耐熱中性纖維素酶Cel6C及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了耐熱中性纖維素酶Cel6C及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從特異腐質(zhì)霉中分離得到耐熱中性纖維素酶編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.3所示，所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No.4所示；本發(fā)明進(jìn)一步提供了成熟耐熱中性纖維素酶，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明耐熱中性纖維素酶熱穩(wěn)定性優(yōu)良，在中性和堿性范圍內(nèi)具有較高酶活力，可高效降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大分子多糖、蛋白質(zhì)或脂類等物質(zhì)，能夠應(yīng)用于釀酒、紡織、能源工業(yè)等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】耐熱中性纖維素酶Cel6C及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及纖維素酶，尤其涉及從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的耐 熱中性纖維素酶Cel6C，本發(fā)明還涉及該酶的編碼基因及其應(yīng)用，屬于纖維素酶的分離及應(yīng) 用【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是由葡萄糖以β_1，4糖苷鍵連接而成的線性大分子聚合物，為目前分 布最廣的天然碳水化合物，也是自然界中最豐富的可再生資源。纖維素酶是指能水解纖 維素 β_1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。它是由內(nèi) 切型β -1，4-葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4,簡(jiǎn)稱EG、CX酶、CMC酶）、外切型β -1，4-葡聚糖酶 (EC3. 2. I. 91，EC3. 2. 1. 176,簡(jiǎn)稱 CBH、C1 酶、纖維二糖水解酶）及纖維二糖酶（EC3. 2. 1. 21， 簡(jiǎn)稱CB、β-葡萄糖苷酶）3個(gè)主要成分組成的起協(xié)同作用的復(fù)合酶系（Juturu V and mi J C 2014. Renew Sust Energ Rev 33, 188-203)。
[0003] 內(nèi)切型β -1，4-葡聚糖酶（EGs)以隨機(jī)的形式對(duì)纖維素聚合物內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)進(jìn) 行切割，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的寡糖和新鏈末端。內(nèi)切型β-1，4-葡聚糖酶是一類重要的工業(yè)酶 種，可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、洗漆等眾多領(lǐng)域（Phitsuwan P et al. 2013. Folia Microbiol 58, 163-176)。其中，高溫中性內(nèi)切葡聚糖酶具有作用條件溫和，耐高溫的特點(diǎn)， 對(duì)于應(yīng)用領(lǐng)域尤為重要，可廣泛用于生物質(zhì)能源、紡織、食品、飼料和制藥行業(yè)等眾多領(lǐng)域。 在紡織工業(yè)中，中性纖維素酶在牛仔布生物石洗加工中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在中性pH值 范圍內(nèi)，纖維素酶對(duì)織物的作用非常柔和，不會(huì)破壞織物的硬度，表面活性劑在這個(gè)PH值 范圍也是最有效的，從而節(jié)約了牛仔布加工過程中的表面活性劑成本。另外，在中性纖維素 酶的作用條件下，還可以有效防止織物返染（Chen J et al. 2007. Enzyme and Microbial Technology 40,1651-1655)。在啤酒加工業(yè)中，β-葡聚糖酶能高效地將麥芽中的β-葡 聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物大量地釋放出來(lái)，提高麥汁得率， 降低醪液粘度從而縮短糖化醪過濾時(shí)間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫均勻持 久。因此，將β-葡聚糖酶用于啤酒糖化和發(fā)酵過程，可節(jié)約用糧，降低成本，提高糖化過 濾設(shè)備的效能，有利于啤酒的質(zhì)量提高及穩(wěn)定（宮春波，謝麗源.2002.廣州食品工業(yè)科 技）。但是，啤酒糖化階段，β -葡聚糖的溶出隨著溫度的升高而增多，造成低溫過程溶出的 β -葡聚糖比例較低，高溫過程溶出的比例較高，耐高溫的內(nèi)切型β -葡聚糖酶是解決這一 問題的關(guān)鍵。
[0004] 因此，獲得新型具有中性、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性的纖維素酶的研究仍具有重大 意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分 離的耐熱中性纖維素酶Cel6C，該酶熱穩(wěn)定性優(yōu)良并在中性和堿性范圍內(nèi)具有較高酶活力。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明首先公開了從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維素 酶Cel6C的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0008] (a)、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或
[0009] (b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0010] (C)、與SEQ ID No. 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec的功能；或
[0011] (d)、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1 所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有 耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的 功能；或
[0012] (e)、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec 的功能。
[0013] 本發(fā)明還公開了所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其氨基酸序列為 (a)或（b)所示：
[0014] (a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；
[0015] (b)、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維 素酶Cel6C的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0017] (a)、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或
[0018] (b)、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或
[0019] (c)、與SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec的功能；或
