專利名稱：日本血吸蟲sjcxwl02基因的克隆、表達(dá)和dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲SJCXWL02基因的基因序列、日本血吸蟲SJCXWL02基因的克隆、日本血吸蟲SJCXWL02基因DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種分布廣乏，危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病?？寡x病疫苗研究是當(dāng)今血吸蟲病防治研究的熱點(diǎn)之一。
當(dāng)今血吸蟲病基礎(chǔ)免疫，特別是免疫效應(yīng)機(jī)制研究的進(jìn)展，肯定了早期童蟲是宿主免疫力攻擊的靶標(biāo)。這些新侵入的童蟲與宿主體內(nèi)的成蟲存在抗原性的差異，即存在階段特異性抗原，為此，尋找童蟲階段特異性抗原，從而找到童蟲最易受宿主免疫力攻擊的靶位是篩選血吸蟲疫苗分子的一種策略。但是侵入宿主的童蟲可通過(guò)某些逃避機(jī)制而失去這些靶位，或者使這些靶位不充分暴露給宿主的免疫系統(tǒng)，有些特異性抗原也只在早期童蟲表膜上存在很短的時(shí)間，借此與宿主的抗再感染免疫效應(yīng)平衡。比如在體外機(jī)械轉(zhuǎn)化的3小時(shí)童蟲上能檢測(cè)到一種18kD蛋白質(zhì)，而在肺期以后的童蟲及成蟲則不能檢測(cè)出這一成分。為了打破這種平衡，可采用輻射致弱尾蚴感染宿主，從而誘導(dǎo)宿主的抗再感染能力。因?yàn)檩椛涞淖饔米柚沽送x的發(fā)育，從而使童蟲的敏感靶位，即某些階段特異性抗原較長(zhǎng)時(shí)間地暴露給宿主的免疫系統(tǒng)，用這種動(dòng)物模型的血清極有可能尋找到有潛力的疫苗候選分子。
國(guó)外最近的研究結(jié)果證實(shí)，用輻射致弱尾蚴免疫的兔血清篩選曼氏血吸蟲尾蚴cDNA文庫(kù)，獲得了2個(gè)編碼20.8kD蛋白的cDNA克隆，它編碼了181個(gè)氨基酸，與Sm21.7，Sm22.6及Sj22.6的同源性為30％左右，定位與3h童蟲的表膜，用抗Sm20.8的特異性IgG在體外試驗(yàn)中能介導(dǎo)補(bǔ)體殺傷童蟲，而其裸DNA疫苗免疫小鼠可產(chǎn)生抗再感染的保護(hù)性免疫。對(duì)于日本血吸蟲輻射致弱尾蚴誘導(dǎo)宿主抗再感染能力的研究在國(guó)內(nèi)也正在展開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了日本血吸蟲SJCXWL02基因的基因序列、日本血吸蟲SJCXWL02基因DNA疫苗的構(gòu)建及小鼠免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明應(yīng)用日本血吸蟲尾蚴血清免疫篩選日本血吸蟲尾蚴文庫(kù)，經(jīng)過(guò)初篩和多輪復(fù)篩，獲得8個(gè)陽(yáng)性克隆，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)這其中4個(gè)克隆的cDNA片斷進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTn、BLASTp程序在線進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)水平同源性分析。結(jié)果顯示有一個(gè)無(wú)顯著同源性(score值＜200)，表明該基因?yàn)樾禄?，該日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列如下1ggggaatatagtttcgattttctcgtgggacgatggcaggggatgataaaMet Ala Gly Asp Asp Lys51 atgaatattgatagtatcattgccagattactggaggtccgacgcattcggMet Asn Ile Asp Ser Ile Ile Asp Arg Leu Leu Glu Val Arg Arg Ile Arg102 cccggcaaaaatgttcaactgaacgaggcagaaattcgcggattgtgtcttPro Gly Lys Asn Val Gln Leu Asn Glu Asn Glu Ile Arg Gly Leu Cys Ile153 aaatctcgcgagattttcttaagtcaacccattttactggaattagaggctLys Ser Arg Glu Ile Phe Leu Ser Gln Phe Ile Leu Leu Glu Leu Glu Ala204 cccctcaaaatttgtggtgacattcacggccaatattatgatttacttcgaPro