專利名稱：蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和蛋白質(zhì)的輸送的制作方法
近年已發(fā)展了使用治療性蛋白質(zhì)治療疾病的方法，它包括體外生產(chǎn)供常規(guī)藥物輸送(例如靜脈注射、皮下注射或肌內(nèi)注射)的治療用蛋白質(zhì)，并且最近建立了基因治療方法。
具治療活性的蛋白質(zhì)，一般是通過將編碼治療活性蛋白質(zhì)的外源DNA導入適當細胞中而制備的。例如，將編碼所需的治療用蛋白質(zhì)的外源DNA，在質(zhì)粒之類的載體中導入像永久化細胞這樣的細胞中，在其中被編碼蛋白質(zhì)得以表達。并且，已有人提出，外源細胞基因及其表達可以由基因擊靶加以修飾，例如參見美國專利No.527071、WO91/06666、WO91/06667及WO90/11354。
目前可采納的基因治療方法是利用感染性載體，例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體，它包括欲表達的遺傳物質(zhì)。該方法有局限性，例如在載體生產(chǎn)期間可能產(chǎn)生具復制能力的病毒治療性病毒和內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄病毒基因組之間的重組，有可能產(chǎn)生具有新的細胞特異性、宿主范圍或增加了毒性及細胞毒性的感染因子；獨立整合到大量細胞中，增加了致瘤插入活動的危險；反轉(zhuǎn)錄病毒中有限的克隆能力(它限制了治療適用性)以及有用產(chǎn)物的短壽命體內(nèi)表達。一種較好的提供基因產(chǎn)物的方法，特別是一種能避免目前所用方法相關(guān)聯(lián)的局限性和危險性的方法是有價值的。
本發(fā)明涉及治療用蛋白質(zhì)的體外生產(chǎn)及通過基因治療產(chǎn)生和傳送治療用蛋白質(zhì)的改進方法。在本方法中，所需的靶基因在細胞(即一種所需的內(nèi)源細胞基因)中的表達，通過將至少包括調(diào)節(jié)序列、外顯子及拼接供體位點的DNA，在予先選定的位點經(jīng)同源重組導入細胞基因組中而加以改變。這些成分以這樣一種方式導入染色體(基團組)DNA中，即要使之導致產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄單位(其中存在于DNA構(gòu)建體中的調(diào)節(jié)序列、外顯子及拼接供體位點被可操作地連接到內(nèi)源基因上)。由于這些成分引入染色體DNA中，其結(jié)果是改變了所需內(nèi)源基因的表達。
正如本文中所用的，改變的基因表達包括激活(或者使之能表達)獲得時在細胞中通常處于靜止(不表達)狀態(tài)的基因，提高獲得時在細胞中不能以生理學上有意義的水平表達的基因的表達水平，改變調(diào)節(jié)或誘導特性，以使它與獲得時在細胞中出現(xiàn)的不同，并且降低(包括消除)原獲得時在細胞中表達的基因表達水平。
本發(fā)明還涉及適用于改變靶基因表達的方法中的DNA構(gòu)建體。該DNA構(gòu)建體包含(a)擊靶序列；(b)調(diào)節(jié)序列；(c)外顯子；和(d)未配對的拼接供體位點。DNA構(gòu)建體中該擊靶序列指導元件(a)～(d)整合進細胞內(nèi)的靶基因中，以使元件(b)～(d)以可操作方式連接到內(nèi)源靶基因序列上。在另一個實施方案中，該DNA構(gòu)建體包含(a)擊靶序列，(b)調(diào)節(jié)序列，(c)外顯子，(d)拼接供體位點，(e)內(nèi)含子，以及(f)拼接受體位點，其中擊靶序列指導元件(a)～(f)的整合，以使元件(b)～(f)以可操作方式連接到內(nèi)源基因上。擊靶序列是與細胞染色體DNA(借助它而發(fā)生同源重組)中的予選擇位點同源的。在該構(gòu)建體中，外顯子一般是調(diào)節(jié)序列的3′，而拼接供體位點是內(nèi)顯子的3′。
下述內(nèi)容用于描述本發(fā)明的兩個實施方案，其中將人促紅細胞生成素(hEPO)基因的序列上游改變，以使hEPO能在初級、次級或永久化細胞中得以表達，而這些細胞在剛獲得，處于未被轉(zhuǎn)染狀態(tài)時不能以可檢測出的量表達EPO。在第一個實施方案中，擊靶構(gòu)建體含有兩個擊靶序列。第一個擊靶序列同源于第二擊靶序列的5′序列，而兩序列是hEPO編碼區(qū)域的上游。擊靶構(gòu)建體也含調(diào)節(jié)區(qū)域(mMT-1啟動子)、外顯子(人生長激素(hGH)外顯子1)以及未配對的拼接供體位點。具有該擊靶構(gòu)建體的同源重組產(chǎn)物示于

圖1中。
實施方案2中，擊靶構(gòu)建體也含有兩個擊靶序列。第一擊靶序列與內(nèi)源hEPO調(diào)節(jié)區(qū)域中的序列同源，而第二擊靶序列與hEPO內(nèi)顯子1同源。擊靶構(gòu)建體也包含調(diào)節(jié)區(qū)域(mMT-1啟動子)、外顯子(hGH外顯子1)和未配對的拼接供體位點。具有該擊靶構(gòu)建體的同源重組產(chǎn)物示于圖2。
兩實施方案中，擊靶過程的產(chǎn)物是嵌合轉(zhuǎn)錄單位，該嵌合轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生一種hGH基因的第一外顯子定位于hEPO外顯子2～5上游的成熟mRNA、轉(zhuǎn)錄、拼接和轉(zhuǎn)譯的產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)，其中hEPO信號肽的氨基酸1～4被hGH的氨基酸殘基1～3取代。這兩個實施方案，在有關(guān)被插入的擊靶構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序列的相對位置，和為產(chǎn)生最后的被加工的轉(zhuǎn)錄本所需出現(xiàn)的拼接特異性方式方面是不同的。
本發(fā)明還涉及借助同源重組，將上述構(gòu)建體導入宿主細胞染色體DNA中而產(chǎn)生同源重組體細胞以于體外或體內(nèi)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。然后將該同源重組體細胞維持在能使其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和分泌的條件下，從而產(chǎn)生有用蛋白質(zhì)。
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)，特別是治療性蛋白質(zhì)的被轉(zhuǎn)染細胞，例如被轉(zhuǎn)染的初級或次級細胞(即非永久化細胞)和被轉(zhuǎn)染的永久化細胞、制得這類細胞的方法、使用這類細胞于體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法以及基因治療的方法。本發(fā)明的細胞來源于脊椎動物，特別是哺乳動物，更具體地的是來源于人。由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細胞含有編碼治療產(chǎn)物的DNA、本身是治療產(chǎn)物的DNA、和/或能引起被轉(zhuǎn)染細胞高水平表達基因、或具有不同于相應未被轉(zhuǎn)染細胞所出現(xiàn)的調(diào)節(jié)或誘導方式的DNA。
本發(fā)明還涉及借以使細胞，例如初級、次級和永久化細胞被轉(zhuǎn)染以包含外源遺傳物質(zhì)的方法、產(chǎn)生克隆細胞株或異源細胞株的方法、以及使用被轉(zhuǎn)染的初級、次級或永久化細胞免疫動物，或在被免疫動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的方法。
本發(fā)明特別涉及在真核細胞中，例如真菌、植物或動物例如脊椎動物，特別是哺動物，更具體的是人來源的細胞中基因擊靶或同源重組的方法。即涉及到通過同源重組，將DNA導入脊椎動物源的初級、次級或永久化細胞中的方法，這樣該DNA被導入初級、次級或永久化細胞基因組DNA的予選擇位點。所用的擊靶序列可參照擊靶DNA構(gòu)建體中DNA準備插入的位點來選擇。本發(fā)明還涉及到按本發(fā)明的方法生產(chǎn)的同源重組體初級、次級或永久化細胞，稱之為同源重組體(HR)初級、次級或永久化細胞，以及HR初級、次級或永久化細胞的使用。
本發(fā)明的一個實施方案中，基因的表達被改變，基因被激活。即存在于脊椎動物源的初、次級或永久化細胞中的，獲得時通常于原細胞中不被表達的基因被激活，結(jié)果編碼蛋白質(zhì)得以表達。該實施方案中，使用同源重組以取代、減損或破壞調(diào)節(jié)區(qū)域，該區(qū)域通常與通過插入能引起基因以高于相應未被轉(zhuǎn)染細胞的水平表達的調(diào)節(jié)序列而獲得的細胞基因有關(guān)。
在一個實施方案中，被激活的基因可進一步通過包括一個可擴增性可選擇性標志基因的方法來加以擴增，該標志基因是有這樣的性質(zhì)，即含可選擇標志基因的已擴增拷貝的細胞，可通過在適當?shù)目蛇x擇因子存在下來培養(yǎng)細胞而被選擇。已激活的內(nèi)源基因以與可擴增性可選擇標志基因以串聯(lián)的方式被擴增。含被激活內(nèi)源基因的許多拷貝的細胞可用于體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)和基因治療。
正如本發(fā)明所述，基因擊靶和擴增作用對激活形成轉(zhuǎn)錄單位的基因的表達是特別有用的，所說的轉(zhuǎn)錄單位足夠大以致使其難以分離和表達，或者對于激活整個蛋白質(zhì)編碼區(qū)域不可利用或尚未被克隆的基因是特別有用的。
在另一個實施方案中，基因的表達比剛獲得時在細胞中的表達得到提高，或者顯示出不同于相應未被轉(zhuǎn)染細胞情況下出現(xiàn)的調(diào)節(jié)或誘導特征。在又一實施方案中，基因的表達比剛獲得時在細胞中的表達水平低(即減少或消除)。為轉(zhuǎn)移到酵母或細菌中用于體外蛋白生產(chǎn)，本發(fā)明還描述了利用同源重組將基因轉(zhuǎn)變成沒有內(nèi)顯子的cDNA拷貝的方法。
本發(fā)明的被轉(zhuǎn)染細胞在人和動物中有很多用途。在一個實施方案中，該細胞可植入人體或動物體內(nèi)，借以在人體或動物體內(nèi)輸送蛋白質(zhì)。例如，為治療目的，可將hGH、hEPO，人促胰島素及其它蛋白質(zhì)全身或局部地輸送到人體內(nèi)。此外，也可生產(chǎn)產(chǎn)生生長激素、促細胞生成素、促胰島素及其它非人來源蛋白質(zhì)的被轉(zhuǎn)染的非人細胞。
含表達治療產(chǎn)物的被轉(zhuǎn)染細胞的屏障裝置(借助該裝置治療產(chǎn)物可自由滲透)可被用來于體內(nèi)固定位置限制細胞，或保保護和從宿主免疫系統(tǒng)中分離細胞。屏障裝置是很有用的，它能使被轉(zhuǎn)染的永久化細胞、被轉(zhuǎn)染的異種細胞或被轉(zhuǎn)染的同種異體細胞被植入，以治療人或動物的病癥或應用于農(nóng)業(yè)(例如產(chǎn)生長激素用于牛奶生產(chǎn))。當因為某些原因使治療方法受到阻止時，屏障裝置由于能提供容易接近要除去的細胞而可以進行方便的短期(即暫時的)治療。另外，被轉(zhuǎn)染異種和同種異體細胞，可在沒有屏障裝置的情況下被用于短期基因治療，這樣由細胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物將在體內(nèi)被輸送，直至細胞被宿主的免疫體系排斥為止。
本發(fā)明的被轉(zhuǎn)染細胞也可用于激發(fā)抗體產(chǎn)生，或免疫人和動物以對抗致病因子。植入的被轉(zhuǎn)染細胞可用于輸送能刺激宿主細胞和體液免疫反應的免疫抗原。這些免疫反應可設計來保護宿主以免受未來的感染因子感染(即免疫接件)，以激發(fā)和提高針對不斷發(fā)展的感染的抗病能力，或產(chǎn)生針對由可用于治療和診斷目的的被轉(zhuǎn)染細胞在體內(nèi)產(chǎn)生的抗原的抗體。含該細胞的可除去的屏障裝置可用作終止經(jīng)受抗原的簡單工具。此外，最終將被排斥的細胞(異種或同種異體被轉(zhuǎn)染細胞)也可用于限制經(jīng)受抗原，因為當細胞被排斥時，抗原的產(chǎn)生將停止。
本發(fā)明的方法可用來生產(chǎn)能產(chǎn)生廣泛的各種各樣治療有用的產(chǎn)物的初級、次級或永久化細胞包括(但不只限于)激素、細胞激動素、抗原、抗體、酶、凝血因子、運輸?shù)鞍踪|(zhì)、受體、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、核糖酶(ribozymes)或反義RNA。此外，本發(fā)明的方法也可采用來生產(chǎn)能產(chǎn)生非天然出現(xiàn)的核糖酶(ribozy-mes)、蛋白質(zhì)或核酸(它們被用于體外產(chǎn)生治療產(chǎn)物或用于基因治療)的細胞。
附圖簡要說明圖1是表示轉(zhuǎn)錄激活hEPO基因方法的示意圖；粗線小鼠金屬硫因I啟動子；豎條線方框hGH的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)；實心方框hGH外顯子1；橫條線方框hEPO內(nèi)含子1的10bP拼接供體序列；交叉影線方框hEPO的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)；空心編號方框hEPO編碼序列；劃斜線方框hEPO 3′未轉(zhuǎn)譯序列；HIIIHindIII位點。
圖2是表明轉(zhuǎn)錄激活hEPO基因方法的示意圖；粗線小鼠金屬硫因I啟動子；豎條線方框hGH的5′未轉(zhuǎn)譯區(qū)；實心方框hGH外顯子I；空心編號方框hEPO編碼序列；劃斜條紋方框hEPO 3′未轉(zhuǎn)譯序列；HIIIHindIII位點。
圖3表示質(zhì)粒pXGH5的示意圖，該質(zhì)粒包含處于小鼠金屬硫因啟動子控制下的hGH基因。
圖4表示質(zhì)粒pE3neoEPO的示意圖。其中指出了人促紅細胞生成素基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)及氨芐青霉素(amp)抗性基因的位置。箭頭指示各基因的轉(zhuǎn)錄方向。pmMT1代表小鼠金屬硫因啟動子(驅(qū)動hEPO表達)，pTK代表單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子(驅(qū)動neo表達)?；驁D中點區(qū)域表示來自人次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)所在地的序列的位置。其中標出了限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的相對位置。
圖5表示質(zhì)粒pcDNEO的示意圖，該質(zhì)粒包含插入到質(zhì)粒pcD的BamHI位點中的來自質(zhì)粒pSV2neo的neo編碼區(qū)(BamHI-BglII片段)、來自pBR 322的Amp-R和pBR 322 Ori序列，以及polyA、16S拼接接合區(qū)和來自SV40的早期啟動子區(qū)域。
圖6表示質(zhì)粒pREPO4示意圖。
圖7圖示在0.02、0.05、0.1、0.2和0.4μM氨甲喋呤中經(jīng)受逐步選擇的中靶人細胞系內(nèi)的促紅細胞生成素表達。
圖8表示質(zhì)粒pREPO15的示意圖。填充框表示來自基因組hEPO序列的片段。BamHI(3537)和BglII′/HindIII′間的區(qū)域相當于Genba-nK記入HUMERPALU中1～4008位上的序列。BglII′/HindIII′(11463)間的區(qū)域相當于Genbank記入HUMERPALU中4009～5169位上的DNA序列。HindIII(11463)與XhoI(624)間的區(qū)域含有相當于Genbank記入HUMEPA的7～624位的序列?？招目虮硎綜MV啟動子序列，其中含有來自Genbank序列HS5MIEP中核苷酸546～2105的序列。帶箭頭的空心框表示neo基因。劃影線框表示驅(qū)動neo基因表達的胸苷激姆(tk)啟動子。細線表示包括amp基因的pBSIISK+序列。
圖9A列出限制性內(nèi)切酶圖，并圖示消化內(nèi)源性hEPO基因后觀察到的產(chǎn)物(上方)，以及與pREO15的擊靶片段同源重組后激活的hEPO基因(下方)。
圖9B列出對未處理(HF)和中靶(T1)人成纖維細胞克隆HF342～15進行限制性內(nèi)切酶消化和Southern雜交分析的結(jié)果(參見實施例7) 。
圖10表示質(zhì)粒pREPO18的示意圖。填充框代表得自基因組hEPO序列的片段。BamHI(3537)和ClaI(7554)間的區(qū)域相當于Genbank記入HUMERPALU中1～4008位上的序列。ATG(12246)和HindIII(13426)間的區(qū)域相當于Genbank記入HUMERPLAU中4009～5169位上的DNA序列。HindIII(13426)和XhoI(624)之間的區(qū)域含有相當于Genbank記入HUMERPA中7～624位的序列。CMV啟動子序列以空心框表示，并且含有來自Genbank序列HS5MIEP中核苷酸546～2015的序列。二氫葉酸還原酶(dhfr)轉(zhuǎn)錄單位以帶箭頭的點框表示。neo基因以帶箭頭的空心框表示。驅(qū)動neo基因的tk啟動子以劃影線框表示。細線代表含amp基因的pBSIISK+序列。
圖11圖示本發(fā)明的用于激活和擴增無內(nèi)含子基因，α干擾素基因的構(gòu)建體，其中該構(gòu)建體包含第一擊靶序列(1)、可擴增標志基因(AM)、可選擇標志基因(SM)、調(diào)節(jié)序列、CAP位點、拼接供體位點(SD)、內(nèi)含子(細線)、拼接受體位點(SA)和第二擊靶序列(2)。黑框代表編碼DNA，且點框代表未轉(zhuǎn)譯序列。
圖12圖示本發(fā)明用于激活和擴增內(nèi)源性基因的構(gòu)建體，其中第一外顯子促使信號肽、人GM-CSF基因，所述構(gòu)建體包含第一擊靶序列(1)、可擴增標志基因(AM)、可選擇標志基因(SM)、調(diào)節(jié)序列、CAP位點、拼接供體位點(SD)和第二擊靶序列(2)。黑方框代表編碼DNA而點方框代表未轉(zhuǎn)譯序列。
圖13圖示本發(fā)明用于激活和擴增內(nèi)源性基因的構(gòu)建體，其中第一外顯子促使信號肽、人G-CSF基因，該構(gòu)建體包含第一擊靶序列(1)、可擴增的標志基因(AM)、可選擇的標志基因(SM)、調(diào)節(jié)序列、CAP位點，拼接供體位點(SD)和第二擊靶序列(2)。黑方框代表編碼DNA而花點方框代表未轉(zhuǎn)譯序列。
圖14圖示本發(fā)明用于激活和擴增內(nèi)源性基因的構(gòu)建體，其中第一外顯子是非編碼，人FSHβ基因，該構(gòu)建體包含第一擊靶序列(1)，可擴增標志基因(AM)、可選擇標志基因(SM)、調(diào)節(jié)序列、CAP位點、拼接供體位點(SD)和第二擊靶序列(2)。黑框代表編碼DNA而點框代表未轉(zhuǎn)譯序列。
本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)可通過同源重組在細胞基因組中預選位點插入DNA的構(gòu)建體來改變細胞中有用內(nèi)源性基因的調(diào)節(jié)作用或其活性，所述構(gòu)建體包含(a)擊靶序列；(b)調(diào)節(jié)序列；(c)外顯子和(d)非配對拼接供體位點，其中擊靶序列指導元件(a)～(d)的整合，以使元件成分(b)～(d)可操作地連接到內(nèi)源性基因上。在另一實施例方案中，DNA構(gòu)建體包含(a)擊靶序列，(b)調(diào)節(jié)序列，(c)外顯子，(d)拼接供體位點，(e)內(nèi)含子，和(f)拼接受體位點，其中擊靶序列指導元件(a)～(f)的整合，以使元件(b)～(f)可操作地連接到內(nèi)源性基因的第一外顯子上?？筛鶕?jù)待插入DNA的位點而選擇所使用的擊靶序列。在兩實施方案中，擊靶過程用于產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)錄單位，它是一種由擊靶DNA構(gòu)建體和內(nèi)源性細胞基因?qū)氲男蛄械娜诤袭a(chǎn)物。如本文中所討論的，例如可通過向宿主細胞的基因組DNA中導入本發(fā)明的構(gòu)建體以形成新的轉(zhuǎn)錄單位，從而使轉(zhuǎn)錄靜止基因(即在轉(zhuǎn)染之前不能在細胞內(nèi)表達基因)在宿主細胞中被激活。也如本文所討論的，可通過使用本發(fā)明的方法和DNA構(gòu)建體來改變在細胞內(nèi)表達的內(nèi)源性基因的表達，其中可以是表達水平的提高、降低包括消除，或者可改變調(diào)節(jié)或誘導特征。
如上文提到的，本發(fā)明涉及以真核來源細胞，如真菌、植物或動物，如脊椎動物，特別是哺乳動物，更具體地是人來源的細胞內(nèi)的基因或DNA擊靶的方法。就是說，本發(fā)明涉及通過DNA的同源重組或擊靶將DNA導入脊椎動物來源的細胞如初級、次級或永久化細胞內(nèi)的方法，其中所說的DNA在預選定的位點導入細胞的基因組DNA中。更具體地說，本發(fā)明涉及同源重組，其中通過使用包含擊靶序列、調(diào)節(jié)序列、外顯子和拼接供體位點的DNA構(gòu)建體來修飾內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及按本方法產(chǎn)生的同源重組體細胞以及同源重組體細胞的應用。
本發(fā)明也涉及激活存在于脊椎動物來源的初級細胞、次級細胞或永久化細胞內(nèi)，但通常不在這些細胞中表達的基因的方法。使用同源重組或擊靶以將DNA導入細胞的基因組序列中，致使基因在受體細胞內(nèi)得以表達。在另一實施方案中，通過導入DNA構(gòu)建體，提高基因在細胞中基因的表達水平或改變基因的調(diào)節(jié)或誘導特征。結(jié)果使被編碼的產(chǎn)物以比在相應非轉(zhuǎn)染細胞中更高的水平被表達。本發(fā)明方法和DNA構(gòu)建體還可用于產(chǎn)生這樣的細胞，即其中所需產(chǎn)物在被轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的表達比在相應未被轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的表達水平低。就是說，在被轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)比所得到的原細胞內(nèi)產(chǎn)生更少的蛋白質(zhì)(包括非蛋白質(zhì))。
在另一實施方案中，編碼所需產(chǎn)物的正常靜止基因在被轉(zhuǎn)染的初級、次級或永久化細胞內(nèi)被激活并擴增。該實施方案是一種通過與基因組DNA同源重組而導入通常沒有在功能上與內(nèi)源性基因連接的DNA序列的方法，其中(1)當該DNA序列在內(nèi)源基因處或附近被插入宿主基因組中時，即可用以改變(如激活)內(nèi)源基因的表達，并且(2)得以選擇那些其中激活的內(nèi)源基因被擴增的細胞。另外，在所得原細胞中通常表達的基因的表達水平得以提高并且基因也被擴增。
下文描述本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，用這些DNA構(gòu)建體產(chǎn)生被轉(zhuǎn)染細胞的方法、轉(zhuǎn)染細胞以及這些細胞的應用。
DNA構(gòu)建體本發(fā)明的DNA構(gòu)建體至少包括下列成分擊靶序列、調(diào)節(jié)序列、外顯子和未配對拼接供體位點。在該構(gòu)建體中，外顯子在調(diào)節(jié)序列的3′側(cè)，而未配對拼接供體位點在外顯子的3′側(cè)。另外，在側(cè)接有未配對拼接供體位點的外顯子前面(5′方向)可以有多個外顯子和/或內(nèi)含子。如本文所討論的，通常有附加的構(gòu)建體成分，如可選擇標志或可擴增標志。
構(gòu)建體中DNA可以被稱為外源性的。本文所用的術(shù)語“外源性”被定義為借助本發(fā)明的方法，如借助本文限定的DNA構(gòu)建體導入到細胞內(nèi)的DNA。外源性DNA可以具有與存在于轉(zhuǎn)染前細胞內(nèi)的內(nèi)源性DNA相同或不同的序列。
擊靶序列擊靶序列是允許合理同源重組到所選擇的含有用基因的細胞的基因組中的DNA序列。擊靶序列一般是與正常存在于所得原細胞的基因組中的DNA序列(如位于有用基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游、轉(zhuǎn)染終止位點內(nèi)或下游的編碼或非編碼DNA，或者通過原先的修飾而存在于基因組中的序列)同源(即與細胞DNA相同或有足夠的相似，以使擊靶序列和細胞DNA能夠發(fā)生同源重組)的DNA序列?？蓞⒄諏⑾蚱渲胁迦隓NA構(gòu)建體的DNA的位點來選擇所用的擊靶序列。