[0020] (d)、與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3 所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有 耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的 功能；或
[0021] (e)、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Ceiec 的功能。
[0022] 所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0023] (a)、SEQ ID No. 4 所示的氨基酸；
[0024] (b)、將SEQ ID No. 4所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
[0025] 本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本 領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來(lái)制備耐熱中性纖維素酶Cel6C的氨基酸序列變體或 片段，其中用于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨 基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的耐熱中性纖維素酶Cel6C及 其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對(duì)于多核 苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或/和 替換。對(duì)于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不改變編碼的氨基酸序列 的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定。變體多核苷 酸還包括合成來(lái)源的多核苷酸，例如采用定點(diǎn)誘變所得到的仍編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示的氨基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如DNA改組）。
[0026] 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基因，DNA全序 列分析結(jié)果表明，含有信號(hào)肽序列的耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列全長(zhǎng)1149bp，編碼 382個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，其核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，其所編碼的氨基酸序 列為SEQ ID No. 4所示；其N端18個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，其氨基酸序列為SEQ ID No. 6所不，信號(hào)肽的編碼序列為SEQ ID No. 5所不。不含有信號(hào)肽的成熟的耐熱中性纖 維素酶Cel6C，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所 示。因此,成熟的耐熱中性纖維素酶Cel6C的理論分子量為40. OkDa。
[0027] 將耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）及推導(dǎo)出的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2所不）在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，該基因與來(lái)源于Chaetomium atrobrunneum 的 glycoside hydrolase family 6protein 氨基酸序列一致性為 83%。說(shuō) 明本發(fā)明分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C是一種新的纖維素酶。
[0028] 本發(fā)明還公開了含有所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基因的重組表達(dá)載體， 所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為pPIC_cel6C。
[0029] 將本發(fā)明的耐熱中性纖維素酶Cel6C編碼基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶 切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選 的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的耐熱中性纖維素酶編碼基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR I 和Not I限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到 重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC_cel6C。
[0030] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3所示的多核苷酸進(jìn)行 優(yōu)化以增強(qiáng)在重組宿主細(xì)胞或重組菌株中的表達(dá)效率。例如，可采用目標(biāo)宿主細(xì)胞的偏愛 密碼子進(jìn)行優(yōu)化來(lái)合成多核苷酸以增強(qiáng)在目標(biāo)宿主細(xì)胞中的表達(dá)效率。
[0031] 本發(fā)明還公開了含有所述重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞或重組菌株。
[0032] 其中，所述重組宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞；優(yōu)選的，所述重組宿主細(xì)胞為 畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞中的任意一種，最優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞； [0033] 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母 菌株中的任意一種；其中，所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
[0034] 將所述多核苷酸或多肽引入重組宿主細(xì)胞的合適方法包括：電轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體 法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法等，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。
[0035] 本發(fā)明還公開了一種制備所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的方法，包括以下步驟：
[0036] (1)用含有所述耐熱中性纖維素酶Cel6C編碼基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞，獲得重組菌株；
[0037] (2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)耐熱中性纖維素酶Cel6C表達(dá)；