Leu Lys Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Tyr Tyr Asp Leu Leu Arg255 ctttttgaatatggagcgtttcctcctgaagcgaattatctgtttttgggtLeu Phe Glu Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Ala Asn Tyr Leu Phe Ile Gly306 gactatgtggatcgagggaagcagtcactggaaacaatatgcttattattaAsp Tyr Val Asp Arg Gly Lys Gln Ser Leu Glu Thr Ile Cys Leu Ile Ile357 gcttataaaatcaagtatccggaaaatttctttctgcttaggggtaatcatAla Tyr Lys Ile Lys Tyr Pro Glu Asn Phe Phe Leu Leu Arg Gly Asn His408 gaatgtgcctccatcaaccgtatatatggattttatgatgaatgtaaacgtGlu Cys Ala Ser Ile Asn Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Lys Arg459 cgatataatataaaattgtggaagaccttcacagactgcttcaactgtttgArg Tyr Asn Ile Lys Leu Trp Lys Thr Phe Thr Asp Cys Phe Asn Cys Leu510 ccgattgtagcgattatagacgagaaaatattttgctgtcatggtggtctcPro Ile Val Ala Ile Ile Asp Glu Lys Ile Phe Cys Cys His Gly Gly Leu
561 tcaccagatctttcaacaatggaacaaataagacgaatcatgcgtcctacaSer Pro Asp Leu Ser Thr Met Glu Gln Ile Arg Arg Ile Met Arg Pro Thr612 gatgttcctgagcaaggtttactatgtgatttactttggtcagatccagacAsp Val Pro Glu Gln Gly Leu Leu Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Asp663 aaagatgtatctggttggggtgaaaatgatcgtggtgtcagttatacatttLys Asp Val Ser Gly Trp Gly Glu Asn Asp Arg Gly Val Ser Tyr Thr Phe714 ggtccagatattgtagctagattcttacataaacatgatctggatttaataGly Pro Asp Ile Val Ala Arg Phe Leu His Lys His Asp Leu Asp Leu Ile765 tgtcgtgctcatcaggttgttgaagacggttatgaattcttcgctaaacgtCys Arg Ala His Gln Val Val Glu Asp Gly Tyr Glu Phe Phe Ala Lys Arg816 cagttagttacactgttttccgctccaaattattgtggtgaattcgataatGln Leu Val Thr Leu Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Gly Glu Phe Asp Asn867 gcaggagctatgatgtctgtagatgacacattattatgttcatttcaaattAla Gly Ala Met Met Ser Val Asp Asp Thr Leu Leu Cys Ser Phe Gln Ile918 ttacgcccagctgaaaagaaaaagtattacgctggtgtcccaactggcagtLeu Arg Pro Ala Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Ala Gly Val Pro Thr Gly Ser979 cgaccaattactccacctcgtggagctaaagctaaggggaaattataaArg Pro Ile Thr Pro Pro Arg Gly Ala Lys Ala Lys Gly Lys Leu *1010 actatctatc tcatcgcgta tctctccaat ttatttgctt1050 ttgcttttat gacaataaaa tcgaggcgtc aagtggacga1090 acaaagttat