可利用一個或多個擊靶序列。例如，環(huán)形質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選使用單一擊靶序列。線性質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選使用兩個擊靶序列。擊靶序列可任意地在有用基因(如外顯子和/或內(nèi)含子的序列)之內(nèi)、直接鄰接到有用基因上(即在擊靶序列和有用基因的編碼區(qū)之間沒有另外的核苷酸)、在有用基因的上游(如上游非編碼區(qū)的序列或內(nèi)源性啟動子序列)、或在基因的上游并離開一定的距離(如內(nèi)源性啟動子的上游序列)。擊靶序列可以包括那些目前已知的或已測定了序列的被擊中基因的區(qū)域，和/或結(jié)構(gòu)上沒有確定但可使用限制性內(nèi)切酶制出基因圖并由本發(fā)領域技術(shù)人員確定的更上游區(qū)域。
如本文所教導的，可用基因擊靶方法將分離自不同基因的、由分離自不同細胞和/或病毒來源的成分組裝的、或作為新的調(diào)節(jié)序列以基因工程方法合成的調(diào)節(jié)序列插入到內(nèi)源細胞基因內(nèi)、與之直接相鄰處、上游或與之有相當距離的位點中。另外，可通過擊靶來取代、除去、加入或修飾可影響所產(chǎn)生的RNA或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性的序列。例如，可修飾RNA分子的RNA穩(wěn)定性元件、拼接位點和/或前導序列，以改善或改變RNA分子的功能、穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)譯能力。也可以改變蛋白質(zhì)序列如信號序列、原肽序列、活性位點和/或結(jié)構(gòu)序列以改善或修飾蛋白質(zhì)的運輸、分泌或功能特性。根據(jù)該方法，導入外源DNA可導致基因的正常表達性質(zhì)和/或蛋白質(zhì)或RNA的結(jié)構(gòu)特性的改變。
調(diào)節(jié)序列DNA構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序列可由一個或多個啟動子(如構(gòu)成的或可誘導的啟動子)、增強子、骨架連接區(qū)或基質(zhì)連接位點、負調(diào)節(jié)元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或所述序列的結(jié)合物。
調(diào)節(jié)序列可包含可誘導的啟動子，這樣原產(chǎn)生時可被導入個體內(nèi)時的細胞并不表達產(chǎn)物即可被誘導以表達(即在被轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生后但植入之前或在植入之后被誘導表達)。當然，可以按導入時進行表達的方式(例如，在構(gòu)成的啟動子條件下)將編碼所需產(chǎn)物的DNA導入細胞內(nèi)?？蓮募毎虿《净蚪M中分離調(diào)節(jié)序列，這樣的調(diào)節(jié)序列包括調(diào)節(jié)SV40早期或晚期基因、腺病毒大晚期基因、小鼠金屬硫因-I基因、延長因子-1α基因、細胞巨大病毒基因、膠原蛋白基因、肌動蛋白基因、免疫球蛋白基因或HGM-CoA還原酶基因表達的序列。調(diào)節(jié)序列較好的含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如TATA盒、CCAAT盒、AP1、SP1或NF-KB結(jié)合位點。
附加的DNA構(gòu)建體元件DNA構(gòu)建體還包含一個或多個外顯子。本文中將外顯子定義為被拷貝成RNA并以成熟mRNA分子存在的DNA序列。外顯子可任選地含有編碼一個或多個氨基酸和/或部分地編碼某種氨基酸(即密碼子的一個或兩個堿基)的DNA。另外，外顯子還含有相當于5′非編碼區(qū)的DNA。如外源性外顯子編碼一個或多個氨基酸和/或某氨基酸的一部分，設計DNA構(gòu)建體以使在轉(zhuǎn)錄和拼接時使解讀碼與靶基因的第二個外顯子或編碼區(qū)為碼內(nèi)的。本文所用術(shù)語“碼內(nèi)的”是指當?shù)谝煌怙@子和第二外顯子的編碼序列融合時，核苷酸就以并不改變由第二外顯子衍生的mRNA部分的適當解讀碼的方式連接在一起。
如中靶基因的第一外顯子含有用以啟動轉(zhuǎn)譯的序列ATG，則構(gòu)建體的外源性外顯子優(yōu)選地含有ATG，并且必要時還含有一個或多個核苷酸，從而使所得的包括中靶基因的第二個和繼后外顯子的mRNA編碼區(qū)是在碼內(nèi)的。這種其中第一外顯子含有ATG的靶基因的例子包括編碼hEPO、hGH、人的粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)和人的粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的基因。
如靶基因編碼促紅細胞生成素，外源性外顯子可衍生于任何基因，所述基因中外顯子包含ATG起始密碼子并編碼蛋白質(zhì)的一部分。外顯子進一步終止在密碼子的第一個核苷酸處。例子包括脫脂蛋白E基因(外顯子1和2)、胎盤促乳激素基因(由hCS-A和hCS-B基因編碼的)、促乳素基因、人生長激素變體基因(hGH-B)、人絨毛膜生長催乳激素-L基因(hCS-L)和粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子基因(EM-CSF)。
拼接供體位點是指導一個外顯子拼接到另一個外顯子上的序列。通常，第一外顯子位于第二外顯子的5′側(cè)，重疊并側(cè)接第一外顯子在其3′側(cè)上第一外顯子的拼接供體位點識別側(cè)接在第二外顯子5′側(cè)上第二外顯子的拼接受體位點。拼接供體位點具有以(A/C)AGGURAGU(其中R代表嘌呤核苷酸)為代表的特征性相符序列，要求第四和第五位上是GU(Jakson，I.J.，Nucleic Acids Research 193715-3798(1991)。拼接供體相符位點的前三個堿基為外顯子的后三個堿基。拼接供體位點在功能上是由它們影響mRNA拼接途徑內(nèi)適當反應的能力來限定的。
本文中未配對拼接供體位點被定義為存在于擊靶構(gòu)建體中并且不與構(gòu)建體中位于該未配對拼接供體位點3′側(cè)的拼接受體位點相伴隨的拼接供體位點。未配對拼接供體位點導致與內(nèi)源拼接受體位點的拼接。
與拼接供體位點一樣，序列中的拼接受體位點也是指導一個外顯子與另一個外顯子的拼接?；谠谂c拼接供體位點結(jié)合中發(fā)揮的作用，拼接機構(gòu)使用拼接受體位點以除去內(nèi)含子。拼接受體位點具有以YYYYYYYYYYNYAG代表的特征性序列，其中Y代表任何嘧啶堿基而N代表任何核苷酸(Jackon，I.J.，Nacleic Acids Research 193715-3798(1991))。
內(nèi)含子定義為位于兩個外顯子之間的，并在mRNA分子形成過程中通過拼接從前體RNA分子除去的一個或多個核苷酸的序列。
調(diào)節(jié)序列是例如可操作地連接到ATG起始密碼子上，它可啟動轉(zhuǎn)譯。選擇性地，CAP位點(與調(diào)節(jié)區(qū)相連并被調(diào)節(jié)區(qū)利用的特異性mRNA起始位點)可操作地連接到調(diào)節(jié)序列和ATG起始密碼子上。另外，與調(diào)節(jié)序列相連并被調(diào)節(jié)序列利用的該CAP位點不包括在擊靶構(gòu)建體中，并且轉(zhuǎn)錄機構(gòu)將限定一個新的CAP位點。對于大多數(shù)基因來說，CAP位點通常見于TATA盒3′側(cè)約25個核苷酸處。在一實施方案中，拼接供體位點位于與ATG直接相鄰處，例如當外源性外顯子與靶基因的第二外顯子是同在碼內(nèi)時，便不一定要求存在一個或多個核苷酸。編碼一個或多個氨基酸或氨基酸部分的DNA與靶基因的編碼序列在碼內(nèi)時，則它最好位于直接與其3′側(cè)上的ATG相鄰處。在這樣一個實施方案中，拼接供體位點位于直接與其3′側(cè)上的編碼DNA相鄰。
可操作地連接的或功能上安置的是指一種構(gòu)型，其中外源性調(diào)節(jié)序列、外顯子、拼接供體位點，和任選地存在的某序列及拼接受體位點被適當?shù)負舭性谂c內(nèi)源性基因相對應的位置上，從而使調(diào)節(jié)元件指導初級RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)錄物在CAP位點處開始(可任選地包括在擊靶構(gòu)建體中)并包括相當于擊靶構(gòu)建體之外顯子和拼接供體位點的序列、位于內(nèi)源性基因調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)區(qū)(如存在的話)上游的DNA、內(nèi)源性基因的調(diào)節(jié)區(qū)(如存在的話)、內(nèi)源性其因的5′非轉(zhuǎn)錄區(qū)(如存在的話)、和內(nèi)源性基因的外顯子和內(nèi)含子(如存在的話)。在可操作地連接的構(gòu)型中，擊靶構(gòu)建體的拼接供體位點指導一個與側(cè)接內(nèi)源性基因的外顯子之一的拼接受體位點相拼接的過程，從而能夠從全拼接的成熟轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，拼接受體位點是內(nèi)源性的，這樣拼接過程是針對著內(nèi)源性外顯子，例如內(nèi)源基因的內(nèi)源性外顯子。在另一個實施方案中，拼接受體位點被包括在擊靶構(gòu)建體中，這種拼接過程可除去由擊靶構(gòu)建體導入的內(nèi)含子。
所用的編碼DNA(如在擊靶構(gòu)建體的外顯子1中)可任選地編碼一個或多個氨基酸，和/或某氨基酸的一部分，它們是與內(nèi)源蛋白質(zhì)的編碼DNA同樣的。本文所用的編碼DNA序列例如可相應于有用基因的第一外顯子。另外該編碼DNA可編碼不同于有用蛋白質(zhì)的第一外顯子的一個或多個氨基酸或某氨基酸的一部分。當有用蛋白質(zhì)的第一外顯子的氨基酸對于該蛋白質(zhì)的一種或多種活性不是很關(guān)鍵的情況下，這樣一個實施方案是特別有意義的。例如，當構(gòu)建與內(nèi)源性hEPO基因形成融合體時，則可利用編碼hGH的第一外顯子的序列。在這個例子中，hGH外顯子1與hEPO外顯子2的融合導致有功能活性的雜合信號肽的形成。在相關(guān)的構(gòu)建體中，可使用其中被編碼的氨基酸并不阻礙雜合信號肽的功能的任何人或非人來源的外顯子。在一相關(guān)實施方案中，也可使用該技術(shù)以糾正見于靶基因中的突變。
如所需產(chǎn)物是內(nèi)源蛋白質(zhì)和擊靶構(gòu)建體中編碼序列的融合蛋白質(zhì)時，按本方法摻入到細胞內(nèi)的外源性編碼DNA包括編碼一個或多個外顯子的DNA，或相當于被融合到內(nèi)源靶基因產(chǎn)物上的轉(zhuǎn)譯或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA序列。在該實施方案中，使用擊靶方法制備嵌合或多功能蛋白質(zhì)，它將來自兩個或多個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、酶促、或配基或受體結(jié)合性質(zhì)組合到一個多肽中。例如，外源DNA可編碼在靶蛋白質(zhì)膜上定位的錨地肽或信號肽，以提供或改善細胞分泌、前導序列、酶促區(qū)域、跨膜優(yōu)勢區(qū)域、輔因子結(jié)合區(qū)域或其他功能性區(qū)域。正常情況下不分泌但可與信號蛋白質(zhì)融合以提供分泌的蛋白質(zhì)實例包括多巴脫羧酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白、α-半乳糖苷酶和駱氨酸羥化酶。
如靶基因的第一外顯子相當于非編碼區(qū)(例如促濾泡激素β(FSHβ)基因的第一外顯子)，則不必有或較好刪除外源ATG。
可從天然來源得到，或使用基因工程技術(shù)或合成方法產(chǎn)生構(gòu)建體的DNA。
靶基因和所得產(chǎn)物當轉(zhuǎn)染到細胞如初級、次級或永久化細胞內(nèi)之后，DNA構(gòu)建體即可控制所需產(chǎn)物如蛋白質(zhì)或RNA的活性或功能性部分的表達。產(chǎn)物例如可以是激素、細胞激活素、抗原、抗體、酶、凝血因子、運輸?shù)鞍踪|(zhì)、受體、調(diào)節(jié)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、反義RNA或核糖酶(ribozyme)。另外，產(chǎn)物也可以是自然界不存在的蛋白質(zhì)或核酸(即融合體蛋白質(zhì)或核酸)。
本文所述的方法可產(chǎn)生一種或多種治療產(chǎn)品，如促紅細胞生成素、降鈣素、生長激素、胰島素、促胰島激素、類胰島素生長因子、甲狀旁腺激素、干擾素β和神經(jīng)生長因子、FSHβ、TGF-β、腫瘤壞死因子、胰高血糖素、骨生長因子2、骨生長因子7、TSH-β、白介素1、白介素2、白介素3、白介素6、白介素11、白介素12、CSF-粒細胞、CSF-巨噬細胞、CSF一粒細胞/巨噬細胞、免疫球蛋白、催化抗體、蛋白激酶C、萄糖腦苷酯酶、過氧化物岐化酶、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、尿激酶、抗凝血酶III、DNAse、α-半乳糖苷酶、酪氨酸羥化酶、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、脫脂蛋白E或脫脂蛋白A-I、珠蛋白、低密度脂蛋白受體、IL-2受體、IL-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶、免疫反應修飾劑和可溶性CD4。
可選擇標志和擴增可使用一個或多個可選擇的標志基因以利于鑒定擊靶過程。這些標志可包括在擊靶構(gòu)建體中或出現(xiàn)在不同構(gòu)建體上?？蛇x擇標志可分為兩類陽性可選擇的和陰性可選擇的(換句話說，即進行陽性選擇或陰性選擇的標志)。在陽性選擇中，表達陽性可選擇標志的細胞能夠用選擇劑(如neo、黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(gpt)、dhfr、腺苷脫氨酶(ada)、嘌呤霉素(pac)、潮霉素(hyg)、編碼氨甲酰磷酸合成酶的CAD、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、和二氫乳清酶、谷氨酰胺合成酶(GS)、多藥物抗性1(mdrl)和組氨酸D(his D)存活處理，從而可以選擇出其中擊靶構(gòu)建體已整合到宿主細胞基因組內(nèi)的細胞。在陰性選擇中，在選擇劑存在下表達陰性可選擇標志的細胞被破壞?？墒褂靡粋€或多個呈現(xiàn)陰性選擇特性的標志基因以利于鑒定擊靶過程，這樣就使陰性可選擇標志連接到外源DNA上，但所形成排布關(guān)系是使陰性可選擇標志連接在擊靶序列的側(cè)翼，并從而與宿主細胞基因組中序列形成正確的同源重組不會導致陰性可選擇標志的穩(wěn)定整合(Mansour，S.L.et al.，Nature 336348-352(1988))。用于這一目的的標志包括單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因或細菌gpt基因。
可將各種可選擇標志摻入到初級、次級或永久化細胞中。例如，可使用具有可選擇表型如藥物抗性、營養(yǎng)缺陷型、對細胞毒性劑的抗性或表面蛋白質(zhì)的表達等可選擇標志?？墒褂玫目蛇x擇標志基因包括neo、gpt、dhfr、ada、pac、hyg、CAD、GS、mdr1和hhisD。所賦予的可選擇表型使具有可能鑒定和分離受體細胞。
編碼可選擇標志的可擴增基因(如ada、GS、dhfe和多功能CAD基因)具有外加特征，該特征可使它們能夠選擇含有被插入到基因組內(nèi)的可選擇標志的已擴增拷貝的細胞。這一特征提供了一種顯著增加期望擴增的相鄰或相連基因的拷貝數(shù)的機制。也可使用顯示改善了選擇特性的這些序列的突變體及其它他可擴增序列。
DNA構(gòu)建體中各構(gòu)成部分的排列次序可以是不同的。當構(gòu)建體是環(huán)形質(zhì)粒時，所得結(jié)構(gòu)中各元件的次序可以是擊靶序列-質(zhì)粒DNA(由用于選擇和/或復制微生物或其他適當宿主中擊靶質(zhì)粒的序列構(gòu)成)-可選擇標志-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體位點。較好地是使用在擊靶序列內(nèi)切割一次或多次的限制性內(nèi)切酶切割含有擊靶序列和外源DNA元件的質(zhì)粒，以在導入受體細胞前產(chǎn)生線性或帶缺口的分子，從而使游離DNA末端增加如本文所述的預期同源重組過程的頻率。另外，可用核酸外切酶處理游離DNA末端以產(chǎn)生懸垂單股DNA末端的突出的5′或3′，從而增加預期同源重組過程的頻率。在該實施方案中，擊靶序列和細胞靶之間的同源重組將產(chǎn)生兩個側(cè)接于包含在被導入質(zhì)粒內(nèi)的元件上的擊靶序列的拷貝。
如構(gòu)建體是線性的，該次序列如可以是第一擊靶序列-可選擇標志-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體位點-第二擊靶序列；或者可以是第一擊靶序列-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體位點-編碼可選擇標志的DNA-第二擊靶序列。穩(wěn)定地整合構(gòu)建體的細胞將用選擇劑存活處理；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞的一個亞群將是同源重組體細胞?？捎肞CR、Southern雜交及表型篩選多種技術(shù)鑒定同源重組體細胞。
在另一實施方案中，構(gòu)建體各部分的次序可以是第一擊靶序列-可選擇標志-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體位點-內(nèi)含子-拼接受體位點-第二擊靶序列。
或者，DNA構(gòu)建體中各組成部分的次序列如可以是第一擊靶序列-可選擇標志1-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體位點-第二擊靶序列-可選擇標志2，或者可以是第一擊靶序列-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體供點-可選擇標志1-第二擊靶序列-可選擇標志2。在此實施方案中，可選擇標志2表現(xiàn)有陰性選擇的特征。就是說，可根據(jù)不在含有某種試劑(一般是藥物或代謝物類似物)的適當培養(yǎng)基配制物中的生長來選擇可選擇標志2的基因產(chǎn)物，其中所述試劑可殺死表達可選擇標志2的細胞。側(cè)接可選擇標志1的擊靶序列與宿主細胞基因組中同源序列間的重組造成可選擇標志1的定位整合，而可選擇標志2則不被整合。這樣的重組過程產(chǎn)生被可選擇標志1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染但不被可選擇標志2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，并可根據(jù)在含有選擇可選擇標志1的選擇劑及不選擇可選擇標志2的選擇劑的培養(yǎng)基中的生長情況來選擇這些細胞。
DNA構(gòu)建體還可包括允許選擇含有該標志的已擴增拷貝的細胞的陽性可選擇標志。擴增這樣一個標志導致側(cè)接DNA序列的共擴增。在此實施方案中，構(gòu)建體各組分的排列次序例如是第一擊靶序列-可擴增的陽性可選擇標志-第二可選擇標志(可任選的)-調(diào)節(jié)序列-外顯子-拼接供體位點-第二擊靶DNA序列。
在此實施方案中，可通過包含可選擇標志基因進一步擴增被激活的基因，所述標志基因具有能通過在有適當可選擇制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞而選擇含有可選擇標志基因的已擴增拷貝的細胞的性質(zhì)。被激活的內(nèi)源基因?qū)⑴c已擴增的可選擇標志基因相繼被擴增。含有許多被激活內(nèi)源基因的拷貝的細胞可產(chǎn)生很高量的所需蛋白質(zhì)，并可用于體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)和基因治療。
在任何實施方案中，可選擇和可擴增標志基因均不必彼此直接相鄰。
任選地DNA構(gòu)建體可以含有允許在細菌或任何其它適當克隆/宿主系統(tǒng)中大量增殖質(zhì)粒的細菌復制原點和細胞抗生素抗性標志或其它可選擇標志。可使用包含編碼可選擇標志的DNA連同附加序列如啟動子和拼接接合點一起的DNA構(gòu)建體以賦予被轉(zhuǎn)染的細胞以可選擇表型(如圖4中示意表示的質(zhì)粒pCDNEO)?？墒褂帽疚乃龇椒▽⑦@樣的DNA構(gòu)建體連同擊靶DNA序列共轉(zhuǎn)染到初級或次級細胞內(nèi)。
轉(zhuǎn)染和同源重組根據(jù)本方法，將構(gòu)建體作為單一DNA構(gòu)建體或分離的DNA序列導入細胞如初級、次級或永久化細胞中，其中分離的DNA序列漸漸摻入到被轉(zhuǎn)染細胞的染色體或核DNA中。
可以在單一DNA構(gòu)建體或在分離的構(gòu)建體上將含有擊靶序列、調(diào)節(jié)序列、外顯子、拼接供體位點和可選擇標志基因的擊靶DNA構(gòu)建體導入細胞內(nèi)。DNA構(gòu)建體的總長度將根據(jù)組分(例前擊靶序列、調(diào)節(jié)序列、外顯子、可選擇標志基因和基它元件)的數(shù)目和各組分的長度而定。整個構(gòu)建體的長度一般為至少約200個核苷酸。另外，該DNA可作為線型、雙股(在一個末端或兩末端有或沒有單股區(qū))、單股或環(huán)狀DNA而被導入。
然后將本發(fā)明公開的任何一種形式的構(gòu)建體導入細胞內(nèi)以得到被轉(zhuǎn)染的細胞。在如本技術(shù)領域中已知的允許發(fā)生同源重組的條件下維持被轉(zhuǎn)染的細胞(Capecchi，M.R.，Science 2441288-1292(1989)。當在足以轉(zhuǎn)錄DNA的條件下維持同源重組細胞時，被擊靶構(gòu)建體導入的調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動子)將激活轉(zhuǎn)錄過程。
可借助多種物理或化學方法將DNA構(gòu)建體導入細胞內(nèi)，這些方法包括電穿孔、微注射、微彈轟擊、磷酸鈣沉淀、以及脂質(zhì)體、聚乙烯(polybrene-)或DEAE葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染。此外也可使用傳染性載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)的腮腺炎和脊髓灰質(zhì)炎病毒載體以導入DNA。
任選地也可以按兩個或多個分離的DNA片段的形式將擊靶DNA導入細胞內(nèi)。在使用兩個片段的情況下，一個片段的3′末端和另一個片段的5′末端共享DNA序列同源性(交疊)，而一個片段攜帶第一擊靶序列且另一個攜帶第二擊靶序列。在導入細胞時，兩片段可進行同源重組以形成單一片段，其中第一和第二擊靶序列側(cè)接兩原始片段間的交疊區(qū)域。這樣所得產(chǎn)物片段是適用于與細胞靶序列的同源重組。也可以使用兩個以上的片段，設計要使這些片段能彼此進行同源重組，以最后形成適于按上述方法與細胞靶序列同源重組的產(chǎn)物。
同源重組體細胞擊靶過程導致?lián)舭袠?gòu)建體的調(diào)節(jié)序列的插入，使內(nèi)源基因處于它們的控制下(例如通過在內(nèi)源基因或調(diào)節(jié)區(qū)的上游插入啟動子或增強子)。任選地，擊靶過程可以同時造成內(nèi)源調(diào)節(jié)元件的缺失，如組織特異性負調(diào)節(jié)元件的缺失。擊靶過程可置換已有的元件，例如組織特異性增強子可被比天然元件有更寬或不同細胞類型特異性的增強子所取代，或者呈現(xiàn)出有不同于相應未轉(zhuǎn)染細胞的調(diào)節(jié)或誘導特征。在此實施方案中，天然存在的序列被刪除而加入了新的序列。另外，也可以是內(nèi)源調(diào)節(jié)元件未被除去或置換，而是借助擊靶過程如針對內(nèi)源調(diào)節(jié)元件內(nèi)外源序列的擊靶過程使之破壞或失去活性。
在將DNA導入細胞后，在本領域已知的、適于在基因組DNA和被引入的DNA部分間發(fā)生同源重組的條件下維持細胞(Capecchi，M.R.，Science 2441288-1292(1989))。
