機(jī)磷[Ca3(PO4)2·Ca(OH)2]和部分有機(jī)磷。使耕層土壤中的無(wú)效磷成為植物可以利用的磷營(yíng)養(yǎng)。耕層土中的磷15％--95％為有機(jī)形態(tài)。其中大量有機(jī)磷以植酸的形式存在。特別是提倡秸桿還田和使用糞肥以后，更多的植酸被帶入耕層。許多研究表明決定磷對(duì)植物的有效性的主要因素不是土壤內(nèi)有機(jī)磷的含量，而是礦化速率。植酸酶的作用底物是植酸及其鹽類(lèi)，它能釋放出有效磷。
然而，植物所編碼的植酸酶是非分泌型的，由于缺少胞外植酸酶活力，植物對(duì)于土壤中有機(jī)磷的主要成分植酸的利用率很低。自然狀態(tài)下由某些微生物產(chǎn)生的植酸酶(3-肌醇六磷酸酶，Myo-Inositol-hexaphosphate 3-phosphohydrolase)可作用于酯鍵，催化磷酸單酯水解，能將植酸水解為肌醇和無(wú)機(jī)磷。具體反應(yīng)為
同時(shí)植酸酶是一種能將飼料中植酸水解成無(wú)機(jī)磷和肌醇的新型單胃動(dòng)物飼料添加劑，這是當(dāng)前世界性的研究熱點(diǎn)之一。磷在植物中主要以植酸(肌醇六磷酸)及其鹽類(lèi)的形式存在。它們?cè)谥参锖陀土献魑锓N子中的含量占干重的1％-3％，但卻貯存著植物中總磷的60％-90％，是種子萌發(fā)所需磷的主要來(lái)源。動(dòng)物所需的磷主要從植物中獲取。動(dòng)物的生長(zhǎng)、繁殖、骨骼礦化及代謝都需要磷。然而，在人和單胃動(dòng)物的食物中，來(lái)源于植物的植酸具有強(qiáng)烈的抗?fàn)I養(yǎng)作用。美國(guó)肯塔基大學(xué)通過(guò)10年研究證實(shí)，豬只能利用玉米中磷的10％-20％，豆餅中磷的15％-35％，而雞對(duì)玉米和豆粕中磷的利用率比豬還低。由此可見(jiàn)，食物中85％左右的磷未能有效吸收就從糞便中排出。
磷作為一種必須的礦物營(yíng)養(yǎng)素在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中具有重要作用。為預(yù)防磷缺乏病，又必須在食物或飼料中添加無(wú)機(jī)磷酸鹽，以滿足畜禽對(duì)磷的需求，因此，造成磷酸的嚴(yán)重浪費(fèi)。人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家研究表明，植酸的這種性質(zhì)也導(dǎo)致了人類(lèi)鈣、鋅、鐵、鉀的缺乏和數(shù)量不平衡。由于植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用造成了食物利用率低下、營(yíng)養(yǎng)無(wú)利用流失和必須營(yíng)養(yǎng)的“添加浪費(fèi)”現(xiàn)象，也是一直困擾食品和飼料工業(yè)的一大難題。
植酸酶可解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高食品及飼料中礦物元素和蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)有效性以及能量平衡能力。Nayini等(1983)證明，添加植酸酶經(jīng)過(guò)約2小時(shí)發(fā)酵后，植酸鹽含量可降低58％-70％。植酸酶能從植酸分子上將磷酸水解下來(lái)，破壞了它對(duì)礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的親和力，從而提高礦物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)有效性和蛋白質(zhì)的消化率；同時(shí)可使一些酶如淀粉酶等恢復(fù)其原有的活性，提高了食品和飼料的能量有效性。Simons等將植酸酶添加到雞飼料中，飼喂肉用仔雞，試驗(yàn)表明，添加植酸酶可使磷的利用率提高60％，糞便中磷排出量減少40％，顯著提高了肉仔雞的增重量和飼喂效果。由此可見(jiàn)，在講究膳食營(yíng)養(yǎng)和注重飼料利用率的今天，研究和利用植酸酶具有相當(dāng)重要的意義。
然而，植酸酶應(yīng)用于農(nóng)業(yè)及食品和飼料添加劑，需要進(jìn)行工業(yè)化加工和處理，為此，要求植酸酶在經(jīng)過(guò)較高溫度的工藝加工和處理后，仍能保持較高的生物活性。而現(xiàn)有的植酸酶其耐溫性較差，使植酸酶在農(nóng)業(yè)及食品和飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用受到制約。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行的研究，目的是篩選一種可產(chǎn)生耐熱植酸酶的菌株，利用分子生物學(xué)的手段，將編碼此產(chǎn)物的基因進(jìn)行基因克隆和表達(dá)；提供一種經(jīng)過(guò)較高溫度的工藝加工和處理后仍具有生物活性的耐熱植酸酶。
本發(fā)明的技術(shù)方案是篩選一種可產(chǎn)生耐熱植酸酶的天然菌株，并從菌株中提取基因DNA，采用PCR方法(ManiatisT.，et al.Molecular cloning.New Yorkcold spring harberlaberalory，1982)擴(kuò)增出耐熱植酸酶基因。利用連接酶將此基因連接于克隆載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，檢出陽(yáng)性克隆。對(duì)于陽(yáng)性克隆所攜帶目的基因進(jìn)行全序列分析。耐熱植酸酶基因DNA序列為S1，由DNA序列推導(dǎo)出氨基酸序列為S2。