ttgagaatat caccccctgt tcaaactgtc1130 attaaaatca tttttgcgtc ataaagtgta gatttccctt1170 acatgtgtct ttttcggaat ggcaaatgtt tttttggtcc1210 tgcacatcaa gattggataa tcagtgtgaa atcctgtttt1250 tagtgtttat acgttgttaa acagccttca tgtttccctt1290 tctatactta tttacaagcc tcatccttat cgactggctt1330 gttctctttc ctttttgcat gttttgtaag caagcataca1370 caaaagattg gttgttgatt gtgtcctatt tagtagtacc1410 atttttatta ccactggtat aattgtacat ttcttcttcg1450 tatgttttat tcttattgaa atattcaaat taaagaatga1490 gttgttttta tcagtttcgc tcaacattat tcatttgatt1530 tgatcattca gtcagtccag tgtgtaaaac acataattta1570 acagtagaaa ctgtttacat gtagtagttt ttataaatca
1610 caagcatctt tgtttcttct gtcagtattt atttgtttgt1650 gtgtatgtga ttatagtgat gatgaatgtg tgcatgctgt1690 tttttcttgt cttcgaattc gattgttcac aatgataact1730 gaagtttttc acattttctg ttttcccaat ttacttttat1770 tgtacagtca gctactttct gttataaaaa aacctatcct1810 tagtatgtta aattgagtga aatataattt cacctttcga1850 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaDNA序列分析表明SJCWL02基因全長(zhǎng)1879bp，具一個(gè)長(zhǎng)為984bp的完整ORF，起始密碼子符合Kozak序列特征，3’端含PolyA尾和加尾信號(hào)AATAAA。該基因與其他已知基因無(wú)顯著同源性，為日本血吸蟲新基因，GenBank登錄號(hào)為AY879341。編碼蛋白含327個(gè)氨基酸，理論分子量為37.346kDa，等電點(diǎn)為6.34。與磷酸酶1催化亞單位蛋白同源性最高(88％)。
將SJCWL02基因亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3/SJCWL02，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌后擴(kuò)大培養(yǎng)，制備純化的重組質(zhì)粒DNA作為DNA疫苗免疫5-6周齡的昆明系小鼠，每次每只小鼠后腿肌肉注射重組質(zhì)粒100μg。隔2周免疫1次，共3次。末次免疫后第3周以日本血吸蟲尾蚴進(jìn)行攻擊感染，攻擊后第45天處死小鼠，心臟灌注法收集成蟲，肝臟用10％NaOH消化后計(jì)算每克肝組織蟲荷數(shù)(EPG)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3/SJCWL02免疫小鼠獲得了24.6％的減蟲率和32.0％的減卵率。


圖1陽(yáng)性克隆PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果MDNA Marker，P1～P8陽(yáng)性克隆圖2重組質(zhì)粒pcDNA3/SjCXWL02雙酶切和PCR驗(yàn)證MDNA Marker，1空白質(zhì)粒PCDNA雙酶切，2目的片段PCR，3重組質(zhì)粒PCDNA/SJCXWL02雙酶切具體實(shí)施方式
一、致弱尾蚴免疫兔血清篩選日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫(kù)及SJCWL02全長(zhǎng)基因的克隆1.材料1.1文庫(kù)與菌株日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫(kù)采用定向克隆的方法將日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)尾蚴cDNA克隆入λTripEx/BM25.8系統(tǒng)的SfiIA及SfiIB之間。尾蚴文庫(kù)容量為1.8×107.(由南方醫(yī)科大學(xué)寄生蟲教研室陳曉光教授提供).