基因組DNA與被導入的DNA間的同源重組產(chǎn)生同源性重組體細胞如真菌、植物或動物細胞，特別是初級、次級或永久化人或其它哺乳動物細胞，其中改變內(nèi)源基因表達的序列被可操作地連接到編碼某產(chǎn)物的內(nèi)源基因上，產(chǎn)生具有不同于內(nèi)源基因的表達和/或編碼潛能的新的轉(zhuǎn)錄單位。具體地說，本發(fā)明包括含有調(diào)節(jié)序列和外顯子的同源重組體細胞，所說的調(diào)節(jié)序列和外顯子側(cè)接有拼接供體位點，借助擊靶DNA構(gòu)建體在預定位點導入并被可操作地連接到內(nèi)源基因的第二外顯子上。任選地，也可以有多個可操作地連接到內(nèi)源基因的任何外顯子上的外源外顯子(編碼或非編碼的)和內(nèi)含子。在選擇擴增編碼可擴增標志和新的轉(zhuǎn)錄單位(如適當?shù)脑?的DNA的條件下培養(yǎng)所得到的同源重組體細胞。無論是否擴增，均可在本領域已知的適于蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)用該方法產(chǎn)生的細胞，從而在體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)，或者將細胞用于體內(nèi)輸送治療性蛋白質(zhì)(即基因治療)。
本文所說的初級細胞包括存在于從脊椎動物組織源分離的細胞懸液(在將它們輔敷在即結(jié)合在組織培養(yǎng)基質(zhì)如平皿或培養(yǎng)瓶之前)中的細胞、存在于得自組織的外植體中的細胞(這兩種細胞都是用于第一次鋪板的原型細胞)和從這些鋪板細胞得到的細胞懸液。術(shù)語次級細胞或細胞株是指在培養(yǎng)中所有繼后步驟的細胞。就是說，從培養(yǎng)基質(zhì)中除去第一次鋪板的初級細胞并重新鋪板的(傳代的)，以及繼后傳代的所有細胞本文稱為次級細胞。次級細胞是由已傳代一次或多次的次級細胞構(gòu)成的細胞株。一種由次級細胞構(gòu)成的細胞株是1)已傳代一次或多次；2)在培養(yǎng)物中呈現(xiàn)有限數(shù)目的平均種群倍增特性；3)表現(xiàn)有接觸抑制的、錨地依賴性生長特性(錨地依賴性并不適用于在懸浮培養(yǎng)物中增值的細胞)；以及4)非永化的。
永久化細胞是細胞系(與專為初級和次級細胞而定的“細胞株”這一定義相對的)，其主要特征是它們在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出顯然無限的壽命。
為本主題方法而選用的細胞可分為四種類型或大類1)如原得到時那樣并不制造或含有蛋白質(zhì)或產(chǎn)物(如通常不被細胞表達的蛋白質(zhì)或自然界通常沒有的融合蛋白質(zhì))的細胞；2)制造或含有某蛋白質(zhì)或產(chǎn)物的細胞，但其制造或含有量并不是所預期的量(如其量低于其所得到時的原細胞的生理上通常的低水平)；3)如原得到時的原細胞的一生理上通常的低水平制造某蛋白質(zhì)或產(chǎn)物的細胞，但其含量或產(chǎn)量將被提高或增大；以及4)可望改變其中編碼某蛋白質(zhì)的基因的調(diào)節(jié)或誘導特征的細胞。
可從各種組織得到用本方法轉(zhuǎn)染的初級、次級和永久化細胞，并包括所有可在培養(yǎng)物中維持的細胞類型。例如，可用本方法轉(zhuǎn)染的初級和次級細胞包括成纖維細胞、角質(zhì)細胞、上皮細胞(如乳腺上皮細胞、小腸上皮細胞)、內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、血液的形成成份(如淋巴細胞、骨髓細胞)、肌細胞和這些體細胞的前體細胞。如同源重組體細胞要用于基因治療，初級細胞較好是從將接受被轉(zhuǎn)染的初級或次級細胞的個體體內(nèi)得到的。但初級細胞可以從同種的供體(受體以外的個體)得到。
也可以用本方法產(chǎn)生同源重組體永久化細胞并用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)或基因治療。用于按本方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)或基因治療的永久化人細胞系的實例包括但不只限于HT1080細胞(ATCC CCL 121)、HeLa細胞和HeLa細胞的衍生物(ATCC CCL 2、2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC BTH 22)、K-562白血病細胞(ATCC CCL 243)、KB癌細胞(ATCC CCL 17)、2780AD卵巢癌細胞(Van der Blick，A.M.et al.，Cancer Res.，485927-5932(1988))、Raji細胞(ATCC CCL 86)、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)、Namalwa細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240)、Daudi細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、V-937細胞(ATCC CRL 1593)、Bowes黑素瘤細胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC CCL 75.1)和MO LT-4細胞(ATCC CRL1582)，以及經(jīng)融合人細胞和另一種類細胞所產(chǎn)生的異種雜交瘤細胞?？墒褂么渭壢顺衫w維細胞細胞株如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL 171)。另外，可使用初級、次級和永久化人細胞，以及顯示出體外基因擴增性質(zhì)的其它種屬的初級、次級或永久化細胞進行體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)或基因治療。
將基因轉(zhuǎn)變成cDNA拷貝的方法本發(fā)明還涉及使用同源重組將基因轉(zhuǎn)變成cDNA拷貝(沒有內(nèi)含子的基因拷貝)的方法?？蓪DNA拷貝轉(zhuǎn)換到酵母或細菌中以進行體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)，或者將cDNA拷貝插入哺乳動物細胞中以進行體外或體內(nèi)蛋白質(zhì)生產(chǎn)。如果cDNA將被轉(zhuǎn)移到微生物細胞內(nèi)，可經(jīng)同源重組導入兩個含有擊靶序列的DNA構(gòu)建體，一個是編碼治療性蛋白質(zhì)的人基因的上游構(gòu)建體，一個是所說基因的下游構(gòu)建體。例如，導入上游的序列包括與編碼成熟的經(jīng)加工的治療性蛋白質(zhì)的第一個氨基酸的DNA或其上游基因組DNA序列同源的DNA序列、反轉(zhuǎn)錄病毒長期重復(LTR)、編碼在微生物細胞中用于選擇的標志的序列、在微生物細胞中有功能的調(diào)節(jié)元件、以及具有拼接供體位點的編碼啟動微生物細胞分泌的前導肽的DNA。導入上游的序列是在編碼成熟的經(jīng)加工的治療性蛋白質(zhì)的第一氨基酸的基因組DNA附近和上游被導入的。導入下游的序列包括與編碼成熟的經(jīng)加工的蛋白質(zhì)的最后一個氨基酸的DNA或其下游的基因組DNA序列同源的DNA序列、微生物的轉(zhuǎn)錄終止序列、能指導DNA在微生物細胞中復制的序列和反轉(zhuǎn)錄病毒LTR。導入下游的序列是在編碼成熟的經(jīng)加工的治療性蛋白質(zhì)的終止密碼子的DNA相鄰處和下游被導入的。在這兩個DNA構(gòu)建體被導入細胞內(nèi)之后，在適合于被導入DNA與基因組DNA間發(fā)生同源重組的條件下維持所得細胞，從而產(chǎn)生同源重組體細胞。有時，DNA構(gòu)建體之一或兩者可編碼用于含有DNA構(gòu)建體的細胞的陽性或陰性選擇的一個或多個標志，并且可在將其中之一或兩種DNA構(gòu)建體導入細胞后在本方法中增加一個選擇步驟。另外，編碼在微生物細胞內(nèi)的選擇標志的序列和能夠指導DNA在微生物細胞中復制的序列可以是兩者都存在于上游或下游擊靶構(gòu)建體中，或者可以是在微生物細胞內(nèi)用于選擇的標志存在于下游擊靶構(gòu)建體中而能夠指導DNA在微生物細胞中復制的序列可以存在于上游擊靶構(gòu)建體中。然后在適于LTR指導的轉(zhuǎn)錄、編碼治療性蛋白質(zhì)的基因的RNA產(chǎn)物的加工和反轉(zhuǎn)錄的條件下培養(yǎng)同源重組體細胞。反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是含有編碼治療性蛋白質(zhì)的無內(nèi)含子DNA拷貝的DNA構(gòu)建體。它可操作地連接到含上述兩個外源DNA構(gòu)建體的DNA序列上的。然后將按本方法生產(chǎn)的無內(nèi)含子DNA構(gòu)建體導入微生物細胞中。在適于治療性蛋白質(zhì)的表達和分泌的條件下培養(yǎng)該微生物細胞。
體內(nèi)蛋白質(zhì)生產(chǎn)本發(fā)明的同源重組體細胞可作為同源重組體細胞系的群體、作為同源重組體初級次級細胞的群體、同源重組體克隆細胞株或細胞系、同源重組體異源細胞株或細胞系，以及作為其中含有前述四類同源重組體細胞之一的至少一種代表性細胞的細胞混合物使用。這樣的細胞可用于治療患有對治療性產(chǎn)物傳送起反應的異?；虿黄谕麪顟B(tài)的個體的傳送系統(tǒng)，所說的治療性產(chǎn)物是1)治療性蛋白質(zhì)(例如個體體內(nèi)沒有的、相對于個體的生理需要生產(chǎn)不足的、個體有缺陷的或無效地或不適當?shù)乩玫牡鞍踪|(zhì)；有新的功能如酶促或運輸功能的蛋白質(zhì))，或2)治療性核酸(如抑制基因表達或具有固有酶促活性的RNA)。在本發(fā)明的提供治療性蛋白質(zhì)或核酸的方法中，給患有待治療或預防的異?；虿黄谕牟±頎顟B(tài)的個體，以適當?shù)耐緩绞褂米懔康耐粗亟M體初級細胞、克隆細胞株或異源細胞株，以在生理相關(guān)水平上表達或制備可得的該蛋白質(zhì)或外源DNA。生理相關(guān)水平是接近體內(nèi)正常產(chǎn)生的產(chǎn)物水平或?qū)е庐惓；虿黄谕臓顟B(tài)得以改善的產(chǎn)物水平。根據(jù)本文所述的本發(fā)明實施方案，待用于個體的同源重組體永久化細胞系可被轉(zhuǎn)入一個或多個半透性屏障裝置內(nèi)。裝置的滲透性質(zhì)是要在植入動物體內(nèi)后可阻止細胞離開裝置，而治療性產(chǎn)物能自由透過并可離開屏障裝置而進入植入物周圍的局部空間或進入全身循環(huán)。例如，可使hGH、hEPO、人促胰島激素、hGH-CSF、hG-CSF、人α干擾素或人FSHβ在人體內(nèi)全身傳運而有助于治療。
屏障裝置是特別有用的，并可使要植入的同源重組體永久化細胞、來自其它種的同源重組體細胞(同源重組體外源細胞)，或來自非組織相容性匹配供體的細胞(同源重組體同種異體細胞)用以治療人或動物的病理狀態(tài)，或在農(nóng)業(yè)上應用(即用于肉和奶生產(chǎn))。當由于任何原因而要停止治療時，屏障裝置可通過提供迅速地接近以除去細胞的途徑而進行方便的短期(即短暫)治療。
有許多合成的、半合成的或天然的濾膜都可用于這一目的，它們包括，但不限于，纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維素、聚砜、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯聚合物和聚氯乙烯衍生物的聚合物。利用屏障裝置時，可使來自另一種屬的初級、次級或永久化細胞也能用于人的基因治療。
體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明，來自人或非人種屬的同源重組體細胞也可用于體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)。在本領域已知的、導致蛋白質(zhì)表達的條件下維持細胞。為純化所需的蛋白質(zhì)，可使用已述方法將表達的蛋白質(zhì)以細胞溶胞產(chǎn)物或細胞上清液中純化。按照本方法制得的蛋白質(zhì)包括治療性蛋白質(zhì)，它可用本領域已知的常規(guī)給藥途徑(如口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或皮下等途徑)輸送到人或非人動物體內(nèi)。這些蛋白質(zhì)包括hGH、hEPO和人促胰島激素、hGM-CSF、hG-CSF、FSHβ或α干擾素。這些細胞可以是永久化、初級或次級細胞。在非人細胞有利于進行治療性或商用非人蛋白的蛋白生產(chǎn)時，可以使用來自其它種屬的細胞，例如使用得自鮭魚的細胞以生產(chǎn)鮭魚降鈣素，使用得自豬的細胞以生產(chǎn)豬胰島素，并使用牛細胞以生產(chǎn)牛生長激素。
在另一實施方案中，本發(fā)明描述了在被轉(zhuǎn)染的初級、次級或永久化細胞中激活(即打開)和擴增編碼所需產(chǎn)物的內(nèi)源基因的方法。即本發(fā)明涉及經(jīng)與基因組DNA同源重組而導入的方法，DNA序列通常不與內(nèi)源基因功能連接，并且(1)當將其在內(nèi)源基因上或其附近插入宿主基因組中時，用于改變(如激活)內(nèi)源基因的表達，并還有(2)允許選擇那些其中已激活的內(nèi)源基因被擴增的細胞。用于本發(fā)明的可擴增DNA序列包括，但不限于，編碼可選擇標志二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶的序列和CAD基因(編碼三功能性蛋白質(zhì)氨甲酰磷酸合酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和二氫乳清酸酶)。也可使用這些序列和其它可擴增序列的改良的變體。根據(jù)本發(fā)明的方法，將編碼可選擇標志的可擴增DNA序列和改變內(nèi)源基因表達的調(diào)節(jié)功能的DNA序列在細胞基因組的預選擇位點以與基因組DNA同源的DNA序列相聯(lián)系的方式導入初級、次級或永久化細胞內(nèi)。該預選擇的位點一般是在編碼治療性產(chǎn)物的基因之內(nèi)或其上游，或在一影響所需基因功能的位點上?？勺鳛閱我籇NA構(gòu)建體，或作為物理上成為連接在被轉(zhuǎn)染細胞的基因表達的分離的DNA序列，將改變內(nèi)源基因表達的DNA序列、編碼可選擇標志的可擴增序列和與基因組DNA中預選擇的位點同源的序列導入初級、次級或永久化細胞中。另外，可以線性、在其一個末端或兩末端有或沒有單股區(qū)域的雙股DNA將DNA導入，或以環(huán)形DNA將DNA導入。在將外源DNA導入細胞后，在適合于基因組DNA和被導入的DNA的一部分之間發(fā)生同源重組的條件下維持該細胞?；蚪MDNA與被導入DNA之間的同源重組導致同源重組體初級、次級或永久化細胞，在這些細胞中改變內(nèi)源基因表達的序列和編碼可選擇標志可擴增序列都被可操作地連接到編碼治療性產(chǎn)物的內(nèi)源基因上。在選擇編碼可選擇標志的擴增DNA的擴增條件下培養(yǎng)所得的同源組組體細胞，產(chǎn)生含有已擴增的可選擇標志和已改變了其表達的共擴增的內(nèi)源基因的細胞?？稍谶m于治療性蛋白質(zhì)的表達的條件下培養(yǎng)以此方法產(chǎn)生的細胞，從而在體外產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)，或可將細胞用于體內(nèi)傳送治療性蛋白質(zhì)(即基因治療)。
本發(fā)明還涉及將擊靶DNA序列導入細胞的基因組DNA中的方法，其中構(gòu)建體包含編碼產(chǎn)物的外源DNA、擊靶序列和可擴增的標志基因，這樣在整合到細胞的基因組中之后，細胞含有已擴增的編碼標志的DNA和共擴增的外源基因，其中這些細胞能夠表達已共擴增的外源基因。
DNA構(gòu)建體包括陽性可選擇標志，它可用于選擇含有該標志的已擴增拷貝的細胞。擴增這樣一個標志導致側(cè)接DNA序列的共擴增。在此實施方案中，構(gòu)建體組成的次序例如可以是擊靶序列-編碼可擴增的陽性可選擇標志的DNA-編碼第二個可選擇標志(如果有的話)的DNA-相當于在適當啟動子控制下待表達的外源基因的或在只有其定位以激活內(nèi)源基因的啟動子的DNA序列-擊靶DNA序列。
優(yōu)點本發(fā)明的方法學、DNA構(gòu)建體、細胞和所得蛋白質(zhì)具有多方面的功能和超過基因擊靶技術(shù)中目前所用方法的許多其它優(yōu)點。通過在從直接相鄰有用基因處(直接與正常基因的已轉(zhuǎn)錄區(qū)相融合)到內(nèi)源基因的被轉(zhuǎn)錄區(qū)上游30kb或更上游處，或在內(nèi)源基因的內(nèi)含子內(nèi)的不同位置定位外源調(diào)節(jié)序列，對于激活內(nèi)源基因的能力在細胞內(nèi)的基因表達方面是特別有利的。例如，它可用于將調(diào)節(jié)元件定位在通常靜止或?qū)蛴胸撜{(diào)節(jié)功能的區(qū)域的上游或下游。在這樣一個區(qū)域的上游或下游定位調(diào)節(jié)元件可消除這種通常抑制轉(zhuǎn)錄的主要負效果。另外，可使用本文所述的擊靶構(gòu)建體刪除通常抑制轉(zhuǎn)錄或?qū)虻谋磉_有另外的不利影響的DNA區(qū)域。
此外，因為已知啟動子功能在很大程度上取決于局部環(huán)境，所以為了找出那些適于功能發(fā)揮的局部環(huán)境而可以摸索寬范圍的定位。然而，因ATG起始密碼子頻繁地見于哺乳動物DNA中(大約每48個堿基對出現(xiàn)1個)，所以在基因上游的任何位置不能簡單地開始轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生在正確的ATG起始密碼子之前含有長前導序列的轉(zhuǎn)錄物，因為在這樣一個前導序列中頻繁出現(xiàn)ATG密碼子將妨礙正確基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)譯并使信息失效。因此，在含有調(diào)節(jié)區(qū)的擊靶構(gòu)建體內(nèi)摻入外源外顯子、拼接供體位點和可任選地，一種內(nèi)含子及拼接受體位點，可允許通過鑒定對于調(diào)節(jié)區(qū)域來說最佳化的位點來達到基因的最佳表達，而不必受到需要避免在所產(chǎn)生的mRNA表現(xiàn)不適當?shù)腁TG起始密碼子所施加的限制。這樣就為定位構(gòu)建體提供了顯然更大的靈活性并使之有可能激活更寬范圍的基因。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體例如在制造由重組體或外源序列及內(nèi)源序列編碼的融合體蛋白質(zhì)的方法中也是有用的。
上文所述的基因擊靶和擴增特別適用于改變形成轉(zhuǎn)錄單位的基因的表達(所說的轉(zhuǎn)錄單位足夠地大以致使它們難以分離和表達)，或適用于打開那些其中完整的蛋白質(zhì)編碼區(qū)不能得到或尚未被克隆的基因。因此，上述DNA構(gòu)建體適用于以一定方式將外源調(diào)節(jié)元件可操作地連接到內(nèi)源基因上，所說的方式在于可精確地限定轉(zhuǎn)錄單位，為外源調(diào)節(jié)元件和內(nèi)源基因的相對定位提供靈活性，最終使之能夠成為一個得到并調(diào)節(jié)治療上有價值的基因表達的高度控制的系統(tǒng)。
對實施例的解釋如本文所述，申請人已證明可將DNA導入細胞如初級、次級或永久化脊椎動物細胞中并可經(jīng)同源重組整合到被轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。他們已進一步表明，外源DNA在同源重組體(HR)細胞中具有預期的功能，并且可基于由適當?shù)陌蠨NA賦予的可檢測表型來鑒定正確的靶細胞。
申請人描述用以擊中人基因組中特定座位(HPRT座位)的質(zhì)粒的構(gòu)建，和基于藥物抗性表型的選擇(實施例1a)。該質(zhì)粒被定名為pE3Neo，它在HPRT座位整合到細胞基因組中產(chǎn)生具有hprt-，6-TG抗性表型并且還有G418抗性的細胞。如上所述，通過證明，被導入已建立的細胞系內(nèi)的DNA在HPRT基因的外顯子3內(nèi)的定位后，他們已表明在基因擊靶中pE3Neo可在已建立的人成纖維細胞系中適當?shù)匕l(fā)揮功能(實施例1b)。
另外，申請人證明可使用pE3Neo在初級和次級人皮膚成纖維細胞中進行基因擊靶(實施例1c)。本申請進一步證明對DNA末端的修飾可提高DNA進入基因組DNA的命中率(實施例1c和1e)。申請人還描述了以基因擊靶技術(shù)在預選的位點將基因插入細胞如初級、次級或永久化細胞的基因組中的方法(實施例1d)。
另外，本發(fā)明涉及使用被轉(zhuǎn)染的細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。該方法包括用編碼治療產(chǎn)物的外源DNA或用足以擊向編碼治療產(chǎn)物的內(nèi)源性基因的DNA而轉(zhuǎn)染細胞，如初級細胞、次級細胞或永久化細胞。例如，實施例1g、1h、1j、1k、2、3、4和6-9描述了通過用將改變內(nèi)源基因表達的DNA序列元件對選擇的內(nèi)源性基因擊靶以生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
申請人還描述了用于擴增已通過基因擊靶激活的內(nèi)源性細胞基因的DNA構(gòu)建體和方法(實施例3、6、8和9)。
實施例1f～1h、2、4和6描述了本發(fā)明的實施方案，其中改變?nèi)薊PO基因的上游正常調(diào)節(jié)序列，以允許在未被轉(zhuǎn)染狀態(tài)下不能以可檢測的量表達EPO的初級或次級成纖維細胞株中表達hEPO。在一個實施方案中，擊靶的產(chǎn)物保持了正常EPO蛋白質(zhì)完正，但須處在小鼠金屬硫因啟動子的控制之下。實施例1i和1j證明可使用相似的擊靶構(gòu)建體以激活初級或次級人成纖維細胞中的內(nèi)源性生長激素基因。在其它實施方案中描述了為激活人成纖維細胞中的EPO表達，擊靶過程的產(chǎn)物是嵌合的轉(zhuǎn)錄單位，其中人生長激素基因的第一個外顯子被定位在EPO外顯子2～5的上游。轉(zhuǎn)錄(受小鼠金屬硫因啟動子控制的)、拼接和轉(zhuǎn)譯的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，其中hEPO信號肽的氨基酸1～4被hGH的氨基酸殘基1-3取代。該蛋白質(zhì)的嵌合部分、信號肽在從細胞中分泌之前被除去。實施例5描述了用以生產(chǎn)將基因(有內(nèi)含子)轉(zhuǎn)化成該基因的可表達cDNA拷貝(無內(nèi)含子)，以及在微生物(如酵母或細菌)細胞中回收這些可表達cDNA分子的擊靶構(gòu)建體和方法。實施例6描述了對其中的hhfr基因已被擴增的細胞進行雙重選擇和選擇的，定名為pREPO4的擊靶載體的構(gòu)建。質(zhì)粒pREPO4已被用于在通過同源重組激活內(nèi)源性hEPO基因后在HT 1080細胞(一種永久化人細胞系)中擴增人EPO(hEPO)座位。如前所述，在含氨甲喋呤培養(yǎng)基中分步選擇可使對0.4μM氨甲喋呤有抗性的細胞中的hEPO生產(chǎn)量增加70倍。
實施例7和8描述了在正常EPO啟動子的上游插入調(diào)節(jié)序列的方法及使用這樣的構(gòu)建體生產(chǎn)EPO的方法。另外，實施例8描述了擴增按實施例7的方法生產(chǎn)的靶EPO基因的方法。實施例9描述了擊靶人α干擾素、GM-CSF、G-CSF和FSHβ基因以產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細胞的方法。
實施例提供了通過基因擊靶以激活或激活并擴增內(nèi)源基因的方法，其中不需要操作或另外使用靶基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。使用本文教導的方法和DNA構(gòu)建體或質(zhì)?；蚱鋵Ρ绢I域普通技術(shù)人員來說顯而易見的修飾形式，可以改變期望具有體外蛋白質(zhì)生產(chǎn)的特性(如生產(chǎn)藥物)，或具有適于體內(nèi)蛋白質(zhì)傳送方法(如基因治療)的特征的細胞中的基因表達。圖5和6圖解說明轉(zhuǎn)錄上激活hEPO基因的兩種方案。
使用本文公開的方法和DNA構(gòu)建體或質(zhì)?；蚱鋵τ诒绢I域普通技術(shù)人員來說顯而易見的修飾形式，可在預選定的位點將編碼治療性產(chǎn)物(如蛋白質(zhì)、核糖酶、反義RNA)的外源DNA插入脊椎動物(如人和非人哺乳動物)初級或次級細胞的基因細胞中。
現(xiàn)將借助下列實施例說明本發(fā)明，但這些實施例并不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例實施例1通過基因擊靶生產(chǎn)被轉(zhuǎn)染的細胞株當通過同源重組將轉(zhuǎn)染DNA整合到或部分置換染色體DNA序列時發(fā)生基因擊靶。雖然這種情況可能發(fā)生在任何特定轉(zhuǎn)染實驗的過程中，但它們通常被過多的由非同源的或不合理的重組過程所引起的質(zhì)粒DNA整合所掩飾。
