專利名稱：赤魟尾刺親環(huán)素a基因的克隆、表達(dá)及生物活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及赤魟尾刺親環(huán)素A(親環(huán)素A)基因的克隆、表達(dá)及生物活性。更具體說，本發(fā)明涉及從赤魟尾刺cDNA表達(dá)文庫總質(zhì)粒出發(fā)，利用PCR方法篩選克隆出CypA全長基因，利用基因工程的方法，在高效大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出具有生物活性的赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白，通過重組赤魟親環(huán)素A蛋白的肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性鑒定和與環(huán)胞菌素A(CsA)結(jié)合親和力等功能的研究，確證其活性，作為藥靶用來篩選能與之高親和力結(jié)合的小分子化合物和傳統(tǒng)中藥組分等，為新的抗艾滋病毒藥物和免疫抑制劑的篩選奠定基礎(chǔ)。
Cyp家族包括多種成員，其中CypA是含量最多，最主要的一種，約占細(xì)胞總蛋白的0.1％，其鏈長為165個氨基酸殘基，分子量為18kDa。CypA是于1984年由Fischer和他的研究伙伴最先發(fā)現(xiàn)的，同年，Handschumacher等人又發(fā)現(xiàn)其與免疫抑制反應(yīng)藥物CsA的結(jié)合作用，即作為CsA受體的特性。而這種免疫抑制反應(yīng)的結(jié)合作用是CsA/CypA復(fù)合物通過抑制Ca2+依賴性磷酸酶，即神經(jīng)鈣蛋白(Calcineurin，CN)來調(diào)控的。另外，親環(huán)素在許多組織中可廣泛表達(dá)，尤其在腦組織和神經(jīng)細(xì)胞中的濃度最高，它作為肽脯氨酰順反異構(gòu)酶PPIase，在神經(jīng)元蛋白成熟和折疊中起重要作用，其主要表現(xiàn)在在蛋白折疊過程中加快限速性異構(gòu)化的進(jìn)程。親環(huán)素還可以根據(jù)不同的靶細(xì)胞，表現(xiàn)為至少7種異構(gòu)體，從而體現(xiàn)多種不同的功能。在包括酵母和哺乳動物等多種細(xì)胞中，親環(huán)素可以影響一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子YY1并且同時調(diào)控其功能活性，而此時親環(huán)素A的肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性可以以離子依賴性方式被鋅離子的結(jié)合所抑制，但是CypA-Zn2+復(fù)合物亦可識別并結(jié)合DNA序列并可能涉及到轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)。親環(huán)素同樣還可以作為一種類細(xì)胞因子，這一研究表明CypA可以調(diào)節(jié)CsA的神經(jīng)毒性(neurotoxicity)，還可以在調(diào)控神經(jīng)元功能上起到很重要的作用；Hovland等人的研究還發(fā)現(xiàn)，作為一種已知的神經(jīng)毒素，CsA在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出了對CypA水平調(diào)節(jié)的作用。已有實驗采用鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤(NB)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，單一的CsA就足以在未分化的NB細(xì)胞中導(dǎo)致其形態(tài)差異而引起CypA水平的提高(通過immunostaining檢測)。
另外，另一方面的實驗亦表明，通過RO20-1724以及PEG的作用可提高cAMP的水平并導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)差異，但未發(fā)現(xiàn)可提高CypA的水平，而在不論是RO20-1724還是PEG所介導(dǎo)分化的NB細(xì)胞中CsA均起到了這種作用。由此可知，CsA在未分化或是cAMP介導(dǎo)分化的NB細(xì)胞中均起著調(diào)節(jié)其自身的結(jié)合蛋白(CypA)的水平的作用。并且，CsA通過與Cyp的結(jié)合抑制了CN磷酸酶的活性，從而調(diào)節(jié)著核轉(zhuǎn)運(yùn)以及NFAT轉(zhuǎn)錄因子的活性。故而，了解在神經(jīng)細(xì)胞中CypA水平的調(diào)節(jié)是相當(dāng)重要的。