大腸桿菌BM25.8和大腸桿菌XL1-Blue均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存。
1.2重要試劑與儀器胰蛋白胨、酵母提取物均購(gòu)自O(shè)XOID公司；Taq酶、dNTP、DNAMarker、質(zhì)粒DNA提取試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品；異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)、瓊脂粉為上海生工公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶聯(lián)葡萄球A蛋白(HRP-SPA)購(gòu)自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；硝酸纖維素膜(NC膜)為臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
PCR儀系德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品；電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；英國(guó)UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔3只購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部。平均體重2.5kg，用作日本血吸蟲的感染宿主。
1.4日本血吸蟲尾蚴由湖南省血吸蟲病防治研究所提供。
1.5PCR引物(由大連寶生物公司合成)P15’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’P25’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’2.方法2.1致弱尾蚴免疫兔血清的制備常規(guī)法逸出尾蚴后，經(jīng)紫外線致弱處理400μw/min.cm2，1min，立即于每兔腹部經(jīng)皮膚免疫約2000條致弱尾蚴，45天后剖殺兔，頸動(dòng)脈取血。經(jīng)ELISA測(cè)定，血清中抗尾蚴抗原IgG滴度1∶51200。該血清按1∶50比例與大腸桿菌BM25.8裂解液混合，4℃吸附過(guò)夜，即可用于篩選尾蚴cDNA文庫(kù)。
2.2尾蚴cDNA文庫(kù)的篩選將cDNA文庫(kù)按1∶10000稀釋，每5μL稀釋文庫(kù)加入200μL新鮮大腸桿菌XL1-Blue，鋪于固體培養(yǎng)基上，37℃溫育至噬菌斑為針尖大小。覆以經(jīng)10mM IPTG浸泡過(guò)的NC膜，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，定位揭膜，5％脫脂牛奶4℃封閉過(guò)夜，PBST洗滌3次，置1∶50致弱尾蚴免疫兔血清中，37℃，2h；洗滌后置1∶150 HPR-SPA中，37℃，2h；洗滌后DAB顯色。從平板上挑取三輪篩選持續(xù)陽(yáng)性噬菌斑，置200μL1×λ稀釋液中，4℃過(guò)夜后，與200μL新鮮大腸桿菌BM25.8、400μL液體培養(yǎng)基混勻后，37℃振蕩1h。取10μL上清涂布LB/A+平板，37℃溫育8-12h，挑取單菌落，按質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒DNA。
2.3PCR擴(kuò)增與測(cè)序以陽(yáng)性克隆噬菌體為摸板進(jìn)行PCR，按以下體系進(jìn)行10×buffer 10ulMgCl2 10uldNTP 2ul引物P1 1ul引物P2 1ul
Template 1.5ulddH2O 73.5ulTaq酶 10ulPCR程序94℃5min，(94℃45s，55℃45s，72℃1min)，35個(gè)循環(huán)，72℃7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。陽(yáng)性克隆的測(cè)序由大連寶生物公司完成。
2.4序列分析與新基因的獲取、登錄對(duì)原始序列進(jìn)行編輯，去除序列中酶切位點(diǎn)序列，再通過(guò)NCBI(The National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTn、BLASTp程序在線進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)水平同源性分析。根據(jù)獲得的score值確定所獲序列是否新基因，如為新基因則利用sequin程序進(jìn)行登錄。
3結(jié)果3.1Sj尾蚴cDNA文庫(kù)的免疫篩選利用致弱尾蚴免疫兔血清進(jìn)行三輪篩選，共獲得8個(gè)持續(xù)陽(yáng)性克隆。經(jīng)PCR初步鑒定，8個(gè)陽(yáng)性克隆全部擴(kuò)增出特異條帶，插入的cDNA片段大小分布于0.6kb～3.0kp之間(見(jiàn)圖1)。
3.2測(cè)序結(jié)果隨機(jī)選取4個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示其中一個(gè)序列與其他已知基因無(wú)顯著同源性(score＜200)，命名為SJCWL02基因。