a.用于選擇人細胞中基因擊靶的構(gòu)建體的產(chǎn)生選擇擊靶后果的一種方法是通過遺傳選擇由于轉(zhuǎn)染DNA的整合所導致的基因功能喪失。人HPRT座位編碼次黃嘌呤-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶?？筛鶕?jù)在含有核苷類似物6-硫基鳥嘌呤(6-TG)的培養(yǎng)基中生長情況選擇hprt-細胞帶有野生型(HPRT+)等位基因的細胞被6-TG殺死，而帶有突變體(hprt-)等位基因的細胞可以存活。因此可在6-TG培養(yǎng)基中選擇包藏破壞HPRT基因功能的靶目標的細胞。
為了構(gòu)建擊中HPRT座位的質(zhì)粒，將HPRT序列(Genedank名稱HUMHPRTB；Edwards，A.et al.，Genomics 6593-608(1990))中從位置11,960～18,869延伸的并包括HPRT基因的外顯子2和3的6.9 kbHindIII片段亞克隆到pUC12的HindIII位點中。在HPRT基因片段的外顯子3中的唯一XhoI位點上切割所得克隆并插入含有來自pMClNeo(Stratagene)的neo基因的1.1 kb SalI-XhoI片段，破壞外顯子3的編碼序列。選擇一個具有與HPRT轉(zhuǎn)錄相反的neo轉(zhuǎn)錄方向的定向者并命名為pE3Neo。用neo破壞的變體取代正常HPRT外顯子3將產(chǎn)生hprt-，6-TG抗性表型。這樣的細胞也將是G418抗性的。
b.在已建立的人成纖維細胞系中的基因擊靶作為在永久化細胞系中擊靶的證據(jù)，并確定在基因擊靶中pE3Neo適當發(fā)揮功能，通過電穿孔法用pE3Neo轉(zhuǎn)染人纖維肉瘤細胞系HT 1080(ATCC CCL 121)。
在電穿孔前將HT 1080細胞維持在添加有HAT(次黃嘌呤/氨基蝶呤/黃嘌呤)的含15％小牛血清DMEM(Hyclone)中。電穿孔前兩天將細胞轉(zhuǎn)移到無氨基蝶呤的同一培養(yǎng)基中。用胰酶消化指數(shù)生長細胞并在DMEM/15％小牛血清中稀釋，離心，并以每毫升13.3×106細胞的細胞終體積重新懸浮在PBS(磷酸緩沖鹽水)中。用HindIII消化pENeo，將8 kb HPRT-neo片段與PUC 12主鏈分離，經(jīng)苯酚提取的乙醇沉淀進行純化，并以600μg/ml的濃度重新懸浮。取50 ml(30μg)連同750μl細胞懸液(10×106細胞)加到電穿孔小池(0.4cm電極間距，Bio-Rad Laboratories)內(nèi)。電穿孔條件為450伏，250微法(Bio-Rad Gene Pulser；Bio-Rad Laboratories)。將小池內(nèi)容物立即加到含15％小牛血清的DMEM中得到每25ml培養(yǎng)基含1×106細胞的細胞懸液。將25ml經(jīng)處理的細胞懸液鋪敷在150mm直徑組織培養(yǎng)皿中并在37℃含5％CO2環(huán)境中保溫。24小時后，將G418溶液直接加到平皿上，得到終濃度為800μg/ml的G418。5天后，用DMEM/15％小牛血清/800μg/ml G418替換培養(yǎng)基。電穿孔后9天，用DMEM/15％小牛血清/800μg/ml G418和10μm 6-硫基鳥嘌呤替換培養(yǎng)基。開始雙重選擇后14～16天使用克隆圓柱采集對G418和6-TG有抗性的集落。
在HT 1080細胞中進行的5次有代表性擊靶實驗的結(jié)果示于表1中。
表1轉(zhuǎn)染處理細胞的數(shù)目G418r和6-TGr克隆的數(shù)目1 1×107322 1×107283 1×107244 1×107325 1×10766
對于轉(zhuǎn)染實驗5，設計以確定G418r集落的總得率的對照平皿表明可從最初1×107個被處理的細胞產(chǎn)生33,700個G418r集落。因此，被擊中者對未被擊中者的比例為66/37,700或1∶510。將5次實驗合并計算，發(fā)生擊中者的頻率為3.6×106，或占被處理細胞的0.00036％。
限制性酶和使用衍生于neo和HPRT基因的探針進行的Southern雜交實驗將neo基因定位到HPRT外顯子內(nèi)，予定位點的HPRT座位。
c.在初級和次級人皮膚成纖維細胞內(nèi)基因擊靶用HindIII消化pE3Neo，從pUC12主鏈中分離8 kb HPRT-neo片段，并經(jīng)苯酚提取和乙醇沉淀純化。以2mg/ml的濃度重新懸浮DNA。用100μg HindIII pE3Neo(50μl)，在250伏和960微法條件下對體積為0.5ml的3×106個次級人包皮成纖維細胞進行電穿孔。對總共9×106個被處理的細胞進行三次分開的轉(zhuǎn)染。加工處理并選擇G418抗性細胞。每150mm培養(yǎng)皿中鋪敷500,000個細胞進行G418選擇。選擇下培養(yǎng)10天后，將培養(yǎng)基換成含有400μg/ml G418和10μM 6-TG的人成纖維細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基。結(jié)合使用兩種藥物再繼續(xù)選擇10天。顯微鏡下檢查平皿，以定位對兩種藥物均有抗性的人成纖維細胞集落。G418rt-TGr集落部分為每9×106個處理的細胞有4個集落。這些集落占所有能形成集落的細胞的0.0001％(或者百萬分之一)。設計確定G418r集落的總產(chǎn)率的對照平皿表明可從初始9×106個處理的細胞產(chǎn)生2,850個G418r集落。因此，中靶的對未中靶的比例為4/2,850或1比712。用限制性酶和衍生于neo及HPRT基因的探針進行Southern雜交實驗，確定neo基因定位到HPRT外顯子3內(nèi)預定的位點的HPRT座位，并證明擊靶發(fā)生在這四個克隆細胞株中。也已通過轉(zhuǎn)染初級細胞(1/3.0×107)分離對兩種藥物有抗性的集落。
這些pE3Neo擊靶實驗的結(jié)果綜述于表2中。直接轉(zhuǎn)染或用核酸外切酶III處理HindIII消化的pE3Neo以在轉(zhuǎn)染前產(chǎn)生5′單股突出部分(見實施例1c)。試驗帶有長度從175到930堿基對的單股區(qū)域的DNA制劑。使用只經(jīng)HindIII消化的pE3neo，通過限制性切酶和Sou-thern雜交分析法根據(jù)具有在HPRT座位上中靶插入的neo基因而鑒定出1/799 G418抗性集落(共分離到24個中靶克隆)。當使用175 bp突出部分時擊靶受到最大程度的刺激(約10倍刺激)，1/80的G418r集落顯示出對于在HPRT處擊靶有探查作用的限制性片段(共分離出9個中靶克隆)。因此，使用本文所述的條件和重組DNA構(gòu)建體，很容易地觀察到在正常人成纖維細胞中的擊靶，并且通過用含單股突出尾部的擊靶，按實施例1e中所述方法轉(zhuǎn)染，能刺激總的擊靶頻率(中靶克隆數(shù)除以被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染為G418抗性的克隆的總數(shù))。
表2在人成纖維細胞中對HPRT座位擊靶PE3neo處理實驗數(shù)目 每個G418r克隆的中靶數(shù) 中靶克隆總數(shù)HindIII消化 6 1/79924175 bp突出部分 1 1/80 9350 bp突出部分 3 1/11720930 bp突出部分 1 1/1441d.用于將治療有用的基因靶向插入人基因組內(nèi)的構(gòu)建體的產(chǎn)生和其在基因擊靶中的應用可使用其中在相鄰或接近于neo基因處將治療有用的基因插入HPRT編碼區(qū)中的pE3Neo的變異體，以將治療有用的基因定點導向受體初級或次級細胞基因組中的特定位置?？梢詷?gòu)建這種將hGH基因擊向HPRT座位的pE3Neo的變異體。
用EcoRT消化pXGH5(圖示于圖3中)，并分離含有hGH基因并連接小鼠金屬硫因(mMT)啟動子的4.1 kb片段。用來自大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段填充EcoRI突出部分。單獨地用在neo片段和HPRT外顯子3的接合處(插入外顯子3中的3′接合處)進行切割的XhoI消化pE3Neo。用來自大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段充填線性化質(zhì)粒的XhoI突出末端，并將所得片段連接到4.1 kb平頭末端hGH-mMT片段上。用限制性酶分析hGH-mMT片段上的單一拷貝插入，以篩選從連接反應混合物衍生的細菌集落，選擇出hGH基因轉(zhuǎn)錄與neo基因方向相同的定位并定名為pE3Neo/hGH。用HindIII消化pE3Neo/hGH，釋放出含有HPRT、neo和mMt-hGH序列的12.1 kb片段。按實施例1c中所述處理經(jīng)消化的DNA并轉(zhuǎn)染到初級或次級人成纖維細胞中。按實施例1c中所述方法選擇G418rTGr集落并分析mMT-hGH和neo序列在HPRT基因中的定靶插入。使用商品免疫檢測藥盒(Nichols Instit-ute)分析單個集落的hGH表達。
用pE3Neo/hGH轉(zhuǎn)染次級人成纖維細胞，分析巰基鳥嘌呤抗性集落的穩(wěn)定hGH表達，并對其進行限制性酶和Southern雜交分析。在所分析的13個TGr集落中，鑒定出8個有hGH基因插入到內(nèi)源性HPRT座位中的集落。所有8個菌株均穩(wěn)定地表達了顯著量的hGH，平均表達水平為22.7μg/106細胞/24小時。另外，也可將圖4所示的質(zhì)粒pE3neo EPO用于將EPO基因定靶導向人HPRT座位。
使用同源重組將治療上有用的基因定靶導向細胞基因組DNA中的特定位置，這一技術(shù)可以擴大并使之更適用于通過插入基因的生產(chǎn)治療目的的產(chǎn)品(如藥物、基因治療)，通過向細胞內(nèi)插入基因使細胞暴露于適當?shù)乃幬镞x擇環(huán)境條件下而選擇含有已擴增的該基因拷貝的細胞。例如，可在直接相鄰于pE3neo/hGH中hGH或neo基因的位置插入dhfr、ada或CAD基因，從而修飾pE3neo/hGH(實施例1d)。可用這樣一個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染初級、次級或永久化細胞并鑒定正確的定靶插入結(jié)果。進一步用漸增濃度的適于選擇含擴增基因的細胞的藥物處理這些細胞(對dhfr的選擇劑是氨甲喋呤，對CAD的選擇劑是N-(磷酸乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)、對ada的選擇劑是腺嘌呤核苷(如硝基羥基丙氨酸))。治療上有用的基因的整合將連同其擴增的拷貝得以被選擇的基因一起以這種方式被共擴增。因此，可以很容易地通過預選擇特定位點來控制細胞的遺傳工程，以生產(chǎn)治療用的基因，其中擊靶構(gòu)建體在所說的位點整合到細胞基因組中并且擴增的拷貝在該位點處保存在已擴增的細胞內(nèi)。
e.修飾DNA末端以提高擊靶效率有幾方面的證據(jù)表明3′突出的末端參予大腸桿菌、噬菌體、啤酒酵母和爪蟾的某些同源重組途徑。在爪蟾卵細胞中，帶有長度達幾百個堿基對的3′突出末端的分子在微量注射后要比帶有經(jīng)限制酶消化后產(chǎn)生的很短突出末端(4 bp)的分子更為迅速地與相似處理過的分子發(fā)生重組。在酵母中，長度達幾百個堿基對的3′突出末端的產(chǎn)生似乎是減數(shù)分裂重組中的限速步驟。尚未見報導在人細胞的重組中有3′突出末端參與的證據(jù)，并且沒有表示有任何類型的已被修飾的DNA底物可在任何種屬中促進擊靶(同源重組的一種形式)的情況。下列實施例和實施例1c中描述的實驗提示，5′突出的末端對于刺激初級、次級和永久化人成纖維細胞中的擊靶是有效的。
還沒有關(guān)于通過修飾轉(zhuǎn)染DNA分子的末端提高擊靶效率的報導。本實施例旨在說明通過將雙股形式的分子的末端轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂尚问蕉鴮€性DNA分子的末端進行修飾，可刺激向初級和次級人成纖維細胞內(nèi)基因組的擊靶插入。
用HindIII消化1100μg質(zhì)粒pE3Neo(實施例1a)?？稍诒椒犹崛『鸵掖汲恋砗笾苯邮褂迷揇NA，或者可用凝膠電泳法從pUC12載體序列中分離出只含有HPRT和neo基因的8 kb HindIII片段。用ExoIII消化已用HindIII消化過的DNA，導致在起始于各游離3′末端的廣泛的核酸外切水解消化并產(chǎn)生5′突出的末端。因此可通過改變ExoIII消化的時間來控制核酸外切消化作用的程度和所得5′突出端的長度。按照供應商推薦的條件用ExoIII將100μg業(yè)經(jīng)HindIII消化的pE3Neo消化30秒鐘、1分鐘、1.5分鐘、2分鐘、2.5分鐘、3分鐘、3.5分鐘、4分鐘、4.5分鐘和5分鐘。為了監(jiān)測消化的程度，在供應商推薦的條件下，用綠豆(mung bean)核酸酶(Promega)處理各時間點上含1μg ExoIII處理的DNA的等分樣品，并經(jīng)凝膠電泳分離樣品。檢測未處理的、HindIII消化的pE3Neo和用ExoIII與綠豆核酸酶處理的同樣分子間在大小上的差異。這一大小差值除以2得到分子各末端5′突出部分的平均長度。在上述時間點，并于30℃消化，所產(chǎn)生的5′突出部分長度范圍應為100至1,000堿基。
純化各時間點上得到的60μg ExoIII處理的DNA(pE3Neo的總HindIII消化產(chǎn)物)，并在實施例1c所述條件下將其電穿孔到初級、次級和永久化人成纖維細胞中。計算G418r6-TGr集落的數(shù)并將這些數(shù)目與未用ExoIII處理的HindIII消化的pE3Neo進行的擊靶相比較，從而定量分析各ExoIII處理的制劑提高的擊靶程度。
也可使用類似系統(tǒng)定量3′突出末端的效果。在這種情況下，在供應商推薦的條件下，用噬菌體T7基因6核酸外切酶(Vuited Stat-es Biochemicals)以不同時間間隔處理HindIII消化的pE3Neo。消化程序(每個末端產(chǎn)生的3′突出部分的平均長度)的確定和電穿孔條件與上述ExoIII處理的DNA相同。計算G418r6-TGr集落的數(shù)目并與那些未經(jīng)T7基因6核酸外切酶處理的HindIII消化的pE3Neo擊靶的集落數(shù)目相比較，以定量由各T7基因6核酸外切酶處理的制劑提高的發(fā)生擊靶的程度。
產(chǎn)生5′和3′突出末端的其它方法是可行的，例如，兩個彼此部分交疊的線性分子變性并退火將產(chǎn)生分子的混合物，各分子在兩末端有3′突出部分或在兩末端有5′突出部分，以及不能與起始線性分子區(qū)分的再退火的片段。根據(jù)兩DNA片段間非共用的DNA的長度確定突出部分的長度。
f.用于將處在小鼠金屬硫因啟動子控制下的人促紅細胞生成素基因放入初級、次級和永久化人成纖維細胞中的擊靶質(zhì)粒的構(gòu)建下述實施例用以說明本發(fā)明的一個實施方案，其中人促紅細胞生成素(hEPO)基因上游的正常陽性和陰性調(diào)節(jié)序列被改變，以允許在原來不以顯著量表達hEPO的初級、次級或永久化人成纖維細胞中表達人促紅細胞生成素。
可用PCR方法擴增單獨地位于人EPO編碼區(qū)上游的區(qū)域。在分析已公開的人EPO序列[Genbank命名HUMERPA；Lin，F(xiàn)-K，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 827580-7584(1985)]后設計三組用于這一目的的引物。這些引物對能夠擴增609、603或509 bp的片段。
表3HUMERPA引物位置序列 片段大小F1 2→20 5′AGCTTCTGGGCTTCCAGAC(SEQ ID NO 1)R2 610→595 5′GGGGTCCCTCAGCGAC 609 bp(SEQ ID NO 2)F2 8→24 5′TGGGCTTCCAGACCCAG(SEQ ID NO 3)R2 610→595 5′GGGGTCCCTCAGCGAC 603 bpF3 21→405′CCAGCTACTTTGCGGAACTC(SEQ ID NO 4)R2 610→595 5′GGGGTCCCTCAGCGAC 590 bp這三個片段基本上交疊并且為本目的可以相互改變。將從相對于轉(zhuǎn)譯起始位點的-623位延伸到-14位的609 bp片段(HUMERPA核苷酸位置2至610)在兩末端用ClaI銜接物連接。用ClaI消化所得的ClaI連接的片段，并將其插入到pBluescriptII SK/+(Stratagene)的ClaI位點中，其方向是使HUMERPA核苷酸位置610與質(zhì)粒多銜接物中的SalI位點相鄰?？煞謩e在人EPO上游片段中的特有FspI或SfiI位點(HUMERPA核苷酸位置分別是150和405)處切割該質(zhì)粒p5′EPO，并將其連接到小鼠金屬硫因啟動子上。一般來自mMT-I基因的1.8kb EcoRI-BglII片段[不含mMT編碼序列；Hamer，D.H.and WallingM.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982)；也可使用由分析得自Genbank(即MUSMTI、MUSMTIP、MUSMTIPRM)的mMT序列所設計的PCR引物，按已知方法從小鼠基因組DNA中分離該片段]可用已知方法將其修成平頭并與SfiI消化的(也修成平頭)或FspI消化的p5′EPO相連接。分析所得克隆的方向并將其中前者mMT BglII位點靠近質(zhì)粒多銜接物內(nèi)SalI位點的那些用于擊靶導入初級和次級人成纖維細胞中。該定向指導mMT向最終構(gòu)建物中HUMERPA核苷酸位置610轉(zhuǎn)錄。所得到的用于將mMT插入FspI和SfiI位點的質(zhì)粒分別稱為p5′EPO-mMTF和p5′EPO-mMTS。
在希望修飾、刪除和/或置換負調(diào)節(jié)元件或位于初始靶序列的上游的增強子的情況下，附加上游序列是有用的。在EPO的情況下，可以刪除抑制EPO在肝外和腎外組織中表達的負調(diào)節(jié)元件(Semenza，G.L.et.al.，Mol.Cell.Biol.10930-938(1990))。制備6 kb片段內(nèi)的一系列缺失序列?？捎糜袑挼乃拗骷毎钚缘脑鰪娮?如來自細胞巨大病毒(CMV)的增強子)置換缺失的區(qū)域。
因為HUMERPA序列是在其5′末端位于BamHI(遠端)和HindIII(近端)位點的之后，從而可選擇pBluescriptIISK/+載體中609bp 5′EPO片段的方向。因此，可用已知方法從基因組DNA中分離正常位于609 bp片段上游的6 bp BamHI-HindIII片段(Semenza，G.L.et.al.，Mol.Cell.Biol.10930-938(1990))。例如，可用609 bpPCR擴增的片段作為探針篩選噬菌體、柯氏質(zhì)?；蚪湍溉斯と旧w文庫。所需的克隆將具有一個6 kb BamHI-HindIII片段，并可通過將其限制性酶切圖與用已知方法測定的人EPO基因周圍的限制性酶切圖比較可證實其同一性。另外，也可使用609 bp片段作為探針制作EPO基因的人基因組上游的限制性酶切圖，以鑒定產(chǎn)生來源于HUMERPA等同物2和609之間并延伸過上游BamHI位點的片段的酶；可用凝膠電泳法從人基因組DNA的適當消化產(chǎn)物中分離該片段，并連接到細菌或酵母克隆載體中。正確的克隆將與609 bp 5′EPO探針雜交并含有一個6 kb BamHI-HindIII片段。將分離的6 kb片段在以適當方向插入p5′EPO、p5′EPO-mMTF或p5′EPO-mMTS中(這樣HindIII位點相鄰于HUMERPA核苷酸位置2)?？墒褂萌旧w行走技術(shù)等已知方法或分離與609 bp 5′EPO探針雜交的酵母人工染色體來分離附加的上游序列。
上述克隆方法將允許EPO的序列上游得以體外修飾，以進行繼后對初級、次級或永久化人成纖維細胞的定靶轉(zhuǎn)染。這些方法述及mMT啟動子的簡單插入，以及負調(diào)節(jié)區(qū)的缺失、以及負調(diào)節(jié)區(qū)的缺失和用具有廣泛宿主細胞活性的增強子進行的置換。
g.激活人EPO基因和用篩選法分離靶初級、次級及永久化人成纖維細胞為了擊靶，用從質(zhì)粒主鍵中游離出插入段的限制性酶切割質(zhì)粒。在切割p5′EPO-mMTS時，HindIII和SalI消化釋放出2.4 kb的擊靶片段，該片段包括通過將用于使該構(gòu)建體靶向人EPO基因的調(diào)節(jié)區(qū)的DNA的405 bp和204堿基對分別連結(jié)到5′和3′側(cè)的1.8 kb mMT啟動子。用苯酚提取并用乙醇沉淀純化該DNA或2.4 kb單一擊靶片段并在實施例1c中所述條件下轉(zhuǎn)染到初級或次級人成纖維細胞中。將轉(zhuǎn)染的細胞鋪敷在人成纖維細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基的150mm平皿中。48小時后將細胞以10,000細胞/cm2的密度鋪敷到24孔平皿中(每孔約20,000個細胞；如果擊靶發(fā)生率為每106個可克隆細胞中有一個(實施例1c)，則需要檢測50個孔以分離出單一的表達集落)。其中轉(zhuǎn)染DNA已擊中人EPO基因的同源區(qū)域上游的細胞將在mMT啟動子的控制下表達hEPO。10天后，使用市場上可得到的免疫試驗藥盒(Amgen)檢測整個孔上清液中的EPO表達水平。使用已知方法分離出得自表現(xiàn)有hEPO合成的孔內(nèi)的細胞克隆，一般通過檢測分配到各孔或平皿中的異源細胞群體的各部分、檢測這些陽性孔的各部分并在必要時重復進行，通過篩選以每孔1個細胞接種的96孔微滴定板而最后分離中靶集落。也可以使用結(jié)合位于HUMERPA核苷酸位置1上游的引物的mMT特異性引物通過PCR以擴增片段而分析得自整個平板溶胞產(chǎn)物的DNA。該引物對應能擴增基于該DNA序列精確預測了大小的DNA片段。用胰蛋白酶消化陽性平板并以相繼減低的稀釋度重新鋪板，如需要分離中靶細胞重復進行DNA制備和PCR步驟。
也可使用本文所述的擊靶方案激活永久化人細胞(如HT 1080細胞(ATCC CCL 121)、Hela細胞和HeLa細胞的衍生株(ATCC CCL 2、2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC HBT 22)、K-562白血病細胞(ATCC CCL 232)、KB癌細胞(ATCC CCL 17)、2780 AD卵巢癌細胞(Van der Blick，A.M.etal.，Cancer Res.485927-5932(1988))、Raji細胞(ATCC CCL 86)、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)、Namalwa細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240)、Daudi細胞(ATCCCCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U-937細胞(ATCC CRL1593)、Bowes黑素瘤細胞(ATCC CRL 9607)、MI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)和各種異雜交瘤細胞)中的hGH表達以生產(chǎn)用于通常藥物傳送的hGH的目的。
h.激活人EPO基因并使用陽性或結(jié)合的陽性/陰性選擇系統(tǒng)分離中靶的初級、次級和永久化人成纖維細胞構(gòu)建p5′EPO-mMTF、p5′EPO-mMTS以及它們的帶有附加上游6 kbBamHI-HindIII片段的衍生物的策略可接著進行在相鄰mMT啟動子處插入neo基因這一附加步驟。另外，可在pBluescriptIISK/+多接頭中HUMERPA序列相鄰處插入一個陰性選擇標志如gpt(來自pMSG(Pharmacia)或其它適當來源)。在前一種情況下，經(jīng)PCR擴增或限制性酶與Southern雜交分析從集落收集物中制得的DNA來分離并篩選G418r集落，以鑒定中靶集落。在后一種情況下，將G418r集落鋪敷在含6-巰基黃嘌呤的培養(yǎng)基中以對照選擇gpt基因的整合(Besna-rd，C.et al.，Mol.Cell.Biol.74139-4141(1987))。另外，可將HSV-TK基因放在插入段如gpt的相反側(cè)面，以允許通過在含有400μg/ml G418、100μM 6-巰基黃嘌呤和25μg/ml gancyclovir的人成纖維細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來選擇neo并阻止gpt和TK。雙重陰性選擇將對真實中靶后果提供幾乎絕對地選擇，并且Southern印跡分析將提供最后的證實。