[0038] (3)回收并純化所表達(dá)的耐熱中性纖維素酶Cel6C。
[0039] 本發(fā)明構(gòu)建獲得含有成熟耐熱中性纖維素酶編碼基因的重組質(zhì)粒pPIC_cel6C并 轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/cel6C。耐熱中性纖維素酶Cel6C在畢 赤酵母中得到了分泌表達(dá)，表達(dá)量為37. 5U/mL。耐熱中性纖維素酶Cel6C的比活為378U/ mg 〇
[0040] 耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果表明，耐熱中性纖維 素酶Cel6C的最適pH為6. 5,在pH5. 0?9. 0有60%以上的相對(duì)酶活性。耐熱中性纖維素 酶Cel6C在pH 5. 0-11. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在80%左 右，這說(shuō)明此酶在中性和堿性范圍內(nèi)具有較好的PH穩(wěn)定性。耐熱中性纖維素酶Cel6C的最 適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適溫度為70°C，有良好的 熱穩(wěn)定性，在60°C下溫育lh，酶活力仍保留90%以上。
[0041] 經(jīng)測(cè)定，以大麥葡聚糖為底物時(shí)耐熱中性纖維素酶Cel6C的Km值為I. 285mg/mL， 最大反應(yīng)速度Vmax為752 μ mol/min · mg。
[0042] 不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)耐熱中性纖維素酶Cel6C酶活的影響測(cè)定結(jié)果表明，大 多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為ImM或者IOmM時(shí)耐熱中性纖維素酶Cel6C的活力沒有明顯 變化。但是Mn 2+、CTAB強(qiáng)烈抑制其活力；SDS可部分抑制其活性；Cu2+、Fe3+、Pb 2+在ImM時(shí)對(duì) 耐熱中性纖維素酶Cel6C的酶活力影響不明顯，而在濃度為IOmM時(shí)可部分抑制其活力。
[0043] 本發(fā)明分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C除可作用于葡聚糖外，對(duì)于地衣多糖，羧 甲基纖維素鈉也有一定的降解作用。其對(duì)地衣多糖的降解能力相對(duì)于大麥葡聚糖的為 60. 5%，其對(duì)羧甲基纖維素鈉的降解能力相對(duì)于大麥葡聚糖的為13.6%。
[0044] 添加耐熱中性纖維素酶Cel6C對(duì)大麥麥芽汁黏度和過濾速度的影響測(cè)定結(jié)果表 明，添加100U的耐熱中性纖維素酶Cel6C酶液處理，其與對(duì)照比較，過濾速度提高19. 5%， 黏度降低7. 69%。
[0045] 本發(fā)明所述耐熱中性纖維素酶Cel6C具有良好的熱穩(wěn)定性，在中性和堿性范圍內(nèi) 依然保持較高酶活，能夠降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大分子多糖、 蛋白質(zhì)或脂類等物質(zhì)；耐熱中性纖維素酶Cel6C或其編碼基因可應(yīng)用于釀酒、紡織、能源工 業(yè)，纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的過程。
[0046] 例如在紡織工業(yè)中，本發(fā)明耐熱中性纖維素酶Cel6C可用來(lái)處理棉、麻、粘膠等纖 維素織物，切斷毛茸、使織物表而光潔、色澤鮮艷，可提高抗起球性，也可進(jìn)行柔軟整理，風(fēng) 格特殊化整理等。
[0047] 在啤酒加工業(yè)中，耐熱中性纖維素酶Cel6C能高效地將麥芽中的β-葡聚糖水解 為葡萄糖和低聚糖，摧毀細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物大量地釋放出來(lái)，提高麥汁得率，降低醪液 粘度從而縮短糖化醪過濾時(shí)間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫均勻持久。
[0048] 在飼料工業(yè)，制備低纖維飼料時(shí)，本發(fā)明耐熱中性纖維素酶Cel6C能轉(zhuǎn)化粗飼料 如麥秸、殘木、麥糠、稻草、玉米芯等，把其中一部分粗纖維素轉(zhuǎn)化為單體糖、小分子蛋白、低 脂肪等，降低飼料中粗纖維含量，把大分子降解為更易消化的小分子物質(zhì)。
[0049] 在造紙業(yè)方面，用本發(fā)明耐熱中性纖維素酶Cel6C處理熱紙漿，進(jìn)行毛邊處理，可 提商紙的品質(zhì)。
[0050] 本發(fā)明耐熱中性纖維素酶Cel6C其他很多方面的應(yīng)用還有很多，不再一一列舉。
[0051] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0052] 本發(fā)明的耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH為6. 5,在pH5. 0?9. 0有60%以上 的相對(duì)酶活性；在pH 5. 0-11. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在 80%左右，說(shuō)明此酶在中性和堿性范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性。耐熱中性纖維素酶Cel6C 的最適溫度為70°C，有良好的熱穩(wěn)定性，在60°C下溫育lh，酶活力仍保留90%以上。本發(fā) 明的耐熱中性纖維素酶Cel6C能夠降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大 分子多糖、蛋白質(zhì)或脂類等物質(zhì)，可應(yīng)用于釀酒、紡織或能源工業(yè)等。
[0053] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語(yǔ)定義
[0054] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0055] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語(yǔ)也意指寡核苷酸類似物，其 包括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除 非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡(jiǎn) 并密碼子取代）和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè) 以上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn) 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ;0htsuka 等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))。