SJCWL02基因全長(zhǎng)1879bp，具一個(gè)長(zhǎng)為984bp的完整ORF，起始密碼子位于第33~35核苷酸，終止密碼子TAA位于第1014~1016核苷酸。3’端含PolyA尾和加尾信號(hào)AATAAA(位于第1064～1069核苷酸)。該基因與其他已知基因無(wú)顯著同源性，為日本血吸蟲新基因，GenBank登錄號(hào)為AY879341。編碼蛋白含327個(gè)氨基酸，理論分子量為37.346kDa，等電點(diǎn)為6.34。與磷酸酶1催化亞單位蛋白同源性最高(88％)，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示富含a-螺旋(46.48％)和無(wú)規(guī)則卷曲(43.73％)，無(wú)規(guī)則卷曲主要分布于191-228、269-281、300-327等區(qū)域。
二、日本血吸蟲真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/SJCWL02的構(gòu)建及其序列測(cè)定1.材料1.1質(zhì)粒與受體菌pcDNA3質(zhì)粒，大腸桿菌DH5α為本室貯存。
1.2工具酶與試劑限制性內(nèi)切酶KpnI、ApaI、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒均為大連寶生物公司產(chǎn)品，Marker為Sigma公司產(chǎn)品，UNIQ-10質(zhì)粒小量抽提試劑盒(030828)、PCR試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
1.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)SjHGPRT(ORF)的基因序列設(shè)計(jì)引物一對(duì)，由大連寶生物公司合成。
H35’-ACGGTACCCGGTATGATCAAGGATAG-3’，其中AC為保護(hù)性堿基，GGTACC為KpnI酶切位點(diǎn)。
H45’-CAGGGCCCATTAAACTGATTTCGGCA-3’，其中CA為保護(hù)性堿基，GGGCCC為ApaI酶切位點(diǎn)。
2.方法2.1模板制備將適量日本血吸蟲尾蚴文庫(kù)加入過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌Y1090中，37℃預(yù)吸附20min左右。在吸附液中加入氨芐青霉素、MgSO4、20％麥芽糖并混勻，然后加入到55℃保溫的頂瓊脂中，快速混勻后倒入9cm的LB平板中，42℃培養(yǎng)約4h，待出現(xiàn)密集的噬菌斑后，在LB培養(yǎng)基平板中加入SM液，4℃輕搖過(guò)夜。次日收集洗脫液，5000rpm室溫離心5min，取上清液，加入20％PEG/NaCl(20％的PEG，2mol/LNaCl)，混合后室溫放置30min，然后12,000rpm×15min離心，棄上清，加入100μl雙蒸水，溶解沉淀物，沸水浴5min，使噬菌體DNA變性。存-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.2PCR擴(kuò)增得到目的基因以文庫(kù)噬菌體DNA為模板，以H3，H4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系(100μl總反應(yīng)量)10×buffer 10μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP 2μl，引物H3和H4各2μl，模板DNA 13μl，Taq酶(5U/μl)1μl，補(bǔ)雙蒸水至100μl。PCR反應(yīng)參數(shù)為96℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸8min。1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小，并回收SjHGPRT基因的目的片段。
2.3目的基因和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3的酶切、回收和連接回收的目的片段以KpnI、ApaI雙酶切，37℃酶切2-4h，凝膠電泳回收雙酶切產(chǎn)物。按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書抽提質(zhì)粒pcDNA3，同樣以KpnI、ApaI雙酶切、回收。將酶切的目的基因與酶切質(zhì)粒按照摩爾比5∶1，反應(yīng)體系為20μl，通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，16℃連接16-18h。
2.4感受態(tài)細(xì)胞的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物20μl轉(zhuǎn)化200μl感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于氨芐青霉素抗性LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落加入到LB液體培養(yǎng)基中增菌，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。
2.5陽(yáng)性克隆的鑒定對(duì)真核表達(dá)重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnI和ApaI雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)條件同前，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