<110>天津師范大學(xué)<120>耐熱植酸梅及其基因的克隆和表達(dá)<160>1200<211>383
<212>DNA<213>芽孢桿菌(Bacillus sp.)<400>1S1NewSequence SequenceATGAATCATT CAAAAACACT TTTGTTAACC GCGGCAGCCG GATTGATGCT 50CACATGCGGT GCGGTTTCTT CCCAGGCCAA GCATAAGCTG TCTGATCCTT 100ATCACTTTAC CGTGAATGCG GCGGCGGAAA CGGAGCCGGT TGATACAGCC 150GGTGATGCAG CTGATGATCC TGCGATTTGG CTGGACCCCA AGAATCCTCA 200GAACAGCAAA TTGATCACAA CCAATAAAAA ATCAGGCTTA GTCGTGTACA 250GCCTAGAGGG AAAGACGCTT CATTCCTATC ATACCGGGAA GCTGAACAAT 300GTTGATATCC GCTATGATTT TCCGTTGAAC GGAAAAAAAG TCGATATTGC 350GGCGGCATCC AATCGGTCTG AAGGAAAGAA TACCATTGAG ATTTACGCCA 400TTGACGGGAA AAACGGCACA TTACAAAGCA TTACAGATCC AGACCGCCCG 450ATTGCATCAG CAATTGATGA AGTATACGGT TTCAGCTTGT ACCACAGTCA 500AAAAACAGGA AAATATTACG CGATGGTGAC AGGGAAAGAA GGCGAATTTG 550AACAATACGA ATTAAATGCG GATAAAAATG GATACATATC CGGCAAAAAG 600GTAAGGGCGT TTAAAATGAA TTCTCAGACA GAAGGGATGG CAGCAGACGA 650TGAATACGGC AGTCTTTTAT TCGCAGAAGA AGATGAGGCC ATCTGGAAGT 700TCAGCGCTGA GCCGGACGGC GGCAGTAACG GAACGGTTAT CGATCGTGCC 750GACGGCAGGC ATTTAACCCC TGATATTGAA GGACTGACGA TTTACTACGC 800TGCTGACGGG AAAGGTTATC TGCTTGCATC AAGCCAGGGT AACAGCAGCT 850ACGCGATTTA TAAAAGACAG GGACAGAACA AATATGTTGC GGACTTTCAG 900ATAACAGACG GGCCTGAAAC AGACGGCACA AGCGATACAG ACGGAATTGA 950CGTTCTGGGT TTCGGGCTGG GGCCTGAATA TCCGTTCGGC CTTTTTFTCG1000CACAGGATGG AGAAAATATA GATCACGGCC AAAAAGTGAA TCAAAATTTT1050AAAATGGTGC CTTGGGAAAG AATCGCCGAT AAAATCGGCT TTCACCCGCA1100GGTCAATAAA CAGGTCGACC CGAGAAAACT GACCGACAGA AGCGGAAAAT1150AAACATGCAA AAAGCAGCTT ATACAAGCTG CTTTTTGCAT GTGAAGAACG1200S2NewSequence Sequence
MNHSKTLLLT AAAGLMLTCG AVSSQAKHKL SDPYHFTVNA AAETEPVDTA 50GDAADDPAIW LDPKNPQNDK LITTNKKSGL VVYSLEGKTL HSYHTGKLNN100VDURYDFPLN GKKVDUAAAS NRSEGKNTUE UYAUDGKNGT LQSUTDPDRP150IASAIDEVYG FSLYHSQKTG KYYAMVTGKE GEFEQYELNA DKNGYISGKK200VRAFKMNSQT EGMAADDEYG SLYIAEEDEA IWKFSAEPDG GSNGTVIDRA250DGRHLTPDIE GLTTYYAADG KGYLLASSQG NSSYAIYERQ GQNKYVADFQ300ITDGPETDGT SDTDGIDVLG FGLGPEYPFG LFVAQDGENI DHGQKVNQNF350KMVPWERIAD KIGFHPQVNK QVDPRKLTDR SGK- 383耐熱植酸酶基因全長(zhǎng)1152核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸；N端的26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后。
耐熱植酸酶基因的克隆方法，包括如下步驟(1)菌株的篩選a)取土樣少許，放入無(wú)菌水的三角瓶中，搖勻，稀釋?zhuān)坎加诨蚬w菌篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，挑選單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接基因供體菌篩選培養(yǎng)基上；b)收集各種細(xì)菌純培養(yǎng)菌種，轉(zhuǎn)接基因供體菌篩選培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上。蔣株菌以相同的方法轉(zhuǎn)接于基因供體菌篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7天，取出，比較水解圈的情況，挑選形成明顯水解圈的菌種，得到SD01N，SD01X，SD01B，SD01D。