為生產(chǎn)適于常規(guī)藥物傳送的hEPO，也可使用本文所述的擊靶方案以激活在永久化人細胞(如HT 1080細胞(ATCC CCL 121)、Hela細胞和HeLa細胞的衍生株(ATCC CCL 2、2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌細胞(ATCC HBT 22)、K-562白血病細胞(ATCC CCL 232)、KB癌細胞(ATCC CCL 17)、2780 AD卵巢癌細胞(Van der Blick，A.M.et al.，Cancer Res.485927-5932(1988))、Raji細胞(ATCC CCL 86)、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)、Namalwa細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240)、Daudi細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U-937細胞(ATCC CRL 1593)、Bowes黑素瘤細胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)和各種異雜交瘤細胞)中的hGH表達。
i.用于將人生長激素放在初級、次級或永久化人成纖維細胞中在小鼠金屬硫因啟動子控制下的擊靶質(zhì)粒的構(gòu)建下列實施例用于說明本發(fā)明的一個實施方案，其中人生長激素的正常序列上游被改變，以允許在初級、次級或永久化人成纖維細胞中表達人生長激素。
使用衍生于人生長激素N基因的5′末端的已克隆DNA片段產(chǎn)生用于擊中EPO基因調(diào)節(jié)區(qū)的，與實施例1f中所述者相似的擊靶分子。使用基于分析該區(qū)域中的HUMGHCSA序列而設計的PCR引物以擴增跨越HUMGHCSA(Genbank Entry)核昔酸位置3787-5432(兩個產(chǎn)生方便地確定了大小的片段的EcoRI位點的位置，所說的片段可用于克隆或鑒定性消化包括該片段的亞克隆)的約1.8 kb片段。該區(qū)域從hGH基因N內(nèi)含子1的中部延伸到轉(zhuǎn)譯起始位點5′端的約1.4 kb的上游位置。用EcoRI和BamHI消化pUC12，用KLenow處理以產(chǎn)生平頭末端，并在稀釋液條件下重新環(huán)化，得到已失去EcoRI和BamHI位點的質(zhì)粒。該質(zhì)粒被稱為pUC12XEB。將HindIII接頭連接到擴增的hGH片段上并用HindIII消化所得片段，再連接到HindIII消化的pUC12XEB上。用EcoRI和BamHI消化所得質(zhì)粒pUC12XEB-5′hGH，以除去位于緊接hGH轉(zhuǎn)錄起始位點的上游的0.5 kb片段。將消化的DNA連接到來自mMT-I基因的1.8 kb EcoRI-BglI片段上[不含mMT編碼序列；Hamer，D.H.and Walling，M.，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982)；也可使用根據(jù)分析得自Genbank的mMT序列即MUSMTI、MUSMTIP、MUSMTIPRM而設計的PCR引物，按已知方法從小鼠基因組DNA中分離該片段]。該質(zhì)粒p5′hGH-mMT具有連接到靠近上游hGH序列兩側(cè)上的mMT啟動子。
上述克隆策略可使hGH的序列上游在體外得以修飾，以便繼后定靶轉(zhuǎn)染初級、次級或永久化人成纖維細胞。該策略描述了mMT啟動子的簡單插入。也可予見到其它一些策略，例如將具有廣泛宿主細胞特異性的增強子插入到已插入的mMT序列的上游。
j.激活人hGH基因并以篩選方法分離被擊中的初級、次級和永久化人成纖維細胞為了擊靶，使用從質(zhì)粒主鏈中游離出插入段的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒。在切割p5′hGH-mMT時，HindIII消化釋放出2.9 kb的靶片段，該片段由借助使該構(gòu)建體擊中hGH基因的調(diào)節(jié)區(qū)的DNA側(cè)接在5′和3′側(cè)上的1.8 kb mMT啟動子組成。用苯酚提取和乙醇沉淀法純化該DNA或單獨的2.9 kb擊靶片段，并在實施例11中所述的條件下轉(zhuǎn)染到初級或次級人成纖維細胞中。將被轉(zhuǎn)染的細胞鋪敷在含人成纖維細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基的150mm平皿中。48小時后，將細胞以10,000細胞/cm2的密度鋪敷到24孔皿中(每孔約20,000個細胞；如果擊靶發(fā)生的比例為每106個可隆細胞中有1個(實施例1c)，則為分離單一的表達集落需要檢測大約50個孔)。其中轉(zhuǎn)染DNA已擊中hGH的同源區(qū)上游的細胞將在mMT啟動子控制下表達hGH。10天后，使用可從市場購得的免疫檢測藥盒(Nichols)檢測整個孔的上清液以確定hGH表達水平。使用已知方法從孔中分離表現(xiàn)有hGH合成的克隆，通常是通過檢測分配到單一孔或平板中細胞的異源群體的各部分，檢測這些陽性孔的各部分，并在必要時重復進行上述步驟，最終通過篩選以每孔1個細胞接種的96孔微滴定板而分離中靶集落。也可以使用mMT特異性引物并結(jié)合使用位于HUMGHCSA核苷酸位置5,432的下游的引物，通過擴增DNA片段的PCR方法分析得自整個平板溶胞產(chǎn)物的DNA。該引物對應能擴增基于該DNA序列的精確預測了大小的DNA片段。用胰蛋白酶消化陽性平板并以依次降低的稀釋度重新鋪板，必要時重復DNA制備和PCR步驟以分離中靶細胞。
為生產(chǎn)常規(guī)藥物傳送的hGH的目的，本文所述的擊靶方案也可用于激活hGH在永久化細胞(如HT 1080細胞(ATCC CCL 121)、HeLa細胞和HeLa細胞的衍生株(ATCC CCL 2、2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌(ATCC HBT 22)、K-562白血病細胞(ATCC CCL 232)、KB癌細胞(ATCC CCL 17)、2780 AD卵巢癌細胞(Van dar Blick，A.M.et al.，Cancer Res.，485927-5932(1988))，Raji細胞(ATCC CCL 86)、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)、Namalwa細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240)、Daudi細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U-937細胞(ATCC CRL 1593)、Bowes黑素瘤細胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)和各種異雜交瘤細胞)中的表達。
k.激活人hGH基因并使用陽性或結(jié)合的陽性/陰性選擇系統(tǒng)分離擊中的初級、次級和永久化人成纖維細胞構(gòu)建p5′hGH-mMT的策略可在其后進行將neo基因插入相鄰mMT啟動子處的這一附加步驟。另外，可在pUC12多接頭中相鄰HUMGHCSA序列處插入一個陰性選擇標志如gpt(得自pMSG(pharmacia)或另外適當來源)。在前一種情況下，通過PCR擴增或限制性酶與Sout-hern雜交分析從集落收集物制得的DNA來分離和篩選G418r集落，以鑒定中靶集落。在后一種情況下，將G418r集落放在含有巰基黃嘌呤的培養(yǎng)基中以對照選擇gpr基因的整合(Besmard，C.et al.，Mol.Cell.Biol.，74139-4141(1987))。另外，可將HSV-TK基因放在插入段如gpt的相反例面，以允許通過在含有400μg/ml G418、100μm 6-巰基黃嘌呤和25μg/ml gancyclovir的人成纖維細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來選擇neo并阻止gpt和TK。雙重陰性選擇將對真正的中靶后果提供幾乎絕對地選擇。Southern雜交分析則是證實性的。
為生產(chǎn)適于常規(guī)藥物傳送的hGH，也可使用本文所述的擊靶方案激活永久化人細胞(如HT 1080細胞(ATCC CCL 121)、HeLa細胞和HeLa細胞的衍生株(ATCC CCL 2、2.1和2.2)、MCF-7乳腺癌(ATCCHBT 22)、K-562白血病細胞(ATCC CCL 232)、KB癌細胞(ATCC CCL17)、2780 AD卵巢癌細胞(Van dar Blick，A.M.et al.，CancerRes.，485927-5932(1988))，Raji細胞(ATCC CCL 86)、Jurkat細胞(ATCC TIB 152)、Namalwa細胞(ATCC CRL 1432)、HL-60細胞(ATCC CCL 240)、Daudi細胞(ATCC CCL 213)、RPMI 8226細胞(ATCC CCL 155)、U-937細胞(ATCC CRL 1593)、Bowes黑素瘤細胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC CLL 75.1)、MOLT-4細胞(ATCC CRL 1582)及各種異雜交瘤細胞)中的hGH表達。
可以修飾實施例1f和1i中所描述的及實施例1g、1h、1j和1k中使用的擊靶構(gòu)建體，以使之包含用于選擇其中被激活的內(nèi)源基因和可擴增性可選擇標志均被擴增的細胞的可擴增性可選擇標志(如ada、dhfr或CAD)。可使用這些表達或能夠表達編碼治療性產(chǎn)品的內(nèi)源性基因的細胞以生產(chǎn)用于常規(guī)藥物傳送或基因治療的蛋白質(zhì)(如hGH和hEPO)。
1.以電穿孔法用外源DNA和可選擇性標志基因轉(zhuǎn)染初級和次級成纖維細胞用胰蛋白酶消化并用營養(yǎng)培養(yǎng)基從塑料表面上淋洗下指數(shù)生長或早期靜止期的成纖維細胞。取出一等分的細胞懸浮液進行計數(shù)，對剩余細胞進行離心。吸出上清液并將細胞團塊重新懸浮在5ml電穿孔緩沖液(20mM HEPES pH 7.3，137mM NaCL，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM右旋糖)中。再次離心細胞，吸出上清液，將細胞重新懸浮在含有1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白的電穿孔緩沖液中。最后的細胞懸液含有約3×106細胞/ml。重新懸浮后應立即進行電穿孔。
向帶有0.4cm電極間距的無菌小池(Bio-Rad)內(nèi)加入超螺旋質(zhì)粒DNA。DNA終濃度一般為至少120μg/ml。然后向小池內(nèi)加入0.5ml細胞懸液(約含有1.5×106個細胞)，并輕輕混合細胞懸液和DNA溶液。用Gene-Pulser裝置(Bio-Rad)進行電穿孔。電容和電壓分別定在960μF和250～300V。隨著電壓增加，細胞存活數(shù)降低，但有導入的DNA穩(wěn)定地摻入其基因組中的存活細胞的百分比則顯著增加。在這些給定的參數(shù)下，應觀察到大約14～20mSec的脈沖時間。
將受到電穿孔的細胞在室溫下保持5分鐘，然后用無菌移液吸管輕輕地吸出小池的內(nèi)容物。將細胞直接加到在10cm平皿中的10ml預熱的營養(yǎng)培養(yǎng)基(同上，但加有15％小牛血清)內(nèi)并如上所述進行溫育。第二天吸出原培養(yǎng)基，并換成10ml新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)溫育16～24小時。第二天再克隆細胞以確定克隆效率并選擇G418抗性集落。用胰蛋白酶消化細胞，計數(shù)并鋪板；一般為確定克隆效率以103細胞/10cm平皿鋪敷成纖維細胞；為進行G418選擇則以1～2×104細胞/10cm平皿鋪敷成纖維細胞。
在含有300～400μg/ml G418(Geneticin，效力約50％的二硫酸鹽；Gibco)的成纖維細胞營養(yǎng)培養(yǎng)基(含15％小牛血清)中選擇G418抗性人成纖維細胞。在沒有G418的條件下確定克隆效率。將鋪板細胞溫育12～14天，在此時間用福爾馬林集落，用結(jié)晶紫染色并計數(shù)(確定鋪板的克隆效率)或使用克隆圓柱分離(G418平板)。對兔成纖維細胞的電穿孔和選擇基本上與人成纖維細胞相同，只是使用不同的選擇條件，在含有1gm/ml G418的培養(yǎng)基中選擇對G418抗性的兔成纖維細胞。
從新切下的人包皮中分離成纖維細胞。以50,000細胞/cm的密度在DMEM+10％小牛血清中接種培養(yǎng)物。當培養(yǎng)物匯合時，經(jīng)胰蛋白酶處理收獲成纖維細胞并用電穿孔法轉(zhuǎn)染。經(jīng)用質(zhì)粒pcDNEO(圖5)經(jīng)轉(zhuǎn)染估計電穿孔條件。使用接近最佳條件(60μg質(zhì)粒pcDNEO，電穿孔電壓250伏，電容定在960μF)進行有代表性的電穿孔實驗，結(jié)果每588個被處理的細胞產(chǎn)生1個G418集落(所有被處理細胞的0.17％)，或每71個可克隆細胞產(chǎn)生1個G418集落(1.4％)。
當在幾乎最佳條件(60μg質(zhì)粒pcDNEO，電穿孔電壓300伏，電容定在960μF)下進九次單獨的電穿孔實驗時，平均每1,899個被處理細胞中觀察到1個G418集落(0.05％)，范圍為1/882到1/7,500被處理細胞。這相當于每38個可克隆細胞平均有1個G418集落(2.6％)。
經(jīng)用質(zhì)粒pcDNEO和pXGH5共轉(zhuǎn)染使低傳代初級人成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)閔GH表達細胞。一般是在近最佳條件(電穿孔電壓為300伏，電容定在960μF)下用60μg兩質(zhì)粒等摩爾混合物進行轉(zhuǎn)染。實驗結(jié)果是每14,705個被處理細胞產(chǎn)生1個G418集落。
在相同轉(zhuǎn)染條件下分離的這些和其它細胞的hGH表達數(shù)據(jù)綜述如下。最后，所有G418r集落的98％可被擴展以產(chǎn)生大量培養(yǎng)物。分析的G418r克隆數(shù)目 154G418r/hGH表達克隆的數(shù)目 65平均hGH表達水平 2.3μg hGH/106細胞/24hr最大hGH表達水平 23.0μg hGH/106細胞/24hr使用其中neo和hGH基因存在于同一質(zhì)粒分子上的DNA構(gòu)建體pXGH301通過電穿孔轉(zhuǎn)染初級或次級人成纖維細胞也可產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體。用兩步驟法構(gòu)建pXGH301。從pBR322中分離SalI-ClaI片段(pBR 322中位置23～651)并插入到SalI-ClaI消化的pcDNEO中，導入pcDNEO的SV40早期啟動子區(qū)域的BamHI位點上游。用BamHI消化該質(zhì)粒pBNEO，分離含有處于SV40早期啟動子控制下的neo基因的2.1kb片段并插入BamHI消化的pXGH5中。分離帶有單一2.1 kb BamHI片段插入的質(zhì)粒，其中neo和hGH以彼此相同的方向轉(zhuǎn)錄。該質(zhì)粒被稱為pXGH301。例如用60μg pXGH301在300伏和960μF條件下電穿孔1.5×106個細胞。以每1.5×106個處理細胞652個G418抗性集落(每2299個處理細胞1個集落)的頻率，從被轉(zhuǎn)染的次級成纖維細胞中分離G418抗性集落。這些集落中約有59％表達hGH。
實施例2 構(gòu)建產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)錄單位的擊靶質(zhì)粒，嵌合轉(zhuǎn)錄單位中融合有人生長激素和促紅細胞生成素序列下述實施例用于說明本發(fā)明的另外兩個實施方案，其中人EPO基因的正常調(diào)節(jié)序列上游被改變，以允許在其原未被轉(zhuǎn)染狀態(tài)下不以可檢測量表達hEPO的初級或次級成纖維細胞細胞株中表達hEPO。在這些實施例方案中，擊靶的產(chǎn)物是嵌合轉(zhuǎn)錄單位，其中人生長激素基因的第一個外顯子位于hEPO外顯子2～5的上游。轉(zhuǎn)錄、拼接和轉(zhuǎn)譯的產(chǎn)物是其中hEPO信號肽的氨基酸1～4被hGH的氨基酸殘基1～3取代的蛋白質(zhì)。就被插入的外來調(diào)節(jié)序列的相對位置和為產(chǎn)生最終的、被加工的轉(zhuǎn)錄本所需的特異性拼接方式來說，這兩個實施方案是不同的。
設計質(zhì)粒pXEPO-10，以通過對人染色體7的內(nèi)源hEPO基因進行基因擊靶而用hGH的外顯子1置換hEPO的外顯子1。按下述方法構(gòu)建質(zhì)粒pXEPO-10。首先，將位于hEPO編碼區(qū)上游的6 kb HindIII-BamHI片段(參見實施例1f)插入HindIII-BamHI消化的pBluescri-ptIISK+(Stratagene，LaJolla，CA)中而構(gòu)建中間體質(zhì)粒PT163。用XhoI和HindIII消化該連接反應的產(chǎn)物并連接到來自pMClneoPolyA[Thomas，K.R.and Capecchi，M.R.Cell 51503-512(1987)，可得自Stategene，LaJolla，CA]的1.1 kb HindIII-XhoI片段上，以產(chǎn)生pT163。在聚合酶鏈反應中利用寡核苷酸13.1～13.4以產(chǎn)生一融合片段，其中小鼠金屬硫因I(mMT-I)啟動子-hGH外顯子1序列額外地融合到hEPO內(nèi)含子1序列上。首先，用寡核苷酸13.1和13.3以擴增約0.73 kb來自pXGH5(圖5)的mMT-I啟動子-hGH外顯子1片段。然后，用寡核苷酸13.2和13.4擴增主要由人基因組DNA中hEPO內(nèi)含子1組成的約0.57 kb片段。最后，混合兩個已擴增的片段并進一步用寡核苷酸13.1和13.4擴增以產(chǎn)生最后的融合片段(融合片段3)，該融合片段在mMT-I部分的5′側(cè)SalI位點側(cè)接，并在hEPO內(nèi)含子1序列的3′側(cè)XhoI位點側(cè)接。用XhoI和SalI消化融合片段3并連接到XhoI消化的pT163。將此連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，并鑒定含有融合片段3的單一插入段的克隆并定名為pXEPO-10，在所述融合片段3中在hEPO內(nèi)含子1序列的3′側(cè)重新產(chǎn)生了XhOI位點。13.15′TTTTGTCGAC GGTACCTTGG TTTTTAAAAC CSalI KpnI(SEQ ID NO 5)13.25′CCTAGCGGCA ATGGCTACAG GTGAGTACTC GCGGGCTGGG CG(SEQ ID NO 6)13.35′CGCCCAGCCC GCGAGTACTC ACCTGTAGCC ATTGCCGCTA GG(SEQ ID NO 7)13.45′TTTTCTCGAG CTAGAACAGA TAGCCAGGCT GXhoI(SEQ ID NO 8)寡聚物13.1的非黑體字區(qū)域與mMT-I啟動子相同，帶有作為其5′邊界的天然KpnI位點。黑體字型代表將5′邊界轉(zhuǎn)變?yōu)闉镾alI位點的SalI位點尾部。寡聚物13.2和13.3的黑體字區(qū)域代表hGH序列，而非黑體字區(qū)域是來自hEPO基因的內(nèi)含子1序列。寡聚物13.4的非黑體字區(qū)域與hEPO內(nèi)含子1的最后25個堿基相同。黑體字區(qū)域包括將擴增片段的3′邊界轉(zhuǎn)變?yōu)閄hoI位點的XhoI位點尾部。
設計質(zhì)粒pXEPO-10，以借助基因擊靶將hEPO結(jié)構(gòu)基因和啟動子區(qū)的hGH上游的mMT-I啟動子和外顯子1置于人染色體7上的內(nèi)源性hEPO座位。按下述方法構(gòu)建質(zhì)粒pXEPO-11。在聚合酶鏈反應中利用寡核苷酸13.1和13.5～13.7以產(chǎn)生一融合片段，該片段中小鼠金屬硫因I(mMT-I)啟動子-hGH外顯子1序列被額外地融合到相對于hEPO編碼區(qū)從-1到-630的hEPO序列上。首先，用寡核苷酸13.1和13.6擴增來自pXGH5(圖5)的約0.75 kb mMT-I啟動子-hGH外顯子1片段。然后，用寡核苷酸13.5和13.7擴增來自人基因組DNA的，相對于hEPO編碼區(qū)的主要由從-1至-620的hEPO序列組成的約0.65 kb片段。寡核苷酸13.5和13.6均含有位于hGH內(nèi)含子1-hEPO啟動子區(qū)域的10bp接頭序列，它相當于天然hEPO內(nèi)含子1拼接供體位點。最后，混合兩個已擴增的片段并進一步用寡核苷酸13.1和13.7擴增，以產(chǎn)生最后的融合片段(融合片段6)，該片段側(cè)接mMT-I部分的5′側(cè)Sa1I位點，并側(cè)接hEPO啟動子區(qū)的3′側(cè)XhoI位點。用XhoI和SalI消化融合片段6并連接到XhOI消化的PT163上。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，鑒定出含有融合片段6的單一插入段的克隆，并定名為pXEPO-11，所說的融合片段6中，在hEPO啟動子序列的3′側(cè)上重新產(chǎn)生了XhoI位點。13.55′GACAGCTCAC CTAGCGGCAA TGGCTACAGG TGAGTACTCAAGCTTCTGG GCTTCCAGAC CCAG (SEQ ID NO 9)HindIII13.65′CTGGGTCTGG AAGCCCAGAA GCTTGAGTAC TCACCTGTAGHindIIICCATTGCCGC TAGGTGAGCT GTC (SEQ ID NO 10)13.75′TTTTCTCGAG CTCCGCGCCT GGCCGGGGTC CCTCXhoI(SEQ ID NO 11)寡聚物13.5和13.6的黑體字區(qū)代表hGH序列。斜體字的區(qū)域相當于hEPO內(nèi)含子的前10個堿基對。寡聚物其余部分相當于從-620到-597(相當于hEPO編碼區(qū)而言)的hEPO序列。寡聚物13.7的非黑體字區(qū)域與相對于hEPO編碼區(qū)的堿基-1至-24相同。黑體字區(qū)域包括將已擴增的片段的3′邊界轉(zhuǎn)變?yōu)閄hoI位點的XhoI位點尾部。
可用BamHI和XhoI消化質(zhì)粒pXEPO-10以釋放出含有mMT-I/hGH融合體的7.3kb片段(其中所說融合體在其兩側(cè)側(cè)接hEPO序列)，而將該質(zhì)粒用于基因擊靶。該片段(擊靶片段1)不含hEPO編碼序列，只有位于hEPO編碼區(qū)和hEPO內(nèi)含子1序列的上游的-620和約-6620序列，以指導對人EPO座位擊靶。使用實施例1c中所述的相似條件，將擊靶片段1轉(zhuǎn)染到初級和次級人皮膚成纖維細胞中。將G418抗性集落接種到96孔平板的各孔中并用ELISA方法(R&D系統(tǒng)，Minnea-polis，MN)篩選以表達EPO。其中轉(zhuǎn)染DNA隨機整合到人基因組中的細胞不能產(chǎn)生EPO。其中轉(zhuǎn)染DNA已與內(nèi)源hEPO內(nèi)含子1和hEPO上游序列發(fā)生同源重組的細胞含有一嵌合基因，該基因中mMT-I啟動子和未被轉(zhuǎn)錄的序列以及hGH 5′未轉(zhuǎn)譯序列和hGH外顯子1取代了正常hEPO啟動子和hEPO外顯子1(見圖1)。擊靶片段1中的非hEPO序列被連接到hEPO內(nèi)含子1下游的hEPO序列。用mMT-1啟動子置換正常hEPO調(diào)節(jié)區(qū)將激活正常情況下不表達hEPO的成纖維細胞中的EPO基因。用hGH外顯子1取代hEPO外顯子1則產(chǎn)生其中hEPO信號肽的前4個氨基酸被hGH的氨基酸1～3取代的蛋白質(zhì)，形成一個功能性嵌合信號肽，該信號肽在轉(zhuǎn)譯后加工時從成熟蛋白質(zhì)中被除去并使之從表達細胞中分泌出來。
通過用BamHI和XhoI消化可以使質(zhì)粒pXEPO-11用于基因擊靶，以釋放出含有在其兩側(cè)上側(cè)接hEPO序列的mMT-I/hGH融合體的7.4kb片段。該片段(擊靶片段2)不含有hEPO編碼序列，而只具有位于hEPO編碼區(qū)的上游-1和約-6620間的序列，以指導對人EPO座位擊靶。使用與實施例19中所述相似的條件將擊靶片段2轉(zhuǎn)染到初極或次級人皮膚成纖維細胞中。將G418抗性集落收集到96孔平板的單個孔內(nèi)，并用ELISA檢測法(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，MN)篩選有EPO表達的集落。其中轉(zhuǎn)染DNA隨機整合到人基因組中的細胞不能產(chǎn)生EPO。其中轉(zhuǎn)染DNA已與內(nèi)源性hEPO啟動子和上游序列發(fā)生同源重組的細胞含有一嵌合基因，該基因中mMT-1啟動子和未轉(zhuǎn)錄序列、hGH5′未轉(zhuǎn)譯序列和hGH外顯子1，以及由hEPO內(nèi)含子1的前10個堿基組成的10堿基對接頭被插入在位于相對于hEPO編碼區(qū)的位置-620的HindIII位點處(參見圖2)。正常靜止hEPO啟動子的mMT-I啟動子上游定位將在初級或次級皮膚成纖維細胞中指導信號讀碼(5′至3′)未轉(zhuǎn)譯金屬硫因和hGH序列、hGH外顯子1、與hEPO內(nèi)含子1之前10個堿基對相同的10 DNA堿基，以及正常hEPO啟動子和hEPO外顯子1(相當于hEPO編碼序列的-620到+13)的合成。來自hEPO內(nèi)含子1的10堿基對接頭序列用作拼接供體位點使hGH外顯子1融合到位于緊接hEPO外顯子2上游的下一個下游拼接受體位點。因此，對所得轉(zhuǎn)錄本的加工將拼接掉hEPO啟動子、外顯子1和內(nèi)含子1序列。用hGH外顯子1置換hEPO外顯子1將產(chǎn)生一種其中hEPO信號肽的前4個氨基酸用hGH氨基酸1～3取代的蛋白質(zhì)，這一取代形成一個通過轉(zhuǎn)譯后加工而從成熟蛋白質(zhì)中被除去并從表達細胞中被分泌的功能性嵌合信號肽。