親環(huán)素有著多種的生物學(xué)功能。其主要有(1)參與蛋白質(zhì)的折疊、裝配和運(yùn)輸肽脯氨酰順反異構(gòu)是蛋白質(zhì)折疊的限速步驟，此異構(gòu)過程可自主進(jìn)行，也可由PPIase催化進(jìn)行。Cyp是PPIase家族之一，體外實驗顯示出即使很小濃度的Cyp亦可促進(jìn)各種蛋白質(zhì)的折疊，其中CsA與Cyp結(jié)合后可抑制其PPIase的活性，從而減慢蛋白的折疊，但是就其機(jī)理而言尚不明確，可能是由于PPIase可減弱C-N的雙鍵特征，使鍵能減小易于扭轉(zhuǎn)而導(dǎo)致加速異構(gòu)所造成的；此外，Cyp還具有分子伴侶的作用，可減弱不完全折疊多肽的聚集。大量的體外實驗已經(jīng)證明了Cyp參與蛋白質(zhì)折疊的作用，與此相比，體內(nèi)實驗對于Cyp在此方面的作用還需進(jìn)一步的確證。
(2)參與免疫抑制Cyp與CsA結(jié)合的復(fù)合體與神經(jīng)鈣蛋白(Calcineurin，CN)結(jié)合，抑制CN的活性來阻斷其脫磷酸，從而抑制NFAT向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，抑制NFAT與fos和jun(NFAT核內(nèi)成分)結(jié)合，并抑制形成的Cyp-CsA-CN復(fù)合體與DNA結(jié)合。因此基因激活受到抑制，產(chǎn)生了免疫抑制。在沒有CsA的情況下，Cyp可與其天然配體結(jié)合抑制CN的活性，對集體免疫系統(tǒng)起調(diào)節(jié)的作用，而保持相對平衡。
(3)參與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是染色質(zhì)DNA片段化的表現(xiàn)，NUC18作為一種主要的核酸內(nèi)切酶催化著這一過程，研究表明，CypA與NUC18有著及其相似的氨基酸序列，抗體之間亦有交叉反應(yīng)性。由此，重組Cyp在變性與天然狀態(tài)均有這一內(nèi)切酶活性，可降解單雙鏈DNA、超螺旋DNA以及RNA，當(dāng)然這一特性與其所具有的PPIase活性無關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，Cyp的濃度及其核酸酶活性在凋亡過程中不發(fā)生變化，因此可推測這一過程中Cyp所表現(xiàn)的核酸酶活性是被激化的。但是具體的激活機(jī)制尚不明確。
(4)發(fā)揮細(xì)胞因子的功能研究者在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中發(fā)現(xiàn)了CypA，并且未發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)液中細(xì)胞未有明顯的破壞，由此可以推知，CypA是由細(xì)胞分泌的，而并不是細(xì)胞破壞釋放的。實驗證明，牛和人重組CypA對于嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的作用呈現(xiàn)被趨化的現(xiàn)象(CsA可抑制這一作用)，從而更確證了CypA作為細(xì)胞因子家族中又一成員所發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等方面的作用。
(5)在多種疾病中的作用目前研究最多的是CypA在1型人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus 1，HIV1)感染中所起的作用。研究發(fā)現(xiàn)CypA特異摻入HIV-1病毒顆粒中，且為HIV-1感染復(fù)制所必需。CypA作用于Gag蛋白，引導(dǎo)Gag蛋白的正確折疊。而Gag蛋白則引導(dǎo)病毒顆粒的組裝，在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期發(fā)揮重要的作用。Gag蛋白中一富含脯氨酸的區(qū)域可與CypA結(jié)合。除去CypA的HIV-1病毒感染能力明顯下降，由此證實了HIV-1的感染能力有賴于CypA的存在。CsA可阻斷Gag蛋白與CypA的結(jié)合，將其加入HIV-1感染的細(xì)胞培養(yǎng)液中可使HIV-1的表達(dá)和感染力下降。所以，盡管CsA具有抑制免疫反應(yīng)的作用，但在愛滋病的治療應(yīng)用尚仍存在一定的前景。
另外，研究又發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞Cyp與利什曼原蟲(L.major)的胞內(nèi)復(fù)制有關(guān)。CypA的反義寡核苷酸在利什曼原蟲感染前加入巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中可有效的抑制其胞內(nèi)復(fù)制。此外，CypA與某些自身免疫疾病有一定的關(guān)系，其中包括，CypA存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中，對炎癥的發(fā)生和發(fā)展有一定的促進(jìn)作用。鑒于CypA基因在多種疾病中的作用機(jī)制的研究，提示著對這個CypA基因的深入研究在疾病的應(yīng)用和新的免疫抑制劑的篩選方面有著誘人的前景。