(2)設(shè)計(jì)合成引物P1和P2根據(jù)參考資料(《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[美]F.奧斯伯等)提供的方法分別提取SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的總DNA，設(shè)計(jì)合成引物P1和P2P15’CTG CAG GAT CCATGAATC ATT CAAAAA CAC TTT TGT 3’1P25’TTTAAGCTTCGTTCTTCACATGCAAAAAGC 3’(3)克隆耐熱植酸酶基因分別以SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10分鐘。由SD01N菌株的基因組DNA擴(kuò)增出約1.2Kb的DNA片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段，經(jīng)酶切后連接于載體pMD18-T上，得到pMD18-TP，轉(zhuǎn)化E.coli Competent CellJM109，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA全序列測(cè)定分析，序列測(cè)定結(jié)果為S2，耐熱植酸酶基因全長(zhǎng)1152個(gè)核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為S2；N-端26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后。
耐熱植酸酶基因的工程菌株制備方法，它包括如下步驟(1)將耐熱植酸酶基因從pMD18-TP上切下，再連接于表達(dá)載體的pQE30上形成重組DNA即pQE30-P；(2)挑取E.Coli M15單菌落接種于LB(Km50μg/mlAp100μg/ml)培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7；250rpm，37℃，搖床培養(yǎng)3小時(shí)，冰浴10分鐘，轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中，冷凍離心，收集沉淀，用CaCl2溶液洗沉淀，并且重懸于CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，加入pQE30-P，冰浴30分鐘，42℃水浴1分30秒，冰浴2分鐘，添加新鮮LB培養(yǎng)液，37℃ 250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，培養(yǎng)物涂于LB平板培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。
(3)挑選克隆子，以PCR的方法篩選陽(yáng)性克隆子，將陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)接LB斜面培養(yǎng)基；由此，篩選出耐熱植酸酶基因工程菌株SDLiuTP01，即本發(fā)明的構(gòu)建的基因工程菌株，其微生物分類(lèi)名為大腸桿菌(E.coli)。
本發(fā)明的耐熱植酸酶基因的表達(dá)產(chǎn)物----是在25---95℃溫度范圍內(nèi)具有生物活性，最適反應(yīng)溫度為65℃的耐熱植酸酶，見(jiàn)圖5。
本發(fā)明的耐熱植酸酶，它可用于研制植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、堆肥添加劑、生物肥料、生物菌肥、有機(jī)肥料、復(fù)合肥料等肥料、飼料、食品添加劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是目前用于微生物肥料和植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑生產(chǎn)的菌株均為原核生物。由于本發(fā)明所持耐熱植酸酶基因來(lái)源于原核生物，原核生物來(lái)源的耐熱植酸酶基因與這些菌株具有遺傳學(xué)上的親緣關(guān)系，物種間的差異較小。因此，本發(fā)明所持耐熱植酸酶基因可以基因工程手段導(dǎo)入這些菌株，獲得新的植酸酶基因工程菌株，使這些具有優(yōu)良性狀的自然菌株增加耐熱植酸酶的新性狀，能使其更好地應(yīng)用于科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐。
本發(fā)明所持耐熱植酸酶基因?qū)胝婧松?，通過(guò)基因重組，可以更便利地表達(dá)耐熱植酸酶。