3結(jié)果3.1重組質(zhì)粒pcDNA3-SjHGPRT的構(gòu)建及其鑒定以H3、H4為引物從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出564bp的片段。將重組子經(jīng)KpnI和ApaI雙酶切后出現(xiàn)兩條帶，大小分別為0.57Kb，5.4Kb；而空白質(zhì)粒pcDNA3經(jīng)KpnI和ApaI雙酶切后，只有一條帶，大小與原質(zhì)粒一致，約為5.4Kb(見(jiàn)圖2)三、日本血吸蟲pcDNA3/SjCXWL02重組質(zhì)粒免疫小鼠的保護(hù)性效果觀察1材料1.1主要試劑酵母粉、胰蛋白胨、RnaseA為BBI公司產(chǎn)品；苯酚、氯仿、異丙醇為上海生工產(chǎn)品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和陽(yáng)性釘螺昆明系小鼠，雄性，5-6周齡，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部提供。陽(yáng)性釘螺由湖南省血吸蟲病防治研究所提供。
1.3菌株和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α、pcDNA3載體為本室保存，pcDNA3/SjHGPRT由本室構(gòu)建。
2方法2.1質(zhì)粒的大量制備采用SDS堿裂解法大量制備質(zhì)粒。然后溶于無(wú)菌的生理鹽水，經(jīng)751紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒DNA的濃度和純度(260/280≥1.80)，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整濃度至1mg/ml，置-20℃?zhèn)溆谩?br> 2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為A、B、C三組，A組為pcDNA3空質(zhì)粒對(duì)照組，B組為pcDNA3/SJCWL02免疫組，C組為注射生理鹽水組，每組各10只昆明系小鼠。
2.3DNA免疫途徑和方法按常規(guī)免疫方法進(jìn)行，分別于免疫前一天進(jìn)行預(yù)處理，即每只小鼠后腿肌肉注射50μl鹽酸布比卡因(0.5mg/ml)，第二天在該部位按分組要求注射質(zhì)粒100μg/100μl或生理鹽水100μl。每間隔2周免疫1次，共3次。
2.4免疫酶組織化學(xué)檢測(cè)SJCWL02蛋白在小鼠肌肉中的表達(dá)末次免疫后2周，每組剖殺2只小鼠，取注射部位股四頭肌0.5cm3，10％福爾馬林固定過(guò)夜，然后進(jìn)行石蠟包埋、組織切片、HE染色和免疫酶組織化學(xué)鑒定。免疫酶組化所用SIEA26-28kDa免疫血清由本室制備，工作濃度為1∶100；生物素化山羊抗兔IgG為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。具體操作方法為先制備3μm厚的切片，60℃烤片30min，常規(guī)脫蠟、去水，用新鮮配制的3％雙氧水處理切片5-10min，以滅活內(nèi)源性酶，再用蒸餾水洗3次。然后，加0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波處理2次，5min/次，PBS浸泡同前處理后，加5％BSA封閉液，置室溫20min，甩出多余液體，直接加SIEA26-28kDa免疫血清，置4℃冰箱反應(yīng)過(guò)夜。次日以PBS洗3次，5min/次，加酶標(biāo)二抗置37℃20min，PBS洗3次，5min/次，滴加試劑SABC，37℃20min，PBS洗滌后DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，37℃烘干，蓋片，顯微鏡下觀察結(jié)果。
2.5免疫小鼠攻擊感染實(shí)驗(yàn)及保護(hù)性效果評(píng)價(jià)末次免疫后第3周，按常規(guī)方法經(jīng)小鼠腹部人工感染40±1條日本血吸蟲尾蚴，感染后第45天處死小鼠，采用心臟灌注法收集血吸蟲成蟲，并計(jì)算減蟲率。同時(shí)，每鼠取1g肝研磨，加10％NaOH于37℃消化過(guò)夜，取50μl混懸液涂片鏡檢全部蟲卵數(shù)，計(jì)算每克肝蟲卵數(shù)(EPG)。運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟計(jì)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)計(jì)算其保護(hù)效果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出P＜0.05，表示有顯著性差異。減蟲率和減卵率的計(jì)算公式如下。
減蟲率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組檢獲成蟲均數(shù)/對(duì)照組檢獲成蟲均數(shù))×100減卵率(％)＝(1-實(shí)驗(yàn)組檢獲肝蟲卵均數(shù)/對(duì)照組檢獲肝蟲卵均數(shù))×1003結(jié)果3.1免疫組織化學(xué)結(jié)果對(duì)小鼠肌組織切片進(jìn)行HE染色，可見(jiàn)切片部位細(xì)胞分布正常且均勻，肌細(xì)胞核被染成藍(lán)色，胞漿被染成紅色；用正常兔血清做對(duì)照，在肌細(xì)胞肌漿內(nèi)外凡未見(jiàn)棕色反應(yīng)產(chǎn)物者，為陰性反應(yīng)；采用SIEA26-28kDa免疫兔血清做為一抗，可見(jiàn)在肌細(xì)胞胞漿中有大小不一、被染成深棕色顆粒狀物質(zhì)，為陽(yáng)性反應(yīng)。