序列分析表明赤魟親環(huán)素A基因與人同源物的核苷酸序列相似性高達(dá)84％；蛋白質(zhì)序列同源性亦達(dá)72％。
本發(fā)明提供一種如序列表中序列號碼1所示核苷酸序列的DNA。
本發(fā)明提供一種如序列表中序列號碼1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供一種重組載體，該重組載體包括上述一種核苷酸序列。
本發(fā)明提供一種含有上述重組載體的原核細(xì)菌。
在一種實施方式中，上述原核細(xì)菌是大腸桿菌。
在一種實施方式中，上述載體使是以硫氧環(huán)蛋白為融合伴體，中間插入6個His的親和標(biāo)記位點(diǎn)及蛋白酶3C識別位點(diǎn)的高效表達(dá)載體pTRX-cyp A。
在一種實施方式中，上述載體使所述DNA在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)，其表達(dá)量為40-60mg/L。
在一種實施方式中，上述重組載體的表達(dá)產(chǎn)物超音裂解液經(jīng)過Ni2+-Chelating親和柱層析，蛋白酶3C切割和凝膠過濾可得到純度在95％以上的性質(zhì)穩(wěn)定的成熟蛋白，得率為5-8mg/L。
本發(fā)明還提供一種用作引物的DNA片段，該DNA片段由上述核苷酸序列的一部分序列組成。
本發(fā)明還提供一種含有上述蛋白的藥物靶標(biāo)。
在一種優(yōu)選實施方式中，是將上述藥物靶標(biāo)通過所含蛋白的穩(wěn)定的肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性以及與環(huán)胞菌素A的結(jié)合親和力，用于篩選抗愛滋病毒藥物和免疫抑制劑。
本發(fā)明所選擇的魟魚屬于赤魟(Dasytis akajei)，采購自廣東省湛江水產(chǎn)品市場。赤魟尾刺cDNA文庫的構(gòu)建首先解剖分離到赤魟尾刺，提取總RNA；進(jìn)行第一鏈合成，LD PCR cDNA擴(kuò)增，酶切消化和柱回收cDNA構(gòu)建表達(dá)文庫；隨機(jī)挑取小量文庫克隆測序獲得赤魟親環(huán)素EST。然后用PCR的方法從赤魟尾刺表達(dá)文庫總質(zhì)粒中篩選克隆到親環(huán)素A全長基因，根據(jù)所獲得的親環(huán)素EST 3’端和載體核苷酸序列，設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增得到目的條帶，將目的條帶連接到T-easy載體，并轉(zhuǎn)化E.coli挑選重組克隆。
本發(fā)明通過對以上重組克隆進(jìn)行序列測定，克隆獲得赤魟親環(huán)素A全長基因，并通過基因工程方法表達(dá)出重組蛋白。新基因編碼167個氨基酸的成熟肽，等電點(diǎn)約為8.34，分子量約為18,021道爾頓，具有典型的親環(huán)素A基因一級結(jié)構(gòu)的特征。其酶活性位點(diǎn)-環(huán)孢菌素A結(jié)合位點(diǎn)高度保守，即具有構(gòu)建CsA結(jié)合位點(diǎn)的13個殘基(R55，F(xiàn)60，M61，Q63，G72，A101，N102，A103，Q111，F(xiàn)113，W121，L122和H126)中包括了結(jié)合必需的色氨酸和特征性的豐富苯丙氨酸，而其N-和C-端功能域則多變。
本發(fā)明通過一對引物的設(shè)計，將編碼赤魟親環(huán)素A的基因用PCR方法從T-easy載體上擴(kuò)增出來，克隆到中間質(zhì)粒BSK后轉(zhuǎn)移至原核融合表達(dá)載體pTRX上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(見圖3)。此表達(dá)載體(pTRX-cyp3c)以T7為啟動子，采用分子伴侶TRX為融合伴體，可幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達(dá)，TRX的C端有柔鏈區(qū)和6×His結(jié)構(gòu)，便于利用固定化金屬配體親和層析進(jìn)行純化。所設(shè)計的上游引物含有蛋白酶3C位點(diǎn)，以便外源蛋白單體的獲得。通過對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)時間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，Cyp3c融合蛋白的表達(dá)量可達(dá)到60mg/L，并且基本上處于可溶狀態(tài)。
本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了重組Cyp3c蛋白的純化條件，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到純度較高的融合蛋白，融合蛋白經(jīng)3C蛋白酶切割和進(jìn)一步的G50凝膠柱層析，可得到純度在95％以上的成熟重組赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白。