本發(fā)明克隆的耐熱植酸酶基因，具有獨(dú)特的核苷酸序列，其編碼的植酸酶為耐熱植酸酶，因?yàn)榫哂心蜔嵝裕谳^寬溫度范圍內(nèi)具有生物活性，實(shí)驗(yàn)證明，在25-95℃溫度范圍內(nèi)均具有生物活性，見(jiàn)圖5。其產(chǎn)品在工業(yè)化操作過(guò)程中，例如堆制、發(fā)酵、造粒、粉碎、運(yùn)輸?shù)炔僮髦?，仍能保持較高的生物活性，解決了植酸酶生產(chǎn)、制造、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中的耐高溫問(wèn)題，使其農(nóng)業(yè)和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值增加。
本發(fā)明克隆的耐熱植酸酶具有增加土壤肥力、不破壞農(nóng)作物品質(zhì)、提高磷利用率、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。可解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高食品及飼料中礦物元素和蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)有效性以及能量平衡能力，提高礦物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)有效性和蛋白質(zhì)的消化率；同時(shí)，可使一些酶如淀粉酶等恢復(fù)其原有的活性，提高了食品和飼料的能量有效性。解決了營(yíng)養(yǎng)無(wú)利用流失和必須營(yíng)養(yǎng)的“添加浪費(fèi)”這一困擾食品和飼料工業(yè)的大難題。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以按本發(fā)明之方法獲得耐熱植酸酶基因，并導(dǎo)入本發(fā)明所列之生物；也可以對(duì)本發(fā)明的酶進(jìn)行各種改造，如用各種化學(xué)修飾基因進(jìn)行修飾，如糖基化，磷酸化，N端氨基化，蛋白內(nèi)切割等，也可以為改善其表達(dá)后的轉(zhuǎn)運(yùn)而添加信號(hào)肽及在耐熱植酸酶蛋白前或后加上融合肽等，而不改變本發(fā)明酶的基本功能，如酶活性、底物特異性。這些通稱(chēng)為本發(fā)明酶的功能衍生物，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1.Bacillus sp.SD01N在篩選平板上形成的透明水解圈。
圖2.耐熱植酸酶基因擴(kuò)增電泳3基因工程菌株表達(dá)載體pQE30的物理圖譜圖4基因工程菌株SDLiuTP01的陽(yáng)性克隆電泳圖1，3 PCR陰性克隆 2，4 PCR陽(yáng)性克隆圖5基因工程菌株SD LiuTP01產(chǎn)生的耐熱植酸酶的溫度適性具體實(shí)施方式
實(shí)施例11.材料來(lái)源生物酶限制性?xún)?nèi)切酶、連接酶購(gòu)于Promega公司，Tag酶、DNA回收kit等購(gòu)于上海生物工程公司；化學(xué)試劑植酸鈣、植酸鈉購(gòu)于Sigma公司，IPTG購(gòu)于聯(lián)星生物公司；培養(yǎng)基基因供體菌篩選培養(yǎng)基D-glucose 20％，Sodium phytate 0.01％，CaCl20.2％，NH4NO30.5％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O0.001％，瓊脂20％；其它引物合成上?；瞪锛夹g(shù)公司和上海生工生物公司；DNA序列測(cè)定大連寶生物公司和聯(lián)合基因科技公司；E.coli JM109和pMD18-T，購(gòu)于大連寶生物公司。
2.產(chǎn)生耐熱植酸酶的天然菌株的篩選(1)取土樣1克，放入無(wú)菌水的三角瓶中，搖勻，稀釋?zhuān)坎加诨蚬w菌篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，挑選單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接基因供體菌篩選培養(yǎng)基上。
(2)收集各種細(xì)菌純培養(yǎng)菌種，轉(zhuǎn)接基因供體菌篩選培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上。共203株菌以相同的方法轉(zhuǎn)接于基因供體菌篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7天，取出，比較水解圈的情況。挑選形成明顯水解圈的菌種共4株。得到SD01N，SD01X，SD01B，SD01D見(jiàn)圖1。
3.合成引物根據(jù)參考資料(《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[美]F.奧斯伯等)提供的方法分別提取SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的總DNA，設(shè)計(jì)合成引物P1和P2P15’CTG CAG GAT CCA TGA ATC ATT CAA AAA CAC TTT TGT 3’1P25’TTT AAG CTT CGT TCT TCA CAT GCA AAA AGC3’4.克隆耐熱植酸酶基因分別以SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10分鐘。由SD01N菌株的基因組DNA擴(kuò)增出約1.2Kb的DNA片段，見(jiàn)圖2。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段，經(jīng)酶切后連接于載體pMD18-T上，得到pMD18-TP。轉(zhuǎn)化E.coli CompetentCell JM109，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA全序列測(cè)定分析，序列測(cè)定結(jié)果見(jiàn)S1。耐熱植酸酶基因全長(zhǎng)1152個(gè)核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸，N-端26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后，其氨基酸序列見(jiàn)S2。