3.2pcDNA3/SjCWL02誘導(dǎo)小鼠抗血吸蟲感染的保護(hù)作用攻擊感染后45d剖殺小鼠沖蟲，計(jì)數(shù)蟲荷及每克肝臟蟲卵數(shù)(LEPG)，由表1、表2可見(jiàn)，pcDNA3/SjCWL02免疫小鼠獲得了24.6％的減蟲率和32.0％的減卵率，與空白質(zhì)粒pcDNA3及NS對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。
表1.pcDNA3/SjCWL02免疫小鼠的減蟲率

表2 pcDNA3/SjCWL02免疫小鼠的減卵率

權(quán)利要求
1.一種編碼日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下核苷酸序列1 ggggaatatagtttcgattttctcgtgggacgatggcaggggatgataaaMet Ala Gly Asp Asp Lys51 atgaatattgatagtatcattgccagattactggaggtccgacgcattcggMet Asn Ile Asp Ser Ile Ile Asp Arg Leu Leu Glu Val Arg Arg Ile Arg102 cccggcaaaaatgttcaactgaacgaggcagaaattcgcggattgtgtcttPro Gly Lys Asn Val Gln Leu Asn Glu Asn Glu Ile Arg Gly Leu Cys Ile153 aaatctcgcgagattttcttaagtcaacccattttactggaattagaggctLys Ser Arg Glu Ile Phe Leu Ser Gln Phe Ile Leu Leu Glu Leu Glu Ala204 cccctcaaaatttgtggtgacattcacggccaatattatgatttacttcgaPro Leu Lys Ile Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Tyr Tyr Asp Leu Leu Arg255 ctttttgaatatggagcgtttcctcctgaagcgaattatctgtttttgggtLeu Phe Glu Tyr Gly Ala Phe Pro Pro Glu Ala Asn Tyr Leu Phe Ile Gly306 gactatgtggatcgagggaagcagtcactggaaacaatatgcttattattaAsp Tyr Val Asp Arg Gly Lys Gln Ser Leu Glu Thr Ile Cys Leu Ile Ile357 gcttataaaatcaagtatccggaaaatttctttctgcttaggggtaatcatAla Tyr Lys Ile Lys Tyr Pro Glu Asn Phe Phe Leu Leu Arg Gly Asn His408 gaatgtgcctccatcaaccgtatatatggattttatgatgaatgtaaacgtGlu Cys Ala Ser Ile Asn Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Lys Arg459 cgatataatataaaattgtggaagaccttcacagactgcttcaactgtttgArg Tyr Asn Ile Lys Leu Trp Lys Thr Phe Thr Asp Cys Phe Asn Cys Leu510 ccgattgtagcgattatagacgagaaaatattttgctgtcatggtggtctcPro Ile Val Ala Ile Ile Asp Glu Lys Ile Phe Cys Cys His Gly Gly Leu561 tcaccagatctttcaacaatggaacaaataagacgaatcatgcgtcctacaSer Pro Asp Leu Ser Thr Met Glu Gln Ile Arg Arg Ile Met Arg Pro Thr612 gatgttcctgagcaaggtttactatgtgatttactttggtcagatccagacAsp Val Pro Glu Gln Gly Leu Leu Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Asp663 aaagatgtatctggttggggtgaaaatgatcgtggtgtcagttatacatttLys Asp Val Ser Gly Trp Gly Glu Asn Asp Arg Gly Val Ser Tyr Thr Phe714 ggtccagatattgtagctagattcttacataaacatgatctggatttaataGly Pro Asp Ile Val Ala Arg Phe Leu His Lys His Asp Leu Asp Leu Ile765 tgtcgtgctcatcaggttgttgaagacggttatgaa ttcttcgctaaacgtCys Arg Ala His Gln Val Val Glu Asp Gly Tyr Glu Phe Phe Ala Lys Arg816 cagttagttacactgttttccgctccaaattattgtggtgaattcgataatGln Leu Val Thr Leu Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Cys Gly Glu Phe Asp Asn867 gcaggagctatgatgtctgtagatgacacattattatgttcatttcaaattAla Gly Ala Met Met Ser Val Asp Asp Thr Leu Leu Cys Ser Phe Gln Ile918 