本發(fā)明獲得的重組赤魟親環(huán)素A蛋白是有生物活性的。
本發(fā)明獲得的重組赤魟親環(huán)素A蛋白具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerases，PPIase)活性。對重組赤魟親環(huán)素A蛋白進(jìn)行的活性實驗，利用糜蛋白酶偶聯(lián)法檢測重組赤魟親環(huán)素A蛋白的酶活，發(fā)現(xiàn)親環(huán)素A蛋白具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶催化活性(見FIG)。本發(fā)明利用分子生物學(xué)的方法，找到了1個赤魟親環(huán)素A新基因，并采用融合表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)出具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性的重組赤魟親環(huán)素A蛋白，作為藥靶具有極高的應(yīng)用前景及產(chǎn)業(yè)開發(fā)價值。
本發(fā)明的含有赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白成熟肽編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒pTRX-Cyp3c(構(gòu)建過程見圖3)已經(jīng)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國，武漢，珞珈山，武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號M201039，保藏日2001年10月26日。
由該表達(dá)質(zhì)粒載體經(jīng)Kpn I/Not I雙酶切，可得到540bp的片段，即為赤魟尾刺CyclophilinA成熟肽編碼序列(其中包含蛋白酶3C識別位點(diǎn))(酶切結(jié)果見圖4)本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒載體的復(fù)制方法參照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，用含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化細(xì)菌，堿法提取質(zhì)粒。
圖2赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白基因的PCR電泳結(jié)果。其中1.PCR目的條帶；2.1kb DNA標(biāo)記。
圖3含赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白基因的重組質(zhì)粒pPTRX-Cyp3c表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖。
圖4含赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白基因的BSK-Cyp3c中間質(zhì)粒和pPTRX-Cyp3c表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定圖。其中，M1Kb DNA Ladder(Gibco)；lane 1pTRX-Cyp3c載體質(zhì)粒KpnI，NotI雙酶切產(chǎn)物；lane 2pTRX-Cyp3c載體質(zhì)粒；lane 3BSK-Cyp3c載體質(zhì)粒的KpnI，BamHI雙酶切產(chǎn)物；lane 4BSK-Cyp3c載體質(zhì)粒。
圖5A和圖5B為重組赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化rCypA電泳圖。
圖5A為不同收菌時間，同一IPTG誘導(dǎo)濃度的蛋白表達(dá)，其中C未加IPTG誘導(dǎo)的總菌體；M蛋白質(zhì)低分子標(biāo)記(6條帶分子量如圖F中所示)；Lane 1，2，3，4誘導(dǎo)10小時(7+3)，IPTG誘導(dǎo)濃度依次為0.5mM、0.25mM、0.1mM、0.01mM；Lane 5，6，7，8誘導(dǎo)11小時(7+4)，IPTG誘導(dǎo)濃度依次為0.01mM、0.1mM、0.25mM、0.5Mm。、圖5B為純化rCypA的SDS-PAGE電泳圖，其中M蛋白質(zhì)低分子標(biāo)記；1.未加IPTG誘導(dǎo)的pTRX-Cyp3c BL21(DE3)菌體；2.加0.1mM IPTG誘導(dǎo)的pTRX-Cyp3c BL21(DE3)菌體；3.純化的赤魟rCyPA。
圖6為重組赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白親和層析圖譜。BB液洗脫；CC液洗脫；DD液洗脫；EE液洗脫.