實(shí)施例2耐熱植酸酶表達(dá)系統(tǒng)的建立選擇高效表達(dá)系統(tǒng)E.Coli M15作為表達(dá)耐熱植酸酶的生物反應(yīng)器。將實(shí)施例1得到的耐熱植酸酶基因從pMD18-TP上切下，再連接于表達(dá)載體的pQE30上形成重組DNA即pQE30-P，見(jiàn)圖3。
挑取E.Coli M15單菌落接種于LB(Km50μg/mlAp100μg/ml)培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7；250rpm，37℃，搖床培養(yǎng)3小時(shí)。取出馬上冰浴10分鐘，轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中，冷凍離心，收集沉淀，用冷CaCl2溶液洗沉淀，并且重懸于CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，加入pQE30-P，冰浴30分鐘，42℃水浴1分30秒，冰浴2分鐘，添加新鮮LB培養(yǎng)液，37℃ 250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，培養(yǎng)物涂于LB平板培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。
挑選克隆子，以PCR的方法篩選陽(yáng)性克隆子，電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。將陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)接LB斜面培養(yǎng)基。由此，篩選出耐熱植酸酶基因工程菌株SDLiuTP01，其微生物分類(lèi)名為大腸桿菌E.coli。
實(shí)施例3耐熱植酸酶特性將SDLiuTP01培養(yǎng)于LB(Km25ug/ml，Ap50ug/ml)培養(yǎng)液中，37℃，250rpm，過(guò)夜。IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物形成。測(cè)定耐熱植酸酶的生物活性，反應(yīng)的溫度范圍為25-95℃，在這個(gè)反應(yīng)溫度范圍內(nèi)耐熱植酸酶都具有生物活性，最適反應(yīng)溫度為65℃，見(jiàn)圖5。
實(shí)施例4作物的培養(yǎng)將表面滅菌的種子置于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4天。將無(wú)菌的玉米幼苗轉(zhuǎn)移到無(wú)菌試管中，試管底部加入無(wú)菌培養(yǎng)液(培養(yǎng)液配方Ca(No3)20.88g，NaH2PO40.006g，K2SO40.39g，MgSO40.31g，F(xiàn)eEDTA 0.0031g，微量元素溶液1ml，植酸鈉1.25mM，pH6.5)。
各試管中加入SDLiuTP01菌的粗提液20μl，以植酸酶液為對(duì)照。不加粗提液，加20μl無(wú)離子水的試管為空白對(duì)照。將上述試管培養(yǎng)15天。收獲植物體，測(cè)定植物生長(zhǎng)參數(shù)。
在含有植酸的磷脅迫培養(yǎng)液中加入20μl SDLiuTP01菌粗提液條件下，根部以上植物體重201mg，根重173mg，根長(zhǎng)238mm；在含有植酸的磷脅迫培養(yǎng)液中加入植酸酶的條件下，根部以上植物體重187mg，根重181mg，根長(zhǎng)243mm；在含有植酸的磷脅迫培養(yǎng)液中加入無(wú)離子水條件下，根部以上植物體重111mg，根重103mg，根長(zhǎng)173mm。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在含植酸的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的玉米幼苗在磷脅迫條件下，當(dāng)加入SDLiuTP01粗提液后，與未加入SDLiuTP01粗提液的對(duì)照組比較，植物的生長(zhǎng)受到促進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種耐熱植酸酶基因，其特征是耐熱植酸酶基因全長(zhǎng)1152核苷酸，該基因編碼383個(gè)氨基酸，N端的26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的丙氨酸之后，其基因的DNA序列為S1，由DNA序列推導(dǎo)出氨基酸序列為S2S1NewSequence SequenceATGAATCATT CAAAAACACT