[0056] 術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強(qiáng)度和高溫的條件。通常， 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測(cè)程度比與其它序列雜交的可檢測(cè)程度更高 (例如超過本底至少2倍）。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會(huì)不同， 較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性或洗滌條件可鑒定與探針 100%互補(bǔ)的祀序列。對(duì)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(xiàn)（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, ^Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)〇 更具體的，所述嚴(yán)謹(jǐn)條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強(qiáng)度pH下的熱熔點(diǎn)（Tm) 約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補(bǔ)的探針雜交到目標(biāo)序列時(shí)所處的溫度（在指 定離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下）（因?yàn)槟繕?biāo)序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50% 的探針被占據(jù)）。嚴(yán)謹(jǐn)條件可為以下條件：其中在PH 7. 0到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離 子濃度，通常為約〇· 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對(duì)于短探針（包括（但 不限于）10到50個(gè)核苷酸）而言為至少約30°C，而對(duì)于長(zhǎng)探針（包括（但不限于）大于50 個(gè)核苷酸）而言為至少約60°C。嚴(yán)謹(jǐn)條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì) 于選擇性或特異性雜交而言，正信號(hào)可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。 例示性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC， 1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可 進(jìn)行5、15、30、60、120分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞株"或"宿主細(xì)胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管 使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對(duì)或所屬領(lǐng)域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0058] 術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"意指存在于目的基因編碼序列的上游，提供RNA聚合酶和正確轉(zhuǎn)錄 起始所必需的其它因子的識(shí)別位點(diǎn)，啟動(dòng)或指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA。
[0059] 術(shù)語(yǔ)"可操作的連接"意指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間功能性的連接，可操作的連接的 元件可為鄰接或非鄰接的。
[0060] 術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"意指將異源性DNA序列引入到宿主細(xì)胞或有機(jī)體的方法。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"意指內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0062] 術(shù)語(yǔ)"比活力（性）"是酶純度的量度，意指單位重量的蛋白質(zhì)中所具有酶的活力 單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示；一般來(lái)說(shuō)，酶的比活力越高，酶越純。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0063] 圖1為重組畢赤酵母菌株GSl 15/cel6C發(fā)酵濕重及酶活測(cè)定；
[0064] 圖2為SDS-PAGE檢測(cè)純化的耐熱中性纖維素酶Cel6C ;其中，M為蛋白Marker ; Cel6C為耐熱中性纖維素酶Cel6C ;
[0065] 圖3為耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH ;
[0066] 圖4為耐熱中性纖維素酶Cel6C的pH穩(wěn)定性；
[0067] 圖5為耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適溫度；
[0068] 圖6為耐熱中性纖維素酶Cel6C的熱穩(wěn)定性。

【具體實(shí)施方式】
[0069] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0070] 1、試驗(yàn)材料和試劑
[0071] 1.1菌株及載體
[0072] 特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens Y1CGMCC 4573)從中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心分發(fā)，其保藏號(hào)為：CGMCC No. 4573。畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌株 GS115 購(gòu)自于 Invitrogen 公司。
[0073] 1. 2酶類及其它生化試劑
[0074] 內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司，連接酶購(gòu)自NEB公司。大麥葡聚糖購(gòu)自Sigma公司， 其它都為國(guó)產(chǎn)試劑（均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到）。
[0075] I. 3培養(yǎng)基
[0076] (I)Humicola insolens產(chǎn)孢培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基：IOOOmL 200g 土豆煮汁，IOg 葡萄糖，25g瓊脂，ρΗ5· 0。
[0077] (2)Humicola insolens纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：30g/L麥麩、30g/L玉米芯粉、5g/ L (NH4) S04、lg/L ΚΗ2Ρ04、0· 5g/L MgSO4 · 7Η20、0· Olg/L FeSO4 · 7Η20、0· 2g/L CaCl2。
[0078] (3)大腸桿菌培養(yǎng)基1^:1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%似(：1，？!17.0。
[0079] (4)畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0080] PTM 微量鹽：0· 6 % CuSO4,0· 008 % NaI2,0· 3 % MnSO4,0· 02 % Na2MoO4,0· 002 % Η3Β03,0· 05% CoC12,2% ZnCl2,6. 5% FeS04,0. 5%硫酸（v/v)。
[0081] 酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（FBSM) :0· 5% KH2PO4, 5% NH4H2PO4,1. 485% MgSO4,1. 82% K2SO4,0· 093% CaSO4,0· 15% K0H，0. 00011% Biotin，0· 44% PTM 微量鹽，2%葡萄糖。
[0082] 酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（FBM) :0· 5% KH2PO4, 5 % NH4H2PO4,1. 485% MgSO4, 1. 82% K2SO4,0· 093% CaSO4,0· 15% Κ0Η，0· 00011 % Biotin，0· 44% PTM微量鹽，0· 5% 甲醇。