圖7為重組赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白分子篩層析圖譜，其中A第1峰；B第2峰；C第3峰。
圖8為表示糜蛋白酶偶聯(lián)法測定重組赤魟CyPA的PPIase活性的示意圖。
實施例1赤魟尾刺總RNA的提取、文庫構(gòu)建和PCR克隆篩選總RNA的提取和cDNA合成解剖二條赤魟尾刺，采用異硫氰酸胍法提取觸手總RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì).獲得65μg尾刺總RNA，其A260/A280＝1.98，經(jīng)1％甲醛變性膠電泳檢測可見清晰的28s和18s兩條帶，比值＞2，以及mRNA smear(見

圖1)，表明總RNA完整性良好。進(jìn)行第一鏈合成，LD PCR cDNA擴(kuò)增，酶切消化和柱回收cDNA，構(gòu)建cDNA文庫。
引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增根據(jù)文庫少量克隆隨機(jī)測序結(jié)果所獲得的親環(huán)素(CyP)EST 3’端和載體核苷酸序列，設(shè)計引物，T7引物5’-TAA TAC GAC TCACTA TA-3’；CyPA引物5’-TTG TTC CCA AAC AAT CAC-3’。每50μl PCR反應(yīng)體積加入1μl文庫總質(zhì)粒作為模板，PCR擴(kuò)增，電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在650bp附近出現(xiàn)預(yù)期的特異性擴(kuò)增帶(見圖2)，回收此帶。實施例2重組赤魟尾刺CypA基因序列的測定和分析將回收的電泳產(chǎn)物連接至T-easy載體，轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑選重組克隆測序。一共測定了12個克隆，Blast同源分析表明，其中有7個是親環(huán)素A基因序列，這7個親環(huán)素A基因長度都是656bp，編碼1個長度為167個氨基酸的青環(huán)素蛋白，編號為Ch120。它與人同源物的核苷酸序列相似性高達(dá)84％；和已報導(dǎo)CyPA蛋白質(zhì)序列同源性亦達(dá)72％但不完全相同。在赤魟中未見報道，是1個新的親環(huán)素A蛋白。
利用工具軟件DNAtools對其堿基序列(如上圖)進(jìn)行分析，并獲得其最大讀碼框，在靠近5’端處出現(xiàn)起始密碼子ATG，并且在ATG前還發(fā)現(xiàn)了一段特征性的崗崎片段(GCAGCGCC)，以及在緊跟ATG后出現(xiàn)一個限定性堿基G，由統(tǒng)計學(xué)的角度考慮以上兩個條件，可以確認(rèn)緊跟其后出現(xiàn)的ATG為CypA全長序列的起始密碼子；序列分析還發(fā)現(xiàn)，在靠近3’端終止密碼子處發(fā)現(xiàn)一個加尾信號(AATAAA)，并且在3’端處的確出現(xiàn)了polyA序列，由此亦可以確認(rèn)此序列已經(jīng)終結(jié)。故根據(jù)以上的多方面分析可以判斷本實驗所采用的CypA基因序列為全長序列。另外通過Clustalw分析軟件可得如下比較結(jié)果Hom ------------------MVNPTVFFDIAVDGEPLGRVSFELFADKVPKTAENFRALSTGMus ------------------MVNPTVFFDITADDEPLGRVSFELFADKVPKTAENFRALSTGRat ------------------MVNPTVFFDITADGEPLGRVCFELFADKVPKTAENFRALSTGDro ------------------MSLPRVYFDIAAGGEKLGRIVMELRSDVVPKTAENFRALCTGch120 ----------------MANKKPRVFMDISIGGKPQGRITMELNADVVPKTAENFRALCTG*:: **: :** * ***********.**Hom EKGFG-------YKGSCFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPMus EKGFG-------YKGSSFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGRSIYGEKFEDENFILKHTGPRat EKGFG-------YKGSSFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFEDENFILKHTGPDro EKGYG-------YKGSPFHRVIPNFMCQGGDFTNQNGTGGRSIYGNKFPDENFELKHTGAch120 EKGFG-------YKGSTFHRIIPGFMCQGGDFTRHNGTGGKSIYGEKFKDENFQLKHTVP*** * :*** ***:** ** ******. :****.**** ** **** **** .