TTTGTTAACC GCGGCAGCCG GATTGATGCT 50CACATGCGGT GCGGTTTCTT CCCAGGCCAA GCATAAGCTG TCTGATCCTT100ATCACTTTAC CGTGAATGCG GCGGCGGAAA CGGAGCCGGT TGATACAGCC150GGTGATGCAG CTGATGATCC TGCGATTTGG CTGGACCCCA AGAATCCTCA200GAACAGCAAA TTGATCACAA CCAATAAAAA ATCAGGCTTA GTCGTGTACA250GCCTAGAGGG AAAGACGCTT CATTCCTATC ATACCGGGAA GCTGAACAAT300GTTGATATCC GCTATGATTT TCCGTTGAAC GGAAAAAAAG TCGATATTGC350GGCGGCATCC AATCGGTCTG AAGGAAAGAA TACCATTGAG ATTTACGCCA400TTGACGGGAA AAACGGCACA TTACAAAGCA TTACAGATCC AGACCGCCCG450ATTGCATCAG CAATTGATGA AGTATACGGT TTCAGCTTGT ACCACAGTCA500AAAAACAGGA AAATATTACG CGATGGTGAC AGGGAAAGAA GGCGAATTTG550AACAATACGA ATTAAATGCG GATAAAAATG GATACATATC CGGCAAAAAG600GTAAGGGCGT TTAAAATGAA TTCTCAGACA GAAGGGATGG CAGCAGACGA650TGAATACGGC AGTCTTTATA TCGCAGAAGA AGATGAGGCC ATCTGGAAGT700TCAGCGCTGA GCCGGACGGC GGCAGTAACG GAACGGTTAT CGATCGTGCC750GACGGCAGGC ATTTAACCCC TGATATTGAA GGACTGACGA TTTACTACGC800TGCTGACGGG AAAGGTTATC TGCTTGCATC AAGCCAGGGT AACAGCAGCT850ACGCGATTTA TGAAAGACAG GGACAGAACA AATATGTTGC GGACTTTCAG900ATAACAGACG GGCCTGAAAC AGACGGCACA AGCGATACAG ACGGAATTGA950CGTTCTGGGT TTCGGGCTGG GGCCTGAATA TCCGTTCGGC CTTTTTGTCG 1000CACAGGATGG AGAAAATATA GATCACGGCC AAAAAGTGAA TCAAAATTTT 1050AAAATGGTGC CTTGGGAAAG AATCGCCGAT AAAATCGGCT TTCACCCGCA 1100GGTCAATAAA CAGGTCGACC CGAGAAAACT GACCGACAGA AGCGGAAAAT 1150AAACATGCAA AAAGCAGCTT ATACAAGCTG CTTTTTGCAT GTGAAGAACG1200S2NewSequence SequenceMNHSKTLLLT AAAGLMLTCG AVSSQAKHKL SDPYHFTVNA AAETEPVDTA 50GDAADDPAIW LDPKNPQNDK LITTNKKSGL VVYSLEGKTL HSYHTGKLNN 100VDIRYDFPLN GKKVDIAAAS NRSEGKNTIE IYAIDGKNGT LQSITDPDRP 150IASAIDEVYG FSLYHSQKTG KYYAMVTGKE GEFEQYELNA DKNGYISGKK 200VRAFKMNSQT EGMAADDEYG SLYIAEEDEA IWKFSAEPDG GSNGTVIDRA 250DGRHLTPDIE GLTIYYAADG KGYLLASSQG NSSYAIYERQ GQNKYVADFQ 300ITDGPETDGT SDTDGIDVLG FGLGPEYPFG LFVAQDGENI DHGQKVNQNF 350KMVPWERIAD KIGFHPQVNK QVDPRKLTDR SGK- 383
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐熱植酸酶基因，其特征是所述耐熱植酸酶基因構(gòu)建的基因工程菌株為SDLiuTP01，其微生物分類(lèi)名為大腸桿菌E.coli。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的耐熱植酸酶基因，其特征在于該基因的重組表達(dá)產(chǎn)物----是在25---95℃溫度范圍內(nèi)具有生物活性，最適反應(yīng)溫度為65℃的耐熱植酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)利要求所得到的耐熱植酸酶，它用于研制植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑、堆肥添加劑、生物肥料、生物菌肥、有機(jī)肥料、復(fù)合肥料，飼料、食品添加劑。