利用已知方法能構(gòu)建一系列與pXEPO-10和pXEPO-11相關(guān)的構(gòu)建體。在這些構(gòu)建體中，mMT-1啟動子和hGH序列的相對位置，以及mMT-1/hGH序列插入hEPO上游序列的位置是變化的，從而產(chǎn)生可選擇的、便于基因擊靶的嵌合型轉(zhuǎn)錄單位，導致融合轉(zhuǎn)錄本的更有效表達，或者具其它所需的特性。這類構(gòu)建體將產(chǎn)生相似的結(jié)果，因此hGH-hEPO融合基因被置于由基因擊靶至正常hEPO基因位置所產(chǎn)生的外源啟動子的調(diào)控之下。例如，hEPO基因上游的6 kb HindIII-BanHI片段(參見實施例1f)具有許多能夠用作插入neo基因和mMT-1啟動子/hGH融合片段的位點的限制性酶識別序列。位于HindIII位點上游約1.3 kb的BglII位點即為所說的一個位點，它在該區(qū)域中是唯一的，并可用于插入一個或多個選擇性標記和來自另一種將在初級、次級或永久化人細胞中用于激活hEPO表達的基因的調(diào)節(jié)區(qū)。
首先，通過將位于hEPO編碼區(qū)上游的6 kb HindIII-BamHI片段(實施例1f)插入被HindIII-BamHI消化的pBluescriptIISK+(St-ratagene，LaJolla，CA)而構(gòu)建中間質(zhì)粒pT164。用BamHI和XhoI消化質(zhì)粒pMClneoPloyA[Thomas，K.R.and Capecchi，M.R.Call 51503-512(1987)；可得自Stratagene，LaJolla，CA]，用大腸桿菌DNA聚合酶的KLenow片段進行處理使之成為平頭末端，并純化所得的1.1kb片段。pT164用BglI消化，并經(jīng)E.coli DNA聚合酶的Klenow片段處理而成為平頭末端。連接上述兩個平頭末端片段，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的E.coli中。分離具有1.1 kb neo片段的單一插入段的克隆，并用限制性酶分析法進行分析，以確定那些其中由平頭Xhol和BgIII位點融合所重建的BglI位點是位于距質(zhì)粒pT164中存在的唯一HindIII位點1.3 kb的克隆。至此即可在位于neo轉(zhuǎn)錄單位5′側(cè)翼的唯一BglII位點處裂解所得的質(zhì)粒pT165。
寡核苷酸13.8和13.9被用于聚合酶鏈反應中以產(chǎn)生一個其中有小鼠金屬硫因I(mMT-I)啟動子-hGH外顯子1序列另外還與含有拼接-供體位點的10 bp片段融合的片段。盡管有大量的拼接-供體位點或共有拼接-供體位點可以被使用，但被選用的拼接-供體位點相當于天然hEPO內(nèi)含子1拼接-供體位點。寡核苷酸(13.8和13.9)被用于擴增來自pXGH5的約0.73 kb mMT-1啟動子-hGH外顯子1片段(圖5)。用BglII消化被擴增的片段(片段7)，并與經(jīng)BglII消化的pT165相連接。連接混合物轉(zhuǎn)化入E.coli中，鑒定含有片段7的單一插入段的克隆，其中，mMT-1啟動子中的KpnI位點鄰接于neo基因的5′端，并且mMT-1啟動子要以使得轉(zhuǎn)錄朝著唯一的HindIII位點的方向定位，該克隆被命名為pXEPO-12。13.8 5′AAAAAGATCT GGTACCTTGG TTTTTAAAAC CAGCCTGGAGBglII KpnI(SEQ ID NO 12)寡聚物13.8的非黑體區(qū)等同于mMT-1啟動子，以天然KpnI位點為其5′邊界。黑體型表示將5′邊界轉(zhuǎn)換為BglII位點的BglII位點尾。13.95′TTTTAGATCT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT TGCCGCTAGGBglII(SEQ ID NO 13)寡聚物13.9的黑體區(qū)表示hGH序列。斜體字區(qū)相當于hEPO內(nèi)含子1的前10個堿基對。加入劃線的BglII位點以構(gòu)建質(zhì)粒之用。
質(zhì)粒pXEPO-12被用于基因擊靶是通過用BamHI和HindIII消化，以釋放出含有由hEPO序列側(cè)接于兩側(cè)的neo基因和mMT-1/hGH融合體的7.9 kb片段。該片段(擊靶片段3)不含hEPO編碼序列，僅僅含有位于hEPO編碼區(qū)上游約-620至約-6620之間的序列以指導對人EPO基因座位上游進行擊靶。使用類似于實施例1b和1c中所述的條件將擊靶片段3轉(zhuǎn)染到初級、次級或永久化的人皮膚成纖維細胞中，收集G418抗性集落于96孔平板的各孔中，并用ELISA測定法(R&DSystems，Min-neapolis MN)進行篩選EPO表達。具有轉(zhuǎn)染DNA隨機整合到人基因組的細胞不能產(chǎn)生hEPO，轉(zhuǎn)染的DNA與內(nèi)源性hEPO啟動子和上游序列進行同源組的細胞，含有一個嵌合型基因，在該嵌合型基因中，mMT-1啟動子和非轉(zhuǎn)錄序列、hGH 5′未轉(zhuǎn)譯序列、hGH外顯子1和由hEPO內(nèi)含子1的前10個堿基組成的10 bp接頭在位于與hEPO編碼區(qū)相關(guān)的大約-1920位置處的BglII位點被插入。正常靜止的hEPO啟動子上游的mMT-1啟動子的定位將指導在初級、次級或永久化人成纖維細胞(或其它的人細胞)中合成下列信息內(nèi)容(5′→3′)未轉(zhuǎn)譯的金屬硫因和hGH序列、hGH外顯子1、與hEPO內(nèi)含子1的前10個堿基對相同的DNA 10個堿基和hEPO上游區(qū)及hEPO外顯子1(與EPO編碼序列相關(guān)的大約-1920～+13)。來自hEPO內(nèi)含子1的10bp接頭序列起拼接-供體位點作用，以使hGH外顯子1與緊鄰于hEPO外顯子2上游的下游拼接-受體位點融合。因此，所得轉(zhuǎn)錄物的加工將拼接掉hEPO上游序列、啟動子區(qū)、外顯子1和內(nèi)含子1序列。當應用pXEPO-10、-11和-12時，信息的轉(zhuǎn)錄后加工過程的改善，可以通過利用體外誘變法來進行，以去除位于mMT-I啟動子和hEPO外顯子1之間的hEPO上游序列中的拼接受體位點，這可降低產(chǎn)生所需信息所必要的生產(chǎn)性拼接現(xiàn)象的程度。以hGH外顯子1替代hEPO外顯子1產(chǎn)生蛋白質(zhì)，其中hGH的氨基酸1～3代替了hEPO信號肽的前4個氨基酸，生成功能性的嵌合型信號肽，而該信號肽由于轉(zhuǎn)譯后的加工過程被從成熟的蛋白質(zhì)中除去，并由表達細胞中分泌出。
實施例3 上游序列的中靶修飾和靶基因的擴增如果擊靶質(zhì)粒含有因基因擴增現(xiàn)象能賦予其對高水平細胞毒性因子抗性的標志基因，則就能誘導其中由前述方法激活的hEPO基因的人細胞以擴增neo/mMT-1/EPO轉(zhuǎn)錄單位。可篩選的標志基因如二氫葉酸還原酶(dhfr，篩選劑是氨甲喋呤)、多功能CAD基因[編碼氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲?；负投淙榍迕?orotase)；篩選劑是N-(膦?；?乙?；?-L-天冬氨酸(PALA)]、谷氨酰胺合成酶[篩選劑是甲硫酰氨sulphoximine(MSX)]和腺苷脫氨基酶(ada，篩選劑是腺嘌呤核苷)在永久化的人細胞系中可以擴增的在其它基因中已有文獻記載(Wright，J.A.et al，Proc Natl.Acad.Sci.USA 871791-1795(1990)；Cockett，M.I.et al.，Bio/Technology 8662-667(1990))。在這些研究中，記載基因擴增發(fā)生于許多永久化人細胞系中。在適宜的篩選條件下，其它細胞中的HT 1080、Hela、MCF-7乳腺癌細胞、K-562白血病細胞、KB癌細胞或2780 AD卵巢癌細胞表現(xiàn)出擴增反應。
質(zhì)粒pXEPO-10和pXEPO-11通過在這些質(zhì)粒的唯一HindIII位點插入一個正常的或突變的dhfr基因而能夠被修飾。在用合適的DNA轉(zhuǎn)染HT 1080細胞、篩選其G418抗性(由neo基因賦予)和鑒定其中的hEPO基因已被neo、dhfr和mMT-1序列向hEPO基因上游的正確位置進行基因擊靶而激活的細胞后，這些細胞可被置于氨甲喋呤(MTX)中分步篩選以篩選dhfr的擴增和被連接的neo、mMT-1及hEPO序列的共同擴增(Kaufman，R.J.Technique 2221-236(1990))。在所采用的分步篩選方案中，細胞首先與低濃度MTX(0.01～0.08μM)接觸，隨后與濃度漸增直至250μM或更高的MTX連續(xù)接觸。雖然MTX濃度的相對低的增量變化也是有效的，但0.04～0.08μM MTX的線性增量步驟和MTX濃度連續(xù)二倍的增加在篩選擴增的轉(zhuǎn)染細胞系中將是有利的。由dhfr基因拷貝數(shù)的增加來監(jiān)測擴增反應，并通過檢測體外的hEPO表達來證實。借助于上述策略，通過對完全位于hEPO編碼區(qū)之外的序列的中靶修飾作用能夠獲得hEPO實質(zhì)上超水平的表達。
為了通過基因擊靶非編碼序列以及隨后的擴增反應獲得超表達hGH基因的細胞，類似于本文所述的(實施例1f、1h、1i、1k、2和7)以激活hGH在人細胞中表達的構(gòu)建體也可以被進一步修飾使之包括dhfr基因。
實施例4在永久化人成纖維細胞系中擊靶和激活人EPO基因座位制備擊靶構(gòu)建體pXEPO-13以試驗內(nèi)源性hEPO基因能在人成纖維細胞中被激活的假說。首先，構(gòu)建質(zhì)粒pT22.1，它含有與小鼠金屬硫因-1啟動子(mMT-I)融合的hEPO基因的第一個密碼子上游的63 bp基因組hEPO序列。寡核苷酸22.1至22.4被用于PCR中以融合mMT-I和hEPO序列。這些引物的特性如下22.1是一個21堿基的寡核苷酸，與mMT-IKpnI位點上游的mMT-I啟動子開始的28 bp片段同源；22.2和22.3是58個核苷酸的互補引物，它們確定hEPO和mMT-I序列的融合體，使得該融合體含有hEPO基因第一個密碼子上游的hEPO序列開始的35個堿基的28 bp，和始于寡核苷酸22.2的堿基29的mMT-I序列，它包括mMT-I的天然BglII位點和延伸至mMT-I序列的30個堿基；22.4為長21個核苷酸，并與hEPO基因第一個密碼子的下游的hEPO序列開始的725 bp同源。這些引物被用于擴增含有上述mMT-I和hEPO序列融合體的1.4 kb DNA片段。用KpnI消化所得的片段(該PCR片段含有兩個KpnI位點mMT-T啟動子區(qū)的單一天然KpnI位點和hEPO序列中的單一天然KpnI位點)，并進行純化。質(zhì)粒pXEPOI也用KpnI消化，釋放出一個1.4 kb片段和一個6.4 kb片段。純化6.4 kb片段，并與1.4 kb KpnI PCR融合片段連接。所得的構(gòu)建體稱為pT22.1。第二個中間質(zhì)粒pT22.2的構(gòu)建是通過將位于hEPO結(jié)構(gòu)基因上游的大約6 kb HindIII-BamHI片段(參見實施例1f)與BamHI和HindIII消化的pBSIISK+(Stratagene，LaJolla，CA)連接。構(gòu)建第三個中間質(zhì)粒pT22.3是首先從含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的pMCINEpolyA(Stratagene，LaJolla，CA)中切除一個1.1 kb的XhoI/BamHI片段。然后用DNA聚合酶I的Klenow片段(New England Biolabs)將上述片段制成平頭未端。再將該片段連接至pBSIISK+的HincII位點(也類似地用DNA聚合酶I制成平頭)而得到pT22.3。第四個中間質(zhì)粒pT22.4的制備是通過純化來自pT22.3的含有neo基因的1.1 kb XhoI/HindIII片段，并將該片段與經(jīng)XhoI和HindIII消化的pT22.2相連。pT22.4因此而含有與hEPO片段上游BamHI-HindIII的HindIII側(cè)相鄰的neo基因。最后，通過首先從pT22.1中切除2.0 kb EcoRI/AccI片段而得到pXEPO-13。該片段的EcoRI位點確定了mMT-I啟動子的5′邊界，而該片段的AccI位點則位于hEPO外顯子5中。因此，該AccI/EcoRI片段除了僅僅缺失外顯子5的部分和天然多腺苷酸化作用位點外，含有幾乎完整的hEPO表達單位。純化上述2.0 kb EcoRT/AccI片段，用DNA聚合酶I的Klennow片段處理制成平頭末端，然后與經(jīng)XhoI消化且平頭末端化的pT22.4連接。
用經(jīng)PvuI-BamHI消化的pXEPO-13轉(zhuǎn)染HT 1080細胞。以此方式消化的pXEPO-13產(chǎn)生三個片段包括amp基因部分的1 kb載體片段；留下的載體序列的1.7 kb片段和含有hEPO、neo及mMT-I序列的大約9 kb片段。所述的約9 kb BamHI/PvuI片段由BamHI位點開始依次含有下列序列hEPO基因組序列上游的約5.2 kb、1.1 kb noe轉(zhuǎn)錄單位、0.7 kb mMT-I啟動子和含有在外顯子5內(nèi)截短的hEPO編碼序列的2.0 kb片段。45μg經(jīng)上述方法消化的pXEPO-13被用于1.2×107細胞的電穿孔中(電穿孔的條件描述于實施例1b中)。該電穿孔過程共重復8次，形成對總共9.6×107細胞的電穿孔。細胞與培養(yǎng)基混合以產(chǎn)生1×106細胞/ml的細胞密度，取1 ml的等份試樣分配至總共96個150 mm組織培養(yǎng)板(Falcon)中，每個含有35 ml最低限度的DMEM/15％牛血清。第二天，將培養(yǎng)基吸出，并用含0.8 mg/ml G418(Gibco)的新鮮培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基。培養(yǎng)10天后，用ELISA分析(R&D Systems)取樣分析每一培養(yǎng)板的培養(yǎng)基中的hEPO。96個平板中有6個含有至少10 mU/ml hEPO。選擇這些培養(yǎng)板中的一塊，即第18號板以純化hEPO表達集落。96個板的每個150mm培養(yǎng)板含有約600個G418抗性集落(在所有的96平板上，估計總共有57,600個G418抗性集落)。18號培養(yǎng)板上的大約600個集落用胰蛋白酶處理，并以50個細胞/ml的密度再鋪板入364孔板(Steril-in)中。培養(yǎng)一周后，在364孔板的每個大孔中約有10個集落可單個地看見(這些培養(yǎng)板是由24個大孔的每個大孔中有16個小孔所組成的)。此時篩選各孔中hEPO的表達。兩個大孔中包含有至少帶有20mU/ml hEPO的培養(yǎng)基。在A2號孔中發(fā)現(xiàn)含有分布于16個小孔中的15個集落。將每個這些小孔中的內(nèi)容物都用胰蛋白酶處理，并轉(zhuǎn)移到96培養(yǎng)板的16個單獨孔中。在培養(yǎng)7天后，從這些的每孔培養(yǎng)基中取樣進行hEPO ELISA分析。只有一個孔(10號孔)含有HEPO。該細胞株被命名為HT165-18A2-10，使其在培養(yǎng)中繁殖以進行定量的hEPO分析、RNA分離和DNA分離。hEPO產(chǎn)率的定量檢測結(jié)果為25億單位/106細胞/24小時。
由hEPO外顯子5中的AccI位點至3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)的BglII位點的0.2kb DNA探針被用于探測從HT165-18A2-10細胞中分離出的RNA。在外顯子5的AccI位點處被截短的擊靶構(gòu)建體pXEPO-13不含這些ACCI/BglII序列，因此，該構(gòu)建體對于在hEPO基因座位的擊靶具有判斷性。只有以同源方式與天然hEPO序列進行重組的細胞株能夠產(chǎn)生含有與AccI/BglII序列同源的序列的hEPO mRNA。已發(fā)現(xiàn)HT165-18A2-10表達在Northern印跡中與32P標記的AccI/BglII hEPO探針雜交的預定大小的mRNA。限制性酶和Southern印跡分析證實neo基因和mMT-I啟動子已在HT165-18A2-10細胞中被擊靶至兩個hEPO等位基因之一的座位上。
上述結(jié)果表明，能用同源重組將一個調(diào)節(jié)區(qū)擊靶至一個通常在人成纖維細胞中處于靜止狀態(tài)的基因上，從而引起該基因的功能性激活。22.1 5′CACCTAAAAT GATCTCTCTG G (SEQ ID NO 14)22.2 5′CGCGCCGGGT GACCACACCG GGGGCCCTAG ATCTGGTGAAGCTGGAGCTA CGGAGTAA (SEQID NO 15)22.3 5′TTACTCCGTA GCTCCAGCTT CACCAGATCT AGGGCCCCCGGTGTGGTCAC CCGGCGCG(SEQ ID NO 16)22.4 5′GTCTCACCGT GATATTCTCG G (SEQID NO 17)實施例5 制備無內(nèi)含子的基因基因擊靶也可以用于制備經(jīng)加工后不含內(nèi)含子的基因，以轉(zhuǎn)移到酵母或細菌中進行基因表達和體外的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。例如，利用下述方法即可由酵母生產(chǎn)hGH。
制備兩個分離的擊靶構(gòu)建體。擊靶構(gòu)建體1(TC1)包括一段逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR序列(例如來自Moloney Murine白血病病毒(MoMLV)的LTR)、一個用于在人細胞中進行篩選的標志基因(如來自Tn5的neo基因)、一個用于在酵母中進行篩選的標志基因(如酵母URA3基因)、一個能在酵母中指導基因表達的調(diào)節(jié)區(qū)(如GAL4啟動子)以及可以任選地一段當與hGH基因融合時能使得酵母細胞分泌hGH的序列(前導序列)。該載體也能包括允許在人細胞中進行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的DNA序列。組建上述構(gòu)建體使得上述序列由hGH基因組序列側(cè)接于兩側(cè)，當與基因組hGH基因N序列進行同源重組時，該hGH基因組序列將在hGH基因N密碼子1(相應于成熟的、被加工蛋白質(zhì)的1位氨基酸)緊接上游的TCI中整合外源序列。整合中的DNA序列的順序是hGH上游和調(diào)節(jié)序列、neo基因、LTR、URA3基因、GAL4啟動子、酵母前導序列、包括成熟蛋白1位氨基酸的hGH序列和成熟蛋白質(zhì)1位氨基酸的下游序列。擊靶構(gòu)建體2(TC2)包括足以使質(zhì)粒在酵母中復制的序列(例如2-微米圈(2-micron circle)或ARS序列)酵母轉(zhuǎn)錄終止序列、病毒LTR和用于在人細胞中進行篩選的標志基因(例如，細菌gpt基因)。組建該構(gòu)建體使得上述序列的兩側(cè)由hGH基因組序列側(cè)接，當與基因組的hGH基因N序列進行同源重組時，該hGH基因組序列將在hGH基因N終止密碼子的緊接下游的TC2中整合外源序列。整合時的DNA序列的順序是hGH外顯子5序列、酵母轉(zhuǎn)錄終止序列、酵母質(zhì)粒復制序列、LTR、gpt基因和hGH3′非轉(zhuǎn)譯序列。
來自TC1和TC2的線性片段被相繼擊靶到其hGH基因側(cè)翼的各自位置。在用輔助性逆轉(zhuǎn)錄病毒對些細胞進行超感染之后，通過該區(qū)指導轉(zhuǎn)錄的LTR將產(chǎn)生一個在兩端具有LTR序列的RNA。拼接該RNA將產(chǎn)生的分子中正常的hGH內(nèi)含子已被去除。被加工的轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄將導致被加工的hGH融合基因的雙鏈DNA拷貝的積累。從被雙重擊靶、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細胞中分離DNA，并用在LTR中一次性裂解轉(zhuǎn)錄單位的酶進行消化。被消化的物質(zhì)在能促進環(huán)化的條件下進行連接，并被導入酵母細胞中，所得的細胞隨后進行篩選URA3基因。只有那些攝入了URA3基因(被連接在由TC1和TC2導入的序列及加工的hGH基因上)的細胞能夠生長。這些細胞含有在半乳糖誘導時將表達hGH蛋白的質(zhì)粒，并借助于被融合的酵母前導肽列從細胞中分泌hGH蛋白，所說的前導肽序列一旦在分泌產(chǎn)生成熟的、有生物活性的hGH分子時則被裂解掉。
在細菌細胞中的表達通過在TC1和TC2中進行的簡單替換，如用來自pBR322的氨芐青霉素抗性基因代替酵母URA3基因、用tac啟動子(deboer et al，Proc.Natl.Acad.Sci.8021-25(1983))代替酵母GAL4啟動子、用細菌前導序列代替酵母前導序列、用pBR322的復制原點代替2-micron circle或ARS序列和用細菌轉(zhuǎn)錄終止(如trpA轉(zhuǎn)錄終止子；Christic，G.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.784180-4184(1981))序列代替酵母轉(zhuǎn)錄終止序列來完成。類似地，用hEPO擊靶序列簡單地代替hGH擊靶序列也能在酵母和細菌中表達hEPO，這樣，酵母或細菌前導序列定位于緊接hEPO密碼子1(相相于成熟的加工蛋白質(zhì)中1位氨基酸)的上游。
實施例6 在永久化人細胞系中激活和擴增EPO基因?qū)hfr表達單位摻入到pXEPO-13的唯一HindIII位點(參見實施例4)將產(chǎn)生一個能夠雙重選擇和選擇其中的dhfr基因被擴增的細胞的新?lián)舭休d體。pXEPO-13中的單一HindIII位點限定了neo基因與人EPO基因的天然位置上游的基因組序列間的連接。將dhfr基因安置在該位點上提供了一個具有由來自天然hEPO基因位置的DNA序列包繞的neo和dhfr基因的構(gòu)建體。與pXEPO-13一樣，插入dhfr基因的衍生物經(jīng)同源重組被用于擊靶hEPO基因座位。這一被命名為pREPO4的構(gòu)建體示于圖6中。該質(zhì)粒包括人EPO基因外顯子1～4和部分外顯子5以及位于hEPO編碼區(qū)上游的HindIII-BamHI片段。pSVe、pTK和pmMT-I相當于來自SV40早期區(qū)、單純瘡疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因和小鼠金屬硫因-I基因的啟動子。其產(chǎn)生過程如下純化HindIII消化的pXEPO-13，用DNA聚合酶I的Klenow片段使之變?yōu)槠筋^。為獲得dhfr表達單位，用EcoRI和SalI消化質(zhì)粒構(gòu)建體pF8CIS9080(Eaton et al.，Biochemistry 258343-8347(1986))。由消化液中純化含dhfr表達單位的2 kb片段，并用DNA聚合酶I的Klenow片段處理使之變?yōu)槠筋^。然后將上述含dhfr的片段與pXEPO-13的平頭化HindIII位點連接。取該連接混合物的等分部份轉(zhuǎn)化入E.coli，并鋪板于氨芐青霉素選擇平板上。于37℃培養(yǎng)過夜后，觀察、挑出并培養(yǎng)單個細菌集落。由這些培養(yǎng)物得到小質(zhì)粒制備物，然后用BglI+HundIII和SfiI限制性酶消化所得的DNA，以確定被插入的dhfr片段的方向。發(fā)現(xiàn)得自上述制備物之一的質(zhì)粒DNA含有這樣的dhfr片段2 kb插入段。并發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒中dhfr表達單位的轉(zhuǎn)錄方向與鄰接的neo基因的方向相對。這是被命名為pREPO4的構(gòu)建體。
在經(jīng)同源重組激活內(nèi)源性hEPO基因之后，質(zhì)粒pREPO4被用于在細胞中擴增hEPO基因座位。用該構(gòu)建體產(chǎn)生的基因激活使得可以通過利用藥物氨甲蝶呤(MTX)選擇增加的DHFR表達。一般情況下，DHFR表達的提高是通過DNA擴增增加拷貝數(shù)而實現(xiàn)的。最終的結(jié)果是被激活的hEPO基因與dhfr序列一起共擴增。激活的EPO基因座位的共擴增將導致EPO表達的提高。