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Hom ITIADCGQLE--Mus ITISDCGQL---Rat ITISDCGQL---Dro VIIEDCGAL--ch120 VEITDCGELS--“*”表示相同；“:”表示差異較小；“.”表示差異明顯；空格表示完全不同。
由上分析結(jié)果可以看出，本實驗采用的赤魟CypA基因與其他物種的同種基因具有較高的同源性，具有典型的親環(huán)素A基因一級結(jié)構(gòu)的特征。其酶活性位點(diǎn)-環(huán)孢菌素A結(jié)合位點(diǎn)高度保守，即具有構(gòu)建CsA結(jié)合位點(diǎn)的13個殘基(R55，F(xiàn)60，M61，Q63，G72，A101，N102，A103，Q111，F(xiàn)113，W121，L122和H126)中包括了結(jié)合必需的色氨酸和特征性的豐富苯丙氨酸，而其N-和C-端功能域則多變。
在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，用普通的Taq酶會出現(xiàn)約10-4的錯配，由于目的片段不大，PCR的循環(huán)數(shù)不超過30個，降低了錯誤參入的概率，從實驗結(jié)果來看，這個序列在多個克隆測序中重復(fù)出現(xiàn)，可排除錯誤參入，說明本實驗PCR的結(jié)果有較高的可信度。實施例3重組赤魟尾刺親環(huán)素A蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建依據(jù)赤魟尾刺親環(huán)素A基因的兩端序列合成一對引物，在上游引物中引入KpnI酶切位點(diǎn)(GGTACC)、ATG起始密碼子、以及一個Prescission Protease切割位點(diǎn)，下游引物中引入BamH I酶切位點(diǎn)(GGATCC)及終止密碼子TTA，TCA。
上游引物(P1)5’-GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGKpn I Precision Protease siteGCCAACAAGAAGCCCA-3’下游引物(P2)5’-CGGGATCCTTATCAGGACAACTCCCCACAAT-3’BamH I以含親環(huán)素A基因的pGEM-T easy質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物PCR擴(kuò)增，得到特異擴(kuò)增的單一條帶，產(chǎn)物大小在550bp左右。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以Kpn I/BamHI雙酶切后連接到BSK載體上構(gòu)建成BSK-CyPA，再以Kpn I/Not I的酶切克隆到原核融合表達(dá)載體pPETTRX上?？寺≥d體和表達(dá)載體分別用Kpn I/BamH I和KpnI/Not I進(jìn)行雙酶切鑒定(酶切結(jié)果見圖4)。克隆載體和表達(dá)載體中的外源基因經(jīng)測序鑒定正確。所設(shè)計的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位點(diǎn)，以便切除融合伴侶TRX。實施例4 重組赤魟尾刺親環(huán)素A融合蛋白的表達(dá)將pTRX-親環(huán)素A轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡航?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌體經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與用軟件PROTEIN ANALYSIS預(yù)測的理論值32.4kD相符。
經(jīng)過對培養(yǎng)時間，誘導(dǎo)濃度，溫度等條件的摸索(見圖5)菌體擴(kuò)大培養(yǎng)不同時間后誘導(dǎo)表達(dá)比較)，基因工程菌的培養(yǎng)條件為接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)至OD600＝0.6(擴(kuò)大培養(yǎng)約2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1mM和0.2％，25℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)10h后離心收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析分析表明，在此條件下赤魟尾刺Trx-親環(huán)素A融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20％以上，基本上處于可溶狀態(tài)(見圖5)。實施例5 重組赤魟尾刺親環(huán)素A融合蛋白的純化及成熟蛋白的獲得將收獲的總菌體用TE(pH8.0)洗滌，再用Tis(50mM，pH7.0)懸浮，超聲處理后，裂解上清液經(jīng)Ni2+Chelaing Sepharose親和色譜層析一步純化，經(jīng)SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明融合蛋白的純度達(dá)到約80％(圖5B、6、7)。以1L基因工程菌培養(yǎng)物為材料，最終獲得約60mg純化的融合蛋白。