ttacgcccagctgaaaagaaaaagtattacgctggtgtcccaactggcagtLeu Arg Pro Ala Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Ala Gly Val Pro Thr Gly Ser979 cgaccaattactccacctcgtggagctaaagctaaggggaaattataaArg Pro Ile Thr Pro Pro Arg Gly Ala Lys Ala Lys Gly Lys Leu *1010 actatctatc tcatcgcgta tctctccaat ttatttgctt1050 ttgcttttat gacaataaaa tcgaggcgtc aagtggacga1090 acaaagttat ttgagaatat caccccctgt tcaaactgtc1130 attaaaatca tttttgcgtc ataaagtgta gatttccctt1170 acatgtgtct ttttcggaat ggcaaatgtt tttttggtcc1210 tgcacatcaa gattggataa tcagtgtgaa atcctgtttt1250 tagtgtttat acgttgttaa acagccttca tgtttccctt1290 tctatactta tttacaagcc tcatccttat cgactggctt1330 gttctctttc ctttttgcat gttttgtaag caagcataca1370 caaaagattg gttgttgatt gtgtcctatt tagtagtacc1410 atttttatta ccactggtat aattgtacat ttcttcttcg1450 tatgttttat tcttattgaa atattcaaat taaagaatga1490 gttgttttta tcagtttcgc tcaacattat tcatttgatt1530 tgatcattca gtcagtccag tgtgtaaaac acataattta1570 acagtagaaa ctgtttacat gtagtagttt ttataaatca1610 caagcatctt tgtttcttct gtcagtattt atttgtttgt1650 gtgtatgtga ttatagtgat gatgaatgtg tgcatgctgt1690 tttttcttgt cttcgaattc gattgttcac aatgataact1730 gaagtttttc acattttctg ttttcccaat ttacttttat1770 tgtacagtca gctactttct gttataaaaa aacctatcct1810 tagtatgtta aattgagtga aatataattt cacctttcga1850 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa。
2.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于以日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫(kù)為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到SJCXWL02基因完整的核苷酸序列。
3.一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲SJCXWL02基因的核苷酸編碼序列在真核生物中的表達(dá)方法，其特征在于所使用的宿主菌為大腸桿菌DH5a，真核表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3。
4.一種用于防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特征在于它是由日本血吸蟲SJCXWL02基因和真核表達(dá)質(zhì)粒組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種防治日本血吸蟲病的DNA疫苗，其特征在于其中的真核表達(dá)質(zhì)粒為pcDNA3。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，具體涉及日本血吸蟲(中國(guó)大陸株)SjCXWL02基因的基因序列、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/SjCXWL02的構(gòu)建及重組質(zhì)粒免疫小鼠的保護(hù)性效果觀察。采用日本血吸蟲致弱尾蚴血清篩選尾蚴cDNA文庫(kù)，獲得8個(gè)陽(yáng)性克隆后，PCR擴(kuò)增出其中4個(gè)含完整ORF的基因。同源性序列分析表明其中一個(gè)為新基因(SjCXWL02)，該基因全長(zhǎng)1879bp，開(kāi)放閱讀框含984bp，編碼328個(gè)氨基酸。將SjCXWL02亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3/SjCXWL02，制備DNA疫苗免疫昆明系小鼠，獲得24.6％的減蟲率、32.0％的減卵率。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1749395SQ200510031440
公開(kāi)日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者呂志躍, 汪世平, 周松華, 曾少華, 劉雪琴, 姜孝新, 何卓, 徐紹銳, 彭先楚, 戴橄, 車宏莉, 肖小芹, 吳仕筠, 羅臣 申請(qǐng)人:呂志躍, 汪世平