用pREPO4在HT 1080細胞中進行擊靶實驗。分離hEPO表達系HTREPO-52。用Southern和Northern印跡定量分析上述細胞系產(chǎn)生的EPO。發(fā)現(xiàn)該菌株將被一個單拷貝的dhfr/neo/mMT-I序列擊靶。在0.8mg/ml G418選擇條件下得到的表達水平為大約1300mU/1×106細胞/天。因為靶EPO基因座位含有一個dhfr表達單位，有可能用抗葉酸藥物MTX選擇DHFR表達的提高。因此，該菌株在0.02、0.05、0.1、0.2和0.4μM MTX中進行分步選擇。其起始選擇結(jié)果列于表4和圖7。
表4細胞系MTX(μM)mU/1×106細胞/24小時52C20-5-00136852C20-5-0.010.01 174452C20-5-0.020.02 1164352C20-5-0.050.05 2444952-3-5-0.10 0.1 3701952-3-5-0.20 0.2 6786752-3-5-0.4B 0.4 99919用增加的MTX濃度的選擇成功地提高了細胞系HTREPO-52中hEPO的表達，觀察到對于抗0.4μM MTX來說該細胞系中EPO產(chǎn)量增加了70倍。用Southern印跡在MTX抗性細胞系中進行分析證實hEPO基因座位擴增，它反映出激活的hEPO基因座位相對于其母體(未被擊靶的)hEPO等位基因其拷貝數(shù)大約增加了10倍。
實施例7 通過插入基因組hEPO編碼區(qū)上游1.8 kb的CMV啟動子產(chǎn)生hEPO融合基因擊靶質(zhì)粒pREPO15的構(gòu)建構(gòu)建pREPO15首先是通過PCR擴增將CMV啟動子與hGH外顯子1融合。擴增來自hGH表達構(gòu)建體pXGH308的1.6 kb片段，它具有的CMV啟動子區(qū)始于基因庫(Genbank)序列HS5MIEP的核苷酸546，終于核苷酸2105，利用寡核苷酸20和35已將所說的基因庫序列HS5MIEP與始于基因庫序列HUGHCSA的核苷酸5225并終于核苷酸7322的hGH序列融合。寡核苷酸20(35 bp，SEQ ID NO18)在相對于cap位點(基因庫序列HEHCMVP1中)的-614處與CMV啟動子雜交，并在其5′端包括一個SalI位點。寡核苷酸35(42 bp，SEQID NO19)與+966處的CMV啟動子和鄰接hGH外顯子1退火，并在其5′端包括hEPO內(nèi)含子1的前10個堿基對(含有拼接-供體位點部分)和一個HindIII位點。用HindIII和SalI消化所得的PCR片段，并用凝膠純化。用XhoI和HindIII消化質(zhì)粒pT163(實施例2)，用凝膠純化含有neo表達單位的大約1.1 kb片段。將1.6 kb CMV啟動子/hGH外顯子1/拼接-供體位點片段與1.2 kb neo片段連接起來，并插入到pBSIISK+(Str-agene，Inc)的HindIII位點。所得的中間質(zhì)粒(命名為pBNCHS)含有一個在轉(zhuǎn)錄方向上與CMV啟動子/hGH外顯子1/拼接-供體位點片段的方向相對的neo表達單位。構(gòu)建第二個中間質(zhì)粒pREPO5.ΔHindIII，首先用HindIII消化pREPO5。該過程釋放出1.9 kb和8.7kb兩個片段，并且用凝膠純化含有EPO擊靶序列的8.7kb片段，通過自身連接而環(huán)化。所得的質(zhì)粒pREPO5ΔHindIII僅含有通常存在于hEPO基因上游的非編碼基因組DNA序列。它所包括的序列從相對于EPO外顯子1的-5785～-1。用HindIII從pBNCHS中切除含neo、CMV啟動子、hGH外顯子1和拼接-供體位點的2.8 kb片段，并用凝膠純化。該片段經(jīng)DNA聚合酶I的Klenow片段(New εngland Biolabs，Inc.)處理而變成平頭，并與經(jīng)BglII消化且被平頭的pREPO5ΔHindIII連接。用BglII在pREPO5ΔHindIII中hEPO外顯子1上游的-1779 bp位置進行切割。所得的構(gòu)建體pREPO15(圖8)含有相對于hEPO編碼區(qū)從-5786～-1779的EPO上游序列、neo表達單位、CMV啟動子、hGH外顯子1、拼接-供體位點和hEPO編碼區(qū)上游從-1778～-1的序列，各元件以所列的順序按照相對于hEPO上游區(qū)核苷酸序列的5′→3′方向組裝。為了轉(zhuǎn)染人細胞，用NotI和PvuI消化pREPO15以釋放8.6 kb擊靶片段。該擊靶片段含有與hEPO基因上游DNA同源的分別4.0 kb和1.8 kb第一及第二擊靶序列。
培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細胞并鑒定表達EPO的被擊靶克隆所有的細胞維持在37℃、5％CO2、98％濕度及含10％牛血清的DMEM(DMEM/10，HyClone Laboratories)的條件下。用100μg DNA在250V和960μF的條件下電穿孔在PBS(GIBCO)中的12×106細胞而完成對次級人包皮成纖維細胞的轉(zhuǎn)染。將處理過的細胞以每150mm板1×106細胞的密度接種，第二天，將培養(yǎng)基更換為含0.8mg/mlG418(GIBCO)的DMEM/10。選擇過程進行14天，此時再取樣分析培養(yǎng)基中的EPO產(chǎn)量。用無菌的玻璃克隆柱(Bellco)分離培養(yǎng)板上經(jīng)EPO ELISA(Genzyme Inc.)確定呈顯有顯著的hEPO含量(＞5mU/ml)的所有集落，并轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板的各個孔中。培養(yǎng)1～2天后，在這些孔中取樣用ELISA分析hEPO的產(chǎn)量。經(jīng)培養(yǎng)繁殖所得的生產(chǎn)hEPO細胞株以備凍存、核酸分離及EPO產(chǎn)量定量之用。
HT 1080細胞(ATCC CCL 121)的轉(zhuǎn)染，是通過用45μg DNA在450V和250μF的條件下處理PBS(GIBCO)中的12×106細胞來進行的?？寺〉纳L和鑒定如同上述對次級人包皮成纖維細胞一樣處理。用有限稀釋法分離產(chǎn)hEPO的克隆細胞系。首先將從初步選擇平板上收集的集落以10～15集落/孔的密度鋪于24孔板的各孔中。然后將產(chǎn)hEPO的匯集物以產(chǎn)生＜1集落/孔的細胞密度在96孔板中鋪板。增殖各個克隆以進行上述對人包皮成纖維細胞一樣的進一步分析。
表達EPO克隆的特征pRE015不含有任何hEPO編碼序列。在hEPO外顯子1上游neo/CMV啟動子/hGH外顯子1/拼接-供體片段的擊靶，通過從CMV啟動子轉(zhuǎn)錄開始而產(chǎn)生hEPO表達，產(chǎn)生包括CMV序列、hGH外顯子1和拼接-供體位點、hEPO序列上游的1.8 kb及正常的hEPO外顯子、內(nèi)含子和3′非轉(zhuǎn)譯序列的初級轉(zhuǎn)錄物。從鄰接hGH外顯子1的拼接-供體位點到下一個鄰位于hEPO外顯子2的下游拼接-受體位點進行拼接上述轉(zhuǎn)錄物。這將有效地產(chǎn)生一個由hEPO基因上游基因組序列、正常的hEPO啟動子、hEPO外顯子1和hEPO內(nèi)含子1所組成的新內(nèi)含子。在成熟的轉(zhuǎn)錄物中，hGH外顯子1將替代hEPO外顯子1。hEPO外顯子1僅編碼26氨基酸信號肽的前4 1/3氨基酸，它在被細胞分泌出之前從前體蛋白質(zhì)上裂解掉。hGH外顯子1編碼hGH信號肽的前3 1/3氨基酸，它在被細胞分泌出之前出將從前體蛋白質(zhì)中裂解掉。在hGH外顯子1代替hEPO外顯子1的信息轉(zhuǎn)譯過程中，將因此產(chǎn)生一種其中的信號肽為hGH和hEPO序列的嵌合體的蛋白質(zhì)。通過正常的轉(zhuǎn)譯后裂解過程除去信號肽將產(chǎn)生一個成熟的hEPO分子，其初級序列難以與正常產(chǎn)物分開。
將pRPO015轉(zhuǎn)染入人成纖維細胞引起這些細胞表達EPO。表5列出了用pREPO15在人成纖維細胞和HT 1080細胞中進行擊靶實驗的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)在正常人成纖維細胞中的擊靶頻率是1/264 G418r集落，而用HT 1080細胞的擊靶頻率為1/450 G418r集落。定量分析得自每一上述細胞株的hEPO產(chǎn)量。在由轉(zhuǎn)染人纖維細胞得到的一個hEPO產(chǎn)生株中所得的分泌量為7,679mU/106細胞/天(表5)。來自HT 1080細胞的激活hEPO細胞系的產(chǎn)量為12,582mU/106細胞/天(表5)。這些結(jié)果表明，對hEPO基因座位的激活是有效的，并導致hEPO以相對高的水平不斷產(chǎn)生。用限制性酶和Southern雜交分析法證實了擊靶過程發(fā)生于EPO基因座位。
對用pREPO15擊靶的人成纖維細胞和HT 1080克隆進行Southern印跡分析。圖9A表示母體和被擊靶的hEPO基因座位的限制性圖，而圖9B表示對被擊靶的人成纖維細胞克隆進行限制性酶和Southern雜交分析的結(jié)果。作為在hEPO基因座位擊靶的結(jié)果，BglII/EcoRI和BamHI的消化物分別釋放出5.8kb和6.6kb的片段(T1泳道)。這兩個片段得自含有neo基因和CMV啟動子序列的2.7 kb DNA的插入。因為兩個hEPO等位基因中只有一個被擊靶，所以在這些菌株和母體DNA中觀察到反映未改變的hEPO基因座位的4.3 kb片段(BglII/EcoRI)或10.6 kb片段(BamHI)(泳道HF)。這些結(jié)果證明在hEPO基因座位發(fā)生的同源重組，導致指導產(chǎn)生人促紅細胞生成素的新轉(zhuǎn)錄單位生產(chǎn)。寡核苷酸 序列205′ TTTTCTCGAG TCGACGACAT TGATTATTGA CTAGT(SEQ ID NO18)355′TTTTAAGCTT GAGTACTCAC CTGTAGCCAT GGTGGATCCC GT(SEQ ID NO19)表5 在人細胞中pREPO15的轉(zhuǎn)染和hEPO表達的激活被轉(zhuǎn)染的 被處理aG418rb含有EPO表細胞類型 的細胞 集落 達子的平板人成纖維細胞 3.3×107264 1HT 1080細胞 3.1×1072700 6hEPO表達子數(shù) hEPO表達子數(shù)chEPO的表達/被處理的細胞/被處理的細胞(mU/106細胞/24小時)1/264 1/3.3×10776791/450 1/5.2×10612,582a通過計算2個平板上的集落數(shù)、平均其結(jié)果并外推至總的平板數(shù)而估算出。
b從含有G418r集落平板的培養(yǎng)基中取樣進行EPO ELISA分析，那些顯示出hEPO水平高于5mU/ml的被算作EPO激活現(xiàn)象。
c定量測定來自人成纖維細胞株、HF 342-15或HT 1080細胞系HTPREPO15-1-6-6的hEPO產(chǎn)量。
實施例8 通過插入基因組hEPO編碼區(qū)的上游1.8kb CMV啟動子而產(chǎn)生和擴增hEPO融合基因構(gòu)建擊靶質(zhì)粒pREPO18通過在位于pREPO15的neo基因5′端ClaI位點處插入dhfr表達單位而構(gòu)建pREPO18(圖10)。為了獲得dhfr表達單位，用EcoRI和SalI消化質(zhì)粒構(gòu)建體pF8CIS9080[Eaton et al.，Biochemistry258343-8347(1986)]。從該消化物中純化含有dhfr表達單位的2kb片段，并通過用DNA聚合酶I的Klenow片段處理使之平頭化。然后將ClaI接頭(New England Biolabs，Inc.)連接至平頭化的dhfr片段上。再用ClaI消化上述連接的產(chǎn)物，并與ClaI消化的pREPO15連接。將該連接物的等分轉(zhuǎn)化入E.coli，并在氨芐青霉素選擇平板上鋪板。通過限制性酶的消化作用分析菌落以確定插入的dhfr片段的方向。有dhfr的其轉(zhuǎn)錄方向與neo基因的轉(zhuǎn)錄方向相對的一個質(zhì)粒被命名為pREPO18(-)。有dhfr與neo基因具有相同轉(zhuǎn)錄方向的第二種質(zhì)粒被命名為pREPO18(+)。
細胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染并鑒定表達EPO的被擊靶克隆所有的細胞維持于37℃、5％CO2、98％濕度及含10％牛血清的DMEM(DMEM/10，HyClone Laboratories)的條件下。用45μg DNA在450V和250μF條件下經(jīng)電穿孔處理PBS(GIBCO)中處理12×106細胞而進行對HT 1080細胞(ATCC CCL 121)的轉(zhuǎn)染。以1×106細胞/150mm平板的密度接種經(jīng)上述處理的細胞。第二天，將培養(yǎng)基更換為含0.8mg/ml G418(GIBCO)的DMEM/10。選擇過程進行14天，在該時期取樣分析培養(yǎng)基中hEPO的產(chǎn)量。用胰蛋白酶處理經(jīng)hEPOELISA(Genzyme Inc.)分析確定為呈現(xiàn)有明顯hEPO產(chǎn)量(＞5mU/ml)的平板，并將細胞進行重新鋪板以分離克隆。用有限稀釋法分離生產(chǎn)hEPO克隆細胞系，首先是以10～15集落/孔的密度將克隆鋪于24孔板的孔中，然后以＜1集落/孔的細胞密度將來自產(chǎn)hEPO匯集物的細胞鋪板于96孔板中。培養(yǎng)繁殖各個克隆以備凍存、核酸分離和hEPO產(chǎn)量定量分析之用。
通過氨甲蝶呤選擇而分離含有擴增dhfr序列的細胞將在用pREPO18轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生hEPO的被擊靶G418r細胞系以各種細胞密度鋪板，以在氨甲蝶呤(MTX)中進行選擇。在用某種MTX濃度進行選擇后出現(xiàn)新克隆時，則對其測定hEPO產(chǎn)量，并在更高的MTX濃度(通常為原濃度的兩倍)中以各種細胞密度重新鋪板。重復上述過程直到達到所需的hEPO產(chǎn)量為止。在每一步的MTX抗性選擇中，分離DNA和RNA，分別進行Southern和Northern印跡分析。
表達EPO的克隆的特征用具有兩種不同dhfr方向的pREPO18轉(zhuǎn)染HT 1080細胞。轉(zhuǎn)染之前，用XbaI消化pREPO18(+)和pREPO18(-)，釋放出一個7.9 kb擊靶片段，它依次含有hEPO外顯子1上游基因組DNA的2.1 kb區(qū)(相對于hEPO ATG起始密碼子從-3891～-1779)、含有dhfr基因的2 kb區(qū)、含neo基因的1.1 kb區(qū)、含有與hGH外顯子1融合的CMV啟動子的1.5kb區(qū)、10 bp的hEPO內(nèi)含子1(含拼接-供體位點)和hEPO外顯子1上游基因組DNA的1.1 kb區(qū)(相對于EPO ATG起始密碼子從-1778～-678)。得自兩個實驗中的轉(zhuǎn)染和擊靶頻率示于表6中。由這些實驗中分離到5個初級G418r克隆。它們經(jīng)培養(yǎng)基增殖以用于hEPO表達的定量分析(表7)。因為pREPO18含有dhfr基因，所以有可能如實施例6所述用MTX選擇含有擊靶構(gòu)建體的擴增拷貝的細胞。用限制性酶和Southern雜交分析所證實的在hEPO基因座位被擊入靶的G418r克隆按所述在MTX中進行分步選擇。
表6 pREPO18在HT 1080細胞中擊靶構(gòu)建體消化DNA 受處理的細胞 G418r集落pREPO18XbaI 3.6×10616,980(-)pREPO18XbaI 3.6×10619,290(+)有hEPO表達 hEPO表達子被分析的子的平板/G418r集落初次克隆39 1/435 141 1/470 4
表7 用pREPO18擊靶的HT 1080細胞系中的hEPO生產(chǎn)細胞系構(gòu)建體 hEPO mU/106細胞/天18B3-147 pREPO18 (+)2475918B3-181 pREPO18 (+)2083118B3-145 pREPO18 (+)1758618B3-168 pREPO18 (+) 529318B3-119 pREPO18 (-) 2881實施例9 在永久化人細胞中激活和擴增內(nèi)源性α-干擾素、GM-CSF、G-CSF和FSHβ基因利用本發(fā)明的方法和DNA構(gòu)建體，能夠激活并擴增許多種內(nèi)源的細胞基因。下面描述了激活和擴增人α-干擾素(白細胞干擾素)、GM-CSF(粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子)、G-CSF(粒細胞集落刺激因子)和FSHβ(卵泡刺激激素β亞單位)基因的一般性策略。
α-干擾素人α-干擾素基因(基因庫序列HUMIFNAA)編碼含有23個氨基酸信號肽的188氨基酸前體蛋白。該基因不含內(nèi)含子。圖11圖示說明激活α-干擾素基因的一種策略。所設計的擊靶構(gòu)建體包括與該基因上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴增的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個拼接-供體位點、一個內(nèi)含子、一個拼接-受體位點和相當于第一擊靶序列下游序列的第二擊靶序列。為了避免不需要的ATG起始密碼子，第二擊靶序列將不應延伸到比相對于正常起始密碼子的-107位更上游。
在所述的策略中，第一和第二擊靶序列在正常的擊靶基因中相互緊鄰，但這并非是必需的(參見下文)。本文描述了可擴增的標志基因和適用于選擇的可選擇標志基因?？蓴U增的標志基因和可選擇的標志基因可以是相同的基因，其位置可顛倒，并且其中一個或兩者可以置于擊靶構(gòu)建體的內(nèi)含子中?？蛇x擇的標志基因是可任選的，而可擴增標志基因僅在需要進行擴增反應時才是必需的。特異性CAP位點的摻入也是任選的。任選地，在擊靶構(gòu)建體中來自另一基因的外顯子序列可以包括3′端至拼接-受體位點和5′端至第二擊靶序列。調(diào)節(jié)區(qū)、CAP位點、拼接-供體位點、內(nèi)含子和拼接受體位點可以作為完整的單位而從人伸長因子-1α(EF-1α；基因庫序列HUMEF1A)基因或巨細胞病毒(CMV；基因庫序列HEHCMVP1)緊靠著早期區(qū)分離出來，或者上述成分由從不同基因分離的合適成分組裝起來。
利用本領域技術(shù)人員已知的重組DNA方法將相當于α-干擾素基因上游區(qū)的基因組DNA可用作擊靶序列和擊靶構(gòu)建體的組裝而進行。如本文所述，許多可選擇的和可擴增的標志基因能用于擊靶構(gòu)建體中，并且激活及擴增反應在許多細胞類型中可有效地進行。利用實施例4所述方法，利用ELISA法測定人α-干擾素方法(BiosourceInternational，Camarillo，CA)可以完成對初級、次級或永久化人細胞的轉(zhuǎn)染及對表達α-干擾素的同源重組體細胞的分離，另外，通過實施例1g和1j所述的PCR篩選法可以鑒定同源重組體細胞。如實施例6所述分離含有可擴增標志基因和被激活的α-干擾素基因位座的擴增拷貝的細胞。
在同源重組體細胞中產(chǎn)生了mRNA前體，它包括外源外顯子、拼接-供體位點、內(nèi)含子、拼接-受體位點、第二擊靶序列和人α-干擾素編碼區(qū)及3′非轉(zhuǎn)譯序列(圖11)。對上述信息進行拼接，將產(chǎn)生能被轉(zhuǎn)譯以生產(chǎn)人α-干擾素的功能性mRNA。
內(nèi)含子的大小及相對于基因編碼區(qū)的調(diào)節(jié)區(qū)的位置是可變的，以使調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)揮最優(yōu)功能。在擊靶構(gòu)建體中可存在多個外顯子。此外，第二擊靶序列在正?；蛑胁豁毦o鄰于第一擊靶序列或在其附近，這樣，在進行同源重組時會刪去部分基因的正常上游區(qū)。
GM-CSF人GM-CSF基因(基因庫序列HUMGMCSFG)編碼含有17氨基酸信號肽的144氨基酸前體蛋白質(zhì)。該基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，且前體的N端50個氨基酸編碼在第一個外顯子中，圖12圖示說明激活GM-CSF基因的策略。在該策略中，擊靶構(gòu)建體被設計為包括與GM-CSF基因的上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴增的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個編碼等同于或在功能上等價于GM-CSF的前50個氨基酸的氨基酸序列的外顯子、一個拼接-供體位點和對應于第一擊靶序列下游序列的第二擊靶序列。利用上述策略，同源重組體細胞產(chǎn)生的mRNA前體，相當于外源外顯子和拼接-供體位點、第二擊靶序列、第二擊靶序列和GM-CSF基因的起始密碼子之間的任何序列及GM-CSF基因的外顯子、內(nèi)含子和3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)(圖11)。對上述信息進行拼接導致內(nèi)源GM-CSF基因的外顯子2與外源外顯子融合，它們在被轉(zhuǎn)譯時產(chǎn)生GM-CSF。
在上述策略中，第一和第二擊靶序列在正常擊靶基因中緊緊相鄰，但這并非必需(參見下文)。本文描述了可擴增的標志基因和適用于選擇的可選擇標志基因?？蓴U增的標志基因和可選擇的標志基因可以是相同的基因，或者其位置可以顛倒?？蛇x擇的標志基因是可任意選擇的，而可擴增的標志基因只在需要進行擴增反應時才是必需的?？蛇x擇的標志基因和/或可擴增的標志基因可定位于擊靶構(gòu)建體中拼接-供體位點與第二擊靶序列之間。特異性CAP位點的摻入是可任選的。調(diào)節(jié)區(qū)、CAP位點和拼接-供體位點可以作為完整的單位從人伸長因子1α(EF-1α；基因庫序列HUMEF1A)基因或巨細胞病毒(CMV；基因庫序列HEHCMVP1)緊靠早期區(qū)中分離出來，或者這些成份可以由從不同基因分離的合適成分(如mMT-1啟動子和CAP位點及得自hGH或hEPO基因的外顯子1和拼接供體位點)組裝起來。
其它可利用方法例如，第一和第二擊靶序列可以相當于GM-CSF基因第一內(nèi)含子中的序列。另外，可以利用類似于對α-干擾素所述的擊靶構(gòu)建體，其中，擊靶構(gòu)建體被設計為包括與GM-CSF基因上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴增的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個拼接-供體位點、一個內(nèi)含子、一個拼接-受體位點和相當于第一擊靶序列下游序列的第二擊靶序列。
在任何情況下第二擊靶序列都不必緊鄰正?；蛑械牡谝粨舭行蛄谢蛟谄涓浇?，這樣的話，在進行同源重組時基因的正常上游區(qū)部分將被刪掉。此外，在擊靶構(gòu)建體中可存在多個非編碼或編碼外顯子。利用本領域技術(shù)人員已知的重組體DNA，對相當于人GM-CSF基因的上游區(qū)或內(nèi)含子區(qū)的基因DNA用作擊靶序列和組裝擊靶構(gòu)建體。如本文所述，許多可選擇的和可擴增的標志基因可被用于擊靶構(gòu)建體中，并且激活過程可以在許多細胞類型中有效地進行。借助實施例4所述方法，使用ELISA測定人GM-CSF方法(R&D Systems。Minneapolis，MN)可以實施初級、次級或永久化人細胞轉(zhuǎn)染和分離表達GM-CSF的同源重組體細胞。另外，利用上述的PCR篩選法可以鑒定同源重組體細胞。分離含有可擴增標志基因和激活的GM-CSF基因位座的擴增拷貝的細胞可按前述方法進行。
G-CSF人G-CSF基因(基因庫序列HUMGCSFG)編碼含有30氨基酸信號肽的204～207氨基酸前體蛋白質(zhì)。該基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子。第一個外顯子編碼信號肽的13個氨基酸。圖13圖示說明激活G-CSF基因的策略。擊靶構(gòu)建體被設計為包括與G-CSF基因上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴增的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個編碼與G-CSF信號肽的前13個氨基酸序列相同或在功能上等價的氨基酸序列的外顯子、一個拼接-供體位點和與第一擊靶序列的下游序列相應的第二擊靶序列。借助于上述策略，同源重組體細胞產(chǎn)生一個mRNA前體，它相應于外源外顯子和拼接-供體位點，第二擊靶序列、G-CSF基因起始密碼子與第二擊靶序列間的任何序列，以及G-CSF基因的外顯子、內(nèi)含子和3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)(圖13)。對上述信息進行拼接導致外源性外顯子與內(nèi)源性G-CSF基因的外顯子2融合，它們在被轉(zhuǎn)譯時將產(chǎn)生G-CSF。用存在于外源性外顯子中的序列能夠?qū)φ-CSF信號肽的前13個氨基酸進行功能性取代，這就使得任何人都能對信號肽進行修飾，并因此蛋白質(zhì)的分泌特性產(chǎn)生。