為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡化實驗步驟，縮短對重組蛋白的處理時間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時，采用一步法進(jìn)行了純化。根據(jù)載體質(zhì)粒pETTRX所表達(dá)的外源蛋白與Ni2+親和柱的結(jié)合能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，我們選用了較簡化的洗脫條件50mMPB，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(C液)；300mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(D液)；500mM咪唑，50mMPB，500mMNaCl，pH6.0(E液)。重組CyPA蛋白在D液和E液被洗脫下來(圖6)。從SDS-PAGE結(jié)果來判斷分離效果最好的部分。
利用Folin-酚法測定重組CyPA的蛋白濃度，收獲濃度在0.7mg/ml以上的洗脫液，加入Precision Protease進(jìn)行切割，用SDS-PAGE檢測酶切結(jié)果，可明顯看到18kD附近代表成熟rCyPA的譜帶(見圖5B)。將反應(yīng)液用Ni2+ChelatingSepharose親和色譜層析柱純化(條件同前)，收獲含成熟rCyPA的穿流液，并用Sephadex G-50進(jìn)一步純化(洗脫液為PBS)，便得純度在95％以上的成熟重組赤魟尾刺親環(huán)素A(見圖7)。實施例6 重組赤魟CyPA蛋白PPIase活性的測定重組CyPA的生物活性參照Fischer等人建立的糜蛋白酶偶聯(lián)法，略加改進(jìn)。反應(yīng)體積2ml，含35mmol/L Hepes(PH8.0)、100μmol/L N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(溶于66％DMSO水溶液中)、10μmol/L糜蛋白酶、rCyPA的濃度為25nmol/L。除糜蛋白酶外的所有成分混合后預(yù)置在15℃，糜蛋白酶加入后迅速混勻，UV-260分光光度計連續(xù)測定A390值，直到反應(yīng)終止，繪制曲線圖。其結(jié)果見圖8。
序列表1.一般信息(i) 申請人北京博奧環(huán)宇生物技術(shù)有限公司(ii) 發(fā)明名稱赤魟尾刺親環(huán)素A基因的克隆、表達(dá)及生物活性(iii)序列數(shù)目2序列號1序列長度656bp序列類型堿基對鏈數(shù)雙鏈拓 撲 學(xué)直鏈狀序列種類DNA起源生物赤魟(Dasytis akajei)株名大腸菌BL21(DE3)序列特征表示特征的記號有正確的讀碼框決定位置起始、終止密碼子決定特征的方法實驗存在位置起始密碼子存在于第83-85位，終止密碼子576-578位GNGACTGCAT TGNCANNGNC TGACCAAGTC AGTATACGGC CTACCGCTCG CATTTCTCTC 60CGGCCTCAGA AGCT ATG CC AAC AAG AAG CCC AGG GTC TTT ATG GAC ATC 118Met Ala Asn Lys Lys Pro Arg Val Phe Met Asp IleTCC ATT GGG GGT AAA CCC CAG GGT CGC ATA ACG ATG GAG CTA AAC GCA GAT 169Ser Ile Gly Gly Lys Pro Gln Gly Arg Ile Thr Met Glu Leu Asn Ala AspGTT GTC CCA AAG ACT GCA GAA AAC TTC CGT GCA CTA TGC ACA GGC GAG AAG 220Val Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Cys Thr Gly Glu LysGGT TTC GGT TAC AAA GGC TCA ACG TTC CAC AGA ATC ATT CCT GGA TTC ATG 221Gly Phe Gly Tyr Lys Gly Ser Thr Phe His Arg Ile Ile Pro Gly Phe MetTGC CAG GGT GGT GAC TTC ACA AGG CAT AAC GGC ACT GGA GGC AAG TCC ATC 322Cys Gln Gly Gly Asp Phe Thr Asp His Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser IleTAT GGG GAG AAG TTT AAA GAT GAG AAT TTT CAG CTG AAG CAC ACA GTG