[0083] Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（0· lmol/L ρΗ5· 2) :0· 2mol/L 磷酸氫二鈉 536ml，0· Imol/ L檸檬酸464ml，混勻后調(diào)pH至5. 2。
[0084] 說(shuō)明：以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書 進(jìn)行。
[0085] 實(shí)施例1特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)纖維素酶編碼基因 cel6C cDNA的克 隆
[0086] 提取特異腐質(zhì)霉在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2d時(shí)的菌體的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄 得到 cDNA 后，以此為模板，利用特異性引物 cel6CF(5'-GGGAATTCGCTCCCAGCCCCAAGAGC-3'） 和 cel6CR(5' -GCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCAGAACTTGAAGATGG-3'），經(jīng) PCR 擴(kuò)增得 到去除天然信號(hào)肽的耐熱中性纖維素酶基因 cel6C的cDNA片段，并克隆至pEASY-Blunt載 體，測(cè)序驗(yàn)證。
[0087] DNA全序列分析結(jié)果表明，含有信號(hào)肽序列的耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列 全長(zhǎng)1149bp，編碼382個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，其核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示，其 所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No. 4所示；其N端18個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，其 氨基酸序列為SEQ ID No. 6所示，信號(hào)肽的編碼序列為SEQ ID No. 5所示。不含有信號(hào)肽 的成熟的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示，其編碼的核苷酸序 列為SEQ ID No. 1所示。因此，成熟的耐熱中性纖維素酶Cel6C的理論分子量為40. OkDa。
[0088] 將耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）及推導(dǎo)出的氨基酸 序列（SEQ ID No. 2所不）在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，該基因與來(lái)源于Chaetomium atrobrunneum 的 glycoside hydrolase family 6protein 氨基酸序列一致性為 83%。說(shuō) 明耐熱中性纖維素酶Cel6C是一種新的纖維素酶。
[0089] 實(shí)施例2耐熱中性纖維素酶Cel6C的制備
[0090] 將實(shí)施例1克隆的不含有信號(hào)肽序列的耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列（SEQ ID No. 1所示）插入到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9上，使之位于α -因子信號(hào)肽下游，構(gòu)建重 組表達(dá)質(zhì)粒pPIC_cel6C。
[0091] 將表達(dá)載體PPIC9進(jìn)行雙酶切（EcoR I+Not I)，同時(shí)將連接有不含信號(hào)肽序列的 耐熱中性纖維素酶基因的cDNA序列的克隆載體雙酶切（EcoR I+Not I)，切出目的片段與表 達(dá)載體PPIC9連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC-cel6C并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15,獲得重組畢赤酵母菌 株 GS115/cel6C。
[0092] 取含有重組質(zhì)粒的GSl 15菌株，先經(jīng)FBSM培養(yǎng)基培養(yǎng)使其快速生長(zhǎng)48h后，再經(jīng) FB頂培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)108h。發(fā)酵過程中取樣測(cè)定菌體濕重及纖維素酶的活力，結(jié)果見圖1。 耐熱中性纖維素酶Cel6C的表達(dá)量為37. 5U/mL。發(fā)酵上清用0. 1 μ m濾膜過濾雜質(zhì)，然后用 賽托利斯IOkD濾膜濃縮，濃縮液直接過Akta的His-Trap柱，收集酶活峰。SDS-PAGE結(jié)果 表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C在畢赤酵母中得到了分泌表達(dá)（圖2)。
[0093] 采用DNS法進(jìn)行耐熱中性纖維素酶Cel6C的活性分析：在pH6. 0,60°C條件下， ImL的反應(yīng)體系包括100 μ L適當(dāng)?shù)南♂屆敢海▽?shí)施例2制備的耐熱中性纖維素酶Cel6C)， 900 μ L大麥葡聚糖底物（1 % )，反應(yīng)lOmin，加入I. 5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻 后540nm測(cè)定OD值。1個(gè)酶活單位（U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出1 μ mol還原 糖的酶量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C的比活為378U/mg。
[0094] 實(shí)施例3耐熱中性纖維素酶Cel6C的性質(zhì)測(cè)定
[0095] 以實(shí)施例2純化的耐熱中性纖維素酶Cel6C為研究對(duì)象，對(duì)該酶的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行 測(cè)定。
[0096] 1、耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定
[0097] 將實(shí)施例2純化的耐熱中性纖維素酶Cel6C在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定 其最適pH。底物大麥葡聚糖，在不同pH的0. 2mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中70°C下 進(jìn)行纖維素酶活力測(cè)定。結(jié)果（圖3)表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適pH為6.5,在 pH5. 0?9. 0有60%以上的相對(duì)酶活性。纖維素酶于上述各種不同pH的緩沖液中37°C處 理60min，再在pH6. 5緩沖液體系中70°C下測(cè)定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果（圖4) 表明，耐熱中性纖維素酶Cel6C在pH 5. 0-11. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min 后剩余酶活性在80%左右，這說(shuō)明此酶在中性和堿性范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性。
[0098] 2、耐熱中性纖維素酶Cel6C的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定