5.一種耐熱植酸酶基因的克隆方法，其特征是它包括如下步驟(1)菌株的篩選a)取土樣少許，放入無(wú)菌水的三角瓶中，搖勻，稀釋?zhuān)坎加诨蚬w菌篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，挑選單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接基因供體菌篩選培養(yǎng)基上；b)收集各種細(xì)菌純培養(yǎng)菌種，轉(zhuǎn)接基因供體菌篩選培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上。蔣株菌以相同的方法轉(zhuǎn)接于基因供體菌篩選固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7天，取出，比較水解圈的情況，挑選形成明顯水解圈的菌種，得到SD01N，SD01X，SD01B，SD01D。(2)設(shè)計(jì)合成引物P1和P2根據(jù)參考資料(《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[美]F.奧斯伯等)提供的方法分別提取SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的總DNA，設(shè)計(jì)合成引物P1和P2P15’CTG CAG GAT CCATGAATC ATT CAAAAA CAC TTT TGT 3’1P25’TTT AAG CTT CGT TCT TCA CAT GCAAAAAGC 3’(3)克隆耐熱植酸酶基因分別以SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10分鐘，由SD01N菌株的基因組DNA擴(kuò)增出約1.2Kb的DNA片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，回收DNA片段，經(jīng)酶切后連接于載體pMD18-T上，得到pMD18-TP，轉(zhuǎn)化E.coli Competent CellJM109，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA全序列測(cè)定分析，序列測(cè)定結(jié)果為S1，耐熱植酸酶基因全長(zhǎng)1152個(gè)核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為S2；N-端26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的Ala之后。
6.一種耐熱植酸酶基因的工程菌株制備方法，其特征是它包括如下步驟(1)將耐熱植酸酶基因從pMD18-TP上切下，再連接于表達(dá)載體的pQE30上形成重組DNA即pQE30-P；(2)挑取E.Coli M15單菌落接種于LB(Km50μg/mlAp100μg/ml)培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7；250rpm，37℃，搖床培養(yǎng)3小時(shí)，冰浴10分鐘，轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中，冷凍離心，收集沉淀，用CaCl2溶液洗沉淀，并且重懸于CaCl2溶液中，冰浴30分鐘，加入pQE30-P，冰浴30分鐘，42℃水浴1分30秒，冰浴2分鐘，添加新鮮LB培養(yǎng)液，37℃ 250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，培養(yǎng)物涂于LB平板培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜；(3)挑選克隆子，以PCR的方法篩選陽(yáng)性克隆子，將陽(yáng)性克隆子轉(zhuǎn)接LB斜面培養(yǎng)基；由此，篩選出耐熱植酸酶基因工程菌株SDLiuTP01。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐熱植酸酶及其基因的克隆和表達(dá)。解決了現(xiàn)有植酸酶耐溫性較差及營(yíng)養(yǎng)無(wú)利用流失和必須營(yíng)養(yǎng)的“添加浪費(fèi)”等問(wèn)題。技術(shù)方案篩選耐熱性植酸酶天然菌株，利用分子生物學(xué)的手段，將編碼此產(chǎn)物的基因進(jìn)行基因克??；該基因全長(zhǎng)1152核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸；N端的26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，信號(hào)肽的切割位點(diǎn)在+26位的丙氨酸之后；構(gòu)建耐熱植酸酶基因的工程菌株SDLiuTP01，表達(dá)基因產(chǎn)物。本發(fā)明的耐熱植酸酶在較寬溫度范圍內(nèi)具有生物活性、能促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增加土壤肥力、不破壞農(nóng)作物品質(zhì)；降解食品和飼料中的不溶性磷、提高磷的利用、減少有機(jī)磷對(duì)環(huán)境的污染。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1552872SQ0312998
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者劉麗麗, 陳立新, 楊文博 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué), 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心