CCA 373Tyr Gly Glu Lys Phe Lys Asp Glu Asn Phe Gln Leu Lys His Thr Val ProGGC ATC CTG TCC ATG GCC AAT GCT GGA CCA AAT ACA AAT GGT TCC CAG TTC 424Gly Ile Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln PheTTC ATA TGC ACC ACA ATA ACT AGT TGG TTG GAT GGG AAG CAT GTT GTG TTT 475Phe Ile Cys Thr Thr Ile Thr Ser Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val PheGGA TCA GTG GTA GAA GGC ATG GAT GTG GTA ACG AAG ATG GAG AAG TGT GGC 526Gly Ser Val Val Glu Gly Met Asp Val Val Thr Lys Met Glu Lys Cys GlyGAC AAG TCT GGA AAA CCC AGT GCC ACG GTT GAG ATC ACT GAT TGT GGG GAG 577Asp Lys Ser Gly Lys Phe Ser Ala Thr Val Glu Ile Thr Asp Cys Gly GluTTG TCCTGAATTATTT GAATTTGCAA TTTTATGATT TA AGTGTGAT TGTTTGGGAA 639Leu Ser*CAACAAAAAAAAAAAAA
權(quán)利要求
1.一種如序列表中序列號碼1所示核苷酸序列的DNA。
2.一種如序列表中序列號碼1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
3.一種重組載體，該重組載體包括如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種含有如權(quán)利要求3所述的重組載體的原核細(xì)菌。
5.如權(quán)利要求4所述的原核細(xì)菌，其特征在于所述的原核細(xì)菌是大腸桿菌。
6.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述載體是以硫氧環(huán)蛋白為融合伴體，中間插入6個His的親和標(biāo)記位點(diǎn)及蛋白酶3C識別位點(diǎn)的高效表達(dá)載體pTRX-cyp A。
7.如權(quán)利要求3所述載體，其特征在于該載體使所述DNA在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式表達(dá)，其表達(dá)量為40-60mg/L。
8.如權(quán)利要求3所述重組載體，其特征在于由該重組載體的表達(dá)產(chǎn)物超音裂解液經(jīng)過Ni2+-Chelating親和柱層析，蛋白酶3C切割和凝膠過濾可得到純度在95％以上的性質(zhì)穩(wěn)定的成熟蛋白，得率為8-10mg/L。
9.一種用作引物的DNA片段，其由權(quán)利要求1所述核苷酸序列的一部分序列組成。
10.一種含有如權(quán)利要求2所述蛋白的藥物靶標(biāo)。
11.如權(quán)利要求10所述藥物靶標(biāo)，通過所述蛋白的穩(wěn)定的肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性以及與環(huán)胞菌素A的結(jié)合親和力，用于篩選抗愛滋病毒藥物和免疫抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明通過構(gòu)建赤魟(Dasytis akajei)尾刺cDNA文庫和DNA測序，并根據(jù)所獲得的親環(huán)素(CyP)EST 3’端和載體核苷酸序列，設(shè)計引物，用PCR的方法，首次從赤魟尾刺cDNA文庫中篩選克隆到親環(huán)素A全長基因。新基因長度為656bp，編碼167個氨基酸的成熟肽，所表達(dá)的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為8.34，分子量約為18,021道爾頓。將赤魟尾刺親環(huán)素A基因克隆于硫氧還蛋白基因融合表達(dá)載體pTRX的trxA基因3’末端，構(gòu)建符合讀碼框的融合基因，該融合蛋白在大腸桿菌中以胞內(nèi)可溶的形式存在，表達(dá)量可達(dá)60mg/l。通過Ni－Chelating親和色譜層析，蛋白酶3C切割和凝膠過濾，得到純度在95％以上成熟的重組赤魟親環(huán)素A蛋白，得率為10mg/l。該蛋白具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性。
文檔編號C12P19/34GK1428348SQ01136940
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月25日
發(fā)明者徐安龍, 涂洪斌, 熊茜 申請人:北京博奧環(huán)宇生物技術(shù)有限公司