[0099] 纖維素酶的最適溫度的測(cè)定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH6. 5)緩沖液體系 及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為纖維素酶在不同溫度（60°C、65°C和70°C )下 處理不同時(shí)間，再在70°C下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果（圖5)表明，耐熱 中性纖維素酶Cel6C的最適溫度為70°C。酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖6)，耐熱中性纖 維素酶Cel6C有良好的熱穩(wěn)定性，在60°C下溫育lh，酶活力仍保留90%以上。
[0100] 3、耐熱中性纖維素酶Cel6C的Kni值的測(cè)定
[0101]用不同濃度的葡聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH6. 5)緩沖液體系 中，70°C下測(cè)定酶活性，計(jì)算出其Km值。
[0102] 經(jīng)測(cè)定，以大麥葡聚糖為底物時(shí)的Km值為1.285mg/mL，最大反應(yīng)速度V max為 752 μ mol/min · mg〇
[0103] 4、不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)耐熱中性纖維素酶Cel6C酶活的影響測(cè)定
[0104] 在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為ImM或者1〇禮。在70°C、pH6. 5條件下測(cè)定酶活性。
[0105] 結(jié)果表明（表I)，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為ImM或者IOmM時(shí)耐熱中性纖 維素酶Cel6C的活力沒有明顯變化。但是Mn 2+XTAB強(qiáng)烈抑制其活力；SDS可部分抑制其活 性；Cu2+、Fe3+、Pb 2+在ImM時(shí)對(duì)耐熱中性纖維素酶Cel6C的酶活力影響不明顯，而在濃度為 IOmM時(shí)可部分抑制其活力。
[0106] 表1不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)耐熱中性纖維素酶Cel6C酶活的影響

【權(quán)利要求】
1. 從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基 因，其特征在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 1的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該多核 苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示 的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱 中性纖維素酶Cel6C的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98%或 以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能；或 (e) 、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能。
2. 權(quán)利要求1所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其特征在于，其氨基酸序 列為（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
3. 從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基 因，其特征在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 3的互補(bǔ)序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件能夠進(jìn)行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多核苷酸，且該多核 苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示 的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱 中性纖維素酶Cel6C的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有98%或 以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能；或 (e) 、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C的功 能。
4. 權(quán)利要求3所述編碼基因編碼的耐熱中性纖維素酶Cel6C，其特征在于，其氨基酸序 列為（a)或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 4所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 4所示的氨基酸通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有耐熱中性纖維素酶Cel6C功能的蛋白變體。
5. 含有權(quán)利要求1或3所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
6. 按照權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體優(yōu)選為 pPIC-cel6C。
7. 含有權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞或重組菌株。
8. 按照權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞或重組菌株，其特征在于：所述重組宿主細(xì)胞 為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞中的任意一種，優(yōu)選為畢赤酵母細(xì)胞； 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株 中的任意一種；其中，所述甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
9. 一種制備權(quán)利要求2或4所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 、用權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌株； (2) 、培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)耐熱中性纖維素酶Cel6C表達(dá)； (3) 、回收并純化所表達(dá)的耐熱中性纖維素酶Cel6C。
10. 權(quán)利要求1或3所述耐熱中性纖維素酶Cel6C的編碼基因或者權(quán)利要求2或4所 述耐熱中性纖維素酶Cel6C在降解纖維素、半纖維素、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉、大分子 多糖、蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK104293812SQ201410528596
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】張偉, 徐欣欣, 李金陽(yáng), 劉波, 張宇宏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所