在上述策略中，第一和第二擊靶序列正常的擊靶基因中是緊鄰的，但這并非必要。第二擊靶序列在正?；蛑胁槐鼐o鄰于第一擊靶序列或在其附近，這樣的話，在進行同源重組時刪去基因的正常上游區(qū)部分?？蓴U增標志基因和可選擇的標志基因可以是相同的基因，或者其位置可以被顛倒?？蛇x擇的標志基因是可任意選擇的，而可擴增的標志基因只在需要進行擴增反應時才必需。可選擇的標志基因和/或可擴增的標志基因可以定位在擊靶構(gòu)建體的拼接-供體位點與第二擊靶序列之間。特異性CAP位點的摻入是可以隨意選擇的。調(diào)節(jié)區(qū)、CAP位點和拼接-供體位點可以作為完整的單位從人伸長因子-1α(EF-1α；基因庫序列HUMEF1A)基因或巨細胞病毒(CMV；基因庫序列HEHCMVP1)緊靠早期區(qū)中分離出來，或者這些成分可以由從不同基因分離的合適成分(如mMT-I啟動子和CAP位點，得自hGH或EPO基因的外顯子1和拼接-供體位點)組裝起來。在擊靶構(gòu)建體中可以使用多個編碼的或非編碼的外源外顯子，只要在進行拼接時，存在于有成熟蛋白質(zhì)的碼內(nèi)的ATG起始密碼子被包括在其中的一個外顯子中即可。
其它可利用的方法，例如第一和第二擊靶序列可以相當于G-CSF基因的第一內(nèi)含子中的序列。另外，可以使用類似于所述α-干擾素的擊靶構(gòu)建體，其中，擊靶構(gòu)建體被設計為包括與G-CSF基因上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴墳的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個拼接-供體位點、一個內(nèi)含子、一個拼接-受體位點和對應于第一擊靶序列下游序列的第二擊靶序列。
用本領域技術(shù)人員已知的重組DNA方法，可將相應于人G-CSF基因的上游區(qū)或內(nèi)含子區(qū)的基因組DNA用作擊靶序列和對擊靶構(gòu)建體的組裝可進行實施。如本文所述，在擊靶構(gòu)建體中可使用許多可選擇和可擴增的標志基因，并且激活過程出可在許多細胞類型中有效地進行。利用實施例4所述方法，使用ELISA測定人G-CSF法(R&DSystems，Minneapolis，MN)可進行初級、次級或永久化人細胞的轉(zhuǎn)染和表達G-CSF的同源重組體細胞的分離，此外，借助于前述的PCR篩選也可鑒定同源重組體細胞。用前述方法分離含有可擴增標志基因和被激活的α-干擾素基因位座的擴增拷貝的細胞。
FSHβ人FSHβ基因(基因庫序列HUMFSH1)編碼含有16氨基酸信號肽的129氨基酸前體蛋白質(zhì)。該基因含有三個個顯子和兩個內(nèi)含子，其中第一外顯子是非編碼的外顯子。用多種策略可以達到對FSHβ的激活。圖14圖示了一種激活策略。在這一策略中，擊靶構(gòu)建體被設計為包括適與FSHβ基因上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴增的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個外顯子、一個拼接-供體位點和相應于第一擊靶序列下游序列的第二擊靶序列。借助于上述策略，同源重組體細胞產(chǎn)生一個mRNA前體，它相當于外源外顯子和拼接-供體位點、第二擊靶序列、第二靶序列和FSHβ基因起始密碼子之間的任何序列，以及FSHβ基因的外顯子、內(nèi)含子和3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)(圖14)。對上述信息進行拼接將導致外源外顯子與內(nèi)源FSHβ基因的外顯子2融合，它們在被轉(zhuǎn)譯時能產(chǎn)生FSHβ。在上述策略中，第一和第二擊靶序列在正常擊靶基因中是緊鄰的，但這并非必需的(參見下文)。
其它可利用的方法，例如第一和第二擊靶序列能夠?qū)贔SHβ基因第一內(nèi)含子中的序列。此外，可以使用類似于對α-干擾素所述的擊靶構(gòu)建體。在這一策略中，擊靶構(gòu)建體被設計為包括與FSHβ基因上游序列同源的第一擊靶序列、一個可擴增的標志基因、一個可選擇的標志基因、一個調(diào)節(jié)區(qū)、一個CAP位點、一個拼接-供體位點、一個內(nèi)含子、一個拼接受體位點和對應于第一擊靶序列下游序列的第二擊靶序列。第二擊靶序列不應延伸至比相對于正常FSHβ轉(zhuǎn)錄起始位點的-40位更上游區(qū)，以避免不需要的ATG起始密碼子。在同源重組體細胞中，所產(chǎn)生的mRNA前體包括外源外顯子、拼接-供體位點、內(nèi)含子、拼接-受體位點、第二擊靶序列和人FSHβ編碼外顯子、內(nèi)含子及3′未轉(zhuǎn)譯序列、對這些信息進行拼接將產(chǎn)生能被轉(zhuǎn)譯為生產(chǎn)人FSHβ的功能性mRNA。內(nèi)含子的大小和因此所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)區(qū)相對于基因編碼區(qū)的位置是可變的，以使調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)揮最優(yōu)功能。
在任何一個激活策略中，第二擊靶序列不必位于緊鄰正?；蛑械牡谝粨舭行蛄谢蛟谄涓浇?，這樣的話，在進行同源重組時，將刪除基因的正常上游區(qū)部分。而且，一個擊靶序列可以是基因的上游，而一個擊靶序列可以存在于FSHβ基因的一個外顯子或內(nèi)含子內(nèi)。
可擴增的標志基因和可選擇的標志基因可以是相同的基因，其位置可以顛倒，并且其中之一或兩者可存在于擊靶構(gòu)建體的內(nèi)含子中。本文描述了可擴增的標志基因和適于選擇的可選擇的標志基因?？蛇x擇的標志基因是可任選的，而可擴增的標志基因只在需要進行擴增反應時才是必需的。特異性CAP位點的摻入是可隨意選擇的。任選地，來自另一基因的外顯子序列可以包括在擊靶構(gòu)建體3′至拼接-受體位點和5′至第二擊靶序列。調(diào)節(jié)區(qū)、CAP位點、外顯子、拼接-供體位點、內(nèi)含子和拼接-受體位點可以作為完整的單位從人伸長因子-1α(EF-1α；基因庫序列HUMEF1A)基因或巨細胞病毒(CMV；基因庫序列HEHCMVP1)緊靠早期區(qū)中分離出來，或者這些成分由從不同基因中分離的合適成分組裝起來。在任何情況下，外源外顯子可與正常FSHβ基因的第一外顯子相同或不同，并且在擊靶構(gòu)建體中可存在多個外顯子。
利用本領域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)，可將相應于FSHβ基因上游區(qū)的基因組DNA用作擊靶序列和擊靶構(gòu)建體可進行組裝。如本文所述，許多可選擇的和可擴增的標志基因可被用于擊靶構(gòu)建體中，并且激活過程可以在許多細胞類型中有效地進行。如果需要的話，可以在表達人糖蛋白α亞單位的細胞類型中生產(chǎn)被激活的FSHβ基因產(chǎn)物，糖蛋白α亞單位的產(chǎn)物與FSHβ基因產(chǎn)物形成雜二聚體。這可以是一個天然存在的細胞株或細胞系。此外，人糖蛋白α亞單位基因(基因庫序列HUMGLYCA1)能與FSHβ基因產(chǎn)物共同表達。而上述共同表達由在適宜啟動子調(diào)控下的人糖蛋白α亞單位基因或cDNA來完成，或者是通過本文所述方法由人糖蛋白α亞單位的激活來完成。利用前述方法使用ELISA測定人FSHβ(Accurate Chemicaland Scientific，Westbury，NY)可以進行對初級、次級或永久化人細胞的轉(zhuǎn)染和對表達FSHβ的同源重組體細胞的分離。另外，利用前述PCR篩選法也可以鑒定同源重組體細胞。如前所述分離含有可擴增的標志基因和被激活的α-干擾素基因位座的擴增拷貝的細胞。
本領域的技術(shù)人員將認識到，或可利用不超出常規(guī)的實驗而能夠確定本文所述發(fā)明的具體實施方案的許多等價物。這類等價物將被所附權(quán)利要求所包括。
權(quán)利要求
1.一種DNA構(gòu)建體，其在DNA構(gòu)建體與細胞染色體DNA內(nèi)的靶位點同源重組時改變細胞內(nèi)的靶基因的表達，DNA構(gòu)建體包括(a)與靶位點同源的導向序列；(b)外源調(diào)節(jié)序列；(c)外顯子；(d)外顯子未配對的3’末端的未配對的剪接供體位點；其中，導向序列與靶位點同源重組后，除了靶基因的所有內(nèi)生外顯子外，細胞的染色體DNA還包括構(gòu)建體-衍生的外顯子，其中靶基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括γ-干擾素，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
2.依據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體衍生外顯子包括與靶基因的第一內(nèi)生外顯子的DNA序列不同的DNA序列。
3.一種DNA構(gòu)建體，其在DNA構(gòu)建體與細胞染色體DNA內(nèi)的靶位點同源重組時，改變細胞內(nèi)的靶基因的表達，DNA構(gòu)建體包括(a)與靶位點同源的導向序列；(b)外源調(diào)節(jié)序列；(c)外顯子；(d)在外顯子3’末端的未配對的剪接供體位點；其中，在導向序列與靶位點同源重組后，(b)-(d)位于靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，其中靶基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括γ-干擾素，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
4.依據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中外顯子包括與靶基因的第一內(nèi)生外顯子的DNA序列不同的DNA序列。
5.依據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼α-半乳糖苷酶。
6.依據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體衍生的外顯子與FSHβ基因的第一外顯子相同。
7.依據(jù)權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體，其中所獲得的細胞表達人類糖蛋白α-亞單位。
8.依據(jù)權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體，其中細胞在外源啟動子的控制下表達人類糖蛋白α-亞單位。
9.依據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中靶基因表達GM-CSF。
10.依據(jù)權(quán)利要求9的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體衍生的外顯子編碼GM-CSF前體蛋白的首先的50個氨基酸。
11.依據(jù)權(quán)利要求9的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體衍生的外顯子編碼包括官能信號肽的序列。
12.依據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼G-CSF。
13.依據(jù)權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體衍生的外顯子編碼G-CSF信號肽的首先的13個氨基酸。
14.一種DNA構(gòu)建體，其在DNA構(gòu)建體與細胞染色體DNA內(nèi)的靶位點同源重組時，改變細胞內(nèi)的靶基因的表達，DNA構(gòu)建體包括(a)與靶位點同源的導向序列；(b)外源調(diào)節(jié)序列；(c)外顯子；(d)外顯子3’末端的未配對剪接-供體位點；其中，在導向序列與靶位點同源重組后，(b)-(d)位于靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，其中外源調(diào)節(jié)序列是腺病毒基因的調(diào)節(jié)序列，膠原質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié)序列，或EF-1α基因的調(diào)節(jié)序列。
15.一種改變細胞內(nèi)靶基因表達的方法，方法包括步驟(a)提供細胞，其基因組包括(i)含有內(nèi)生調(diào)節(jié)區(qū)域的靶基因；(ii)靶位點；(b)提供DNA構(gòu)建體包括(i)與靶位點同源的導向序列；(ii)外源調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)外顯子3’末端的未配對的剪接供體位點；(c)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(d)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，除了靶基因的所有內(nèi)生外顯子外，其基因組包括外源調(diào)節(jié)序列，構(gòu)建體衍生外顯子和構(gòu)建體衍生剪接供體位點；(e)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄的條件下，在外源調(diào)節(jié)序列的控制下，產(chǎn)生構(gòu)建體衍生外顯子，靶基因和位于構(gòu)建體衍生外顯子和靶基因之間的任何序列的轉(zhuǎn)錄體，其中對應于構(gòu)建體衍生剪接供體位點的轉(zhuǎn)錄體RNA與在靶基因內(nèi)對應于一個位點的轉(zhuǎn)錄體的剪接受體位點定向剪接，其中靶基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
16.依據(jù)權(quán)利要求15的方法，進一步包括步驟(f)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄體剪接和翻譯的條件下；(g)證實產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄體的翻譯產(chǎn)品。
17.一種改變細胞內(nèi)靶基因表達的方法，方法包括步驟(a)提供細胞，其基因組包括(i)含有內(nèi)生調(diào)節(jié)區(qū)域的靶基因；(ii)靶位點；(b)提供DNA構(gòu)建體包括(i)與靶位點同源的導向序列；(ii)外源調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)外顯子3’末端的未配對的剪接供體位點；(c)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(d)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，其基因組包括外源調(diào)節(jié)序列，構(gòu)建體衍生外顯子和構(gòu)建體衍生剪接供體位點，所有都位于靶基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游；(e)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄的條件下，在外源調(diào)節(jié)序列的控制下，產(chǎn)生構(gòu)建體衍生外顯子，靶基因和位于構(gòu)建體衍生外顯子和靶基因之間的任何序列的轉(zhuǎn)錄體，其中對應于構(gòu)建體衍生剪接供體位點的轉(zhuǎn)錄體RNA與在靶基因內(nèi)對應于一個位點的轉(zhuǎn)錄體的剪接受體位點定向剪接，其中靶基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
18.依據(jù)權(quán)利要求17的方法，進一步包括步驟(f)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄體剪接和翻譯的條件下；(g)證實產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄體的翻譯產(chǎn)品。
19.一種改變細胞內(nèi)靶基因表達的方法，方法包括步驟(a)提供細胞，其基因組包括(i)含有內(nèi)生調(diào)節(jié)區(qū)域的靶基因；(ii)靶位點；(b)提供DNA構(gòu)建體包括(i)與靶位點同源的導向序列；(ii)外源調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)外顯子3’末端的未配對的剪接供體位點；(c)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(d)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，其基因組包括外源調(diào)節(jié)序列，構(gòu)建體衍生外顯子和構(gòu)建體衍生剪接供體位點，所有都位于靶基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游；(e)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄的條件下，在外源調(diào)節(jié)序列的控制下，產(chǎn)生構(gòu)建體衍生外顯子，靶基因和位于構(gòu)建體衍生外顯子和靶基因之間的任何序列的轉(zhuǎn)錄體，其中對應于構(gòu)建體衍生剪接供體位點的轉(zhuǎn)錄體RNA與在靶基因內(nèi)對應于一個位點的轉(zhuǎn)錄體的剪接受體位點定向剪接，其中外源調(diào)節(jié)序列是腺病毒基因的調(diào)節(jié)序列，膠原質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié)序列，或EF-1α基因的調(diào)節(jié)序列。
20.依據(jù)權(quán)利要求19的方法，進一步包括步驟(f)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄體剪接和翻譯的條件下；(g)證實產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄體的翻譯產(chǎn)品。
21.一種培養(yǎng)的脊椎動物細胞，在其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，其中轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，和在外源外顯子3’末端的剪接供體位點，所有都位于內(nèi)生基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，剪接供體位點與內(nèi)生基因的第二內(nèi)生外顯子的內(nèi)生剪接受體位點可操作地結(jié)合，其中內(nèi)生基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
22.一種培養(yǎng)的脊椎動物細胞，在其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，和在外源外顯子3’末端的剪接供體位點，剪接供體位點與內(nèi)生基因的第二內(nèi)生外顯子的內(nèi)生剪接受體位點可操作地結(jié)合，其中除了存在于內(nèi)生基因中的所有內(nèi)生外顯子外，細胞還包括外源外顯子，其中內(nèi)生基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
23.依據(jù)權(quán)利要求22的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是從下列組中選取的，包括HT1080細胞，HeLa細胞，HeLa細胞衍生物，MCF-7乳腺癌細胞，K-562白血病細胞，KB癌細胞，2780AD卵巢癌細胞，Raji細胞，Jurkat細胞，Namalwa細胞，HL-60細胞，Daudi細胞，RPMI 8226細胞，U-937細胞，Bows黑素瘤細胞，WI-38VA13亞種系細胞和MOLT-4細胞。
24.依據(jù)權(quán)利要求22的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中外源調(diào)節(jié)序列是腺病毒基因的調(diào)節(jié)序列，膠原質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié)序列，或EF-1α基因的調(diào)節(jié)序列。
25.一種DNA構(gòu)建體，其在DNA構(gòu)建體與細胞染色體DNA內(nèi)的靶位點同源重組時，改變細胞內(nèi)的靶基因的表達，靶位點位于靶基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，DNA構(gòu)建體包括(a)與靶位點同源的導向序列；(b)外源調(diào)節(jié)序列；(c)外顯子；(d)剪接供體位點；(e)內(nèi)含子；(f)剪接受體位點；其中，由于同源重組，外源調(diào)節(jié)序列定位控制包括(c)-(f)的序列和靶基因的全部編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
26.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中在同源重組后，(b)-(f)位于靶基因的內(nèi)生調(diào)節(jié)序列的上游。
27.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中構(gòu)建體進一步包括與靶基因的內(nèi)生調(diào)節(jié)序列的上游序列同源的第二導向序列。
28.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼治療性蛋白質(zhì)。
29.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼激素，細胞因子，抗原，抗體，酶，凝血因子，運輸?shù)鞍踪|(zhì)，受體，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或轉(zhuǎn)錄因子。
30.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括調(diào)鈣素，生長激素，胰島素，促胰島素，類胰島素生長因子，甲狀旁腺激素，α-干擾素，β-干擾素，γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，免疫球蛋白，催化抗體，蛋白激酶C，葡糖腦苷脂酶，過氧化物歧化酶，組織血纖維蛋白溶酶激活劑，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子VIII，血液凝血因子IX，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，脫脂蛋白E，脫脂蛋白A-I，珠蛋白，低密度脂蛋白受體，IL-2受體，IL-2拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，免疫反應修飾劑和可溶CD4。
31.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼α-半乳糖苷酶。
32.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼α-干擾素。
33.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼葡糖腦苷脂酶。
34.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中外源調(diào)節(jié)序列是啟動子，增強子，骨架-連接區(qū)域，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
35.依據(jù)權(quán)利要求34的DNA構(gòu)建體，進一步包括第二調(diào)節(jié)序列。
36.依據(jù)權(quán)利要求34的DNA構(gòu)建體，其中外源調(diào)節(jié)序列是腺病毒基因的調(diào)節(jié)序列，SV-40基因的調(diào)節(jié)序列，或細胞巨化病毒基因的調(diào)節(jié)序列。
37.依據(jù)權(quán)利要求34的DNA構(gòu)建體，其中調(diào)節(jié)序列是鼠金屬硫因-I基因的調(diào)節(jié)序列，膠原質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié)序列，或EF-1α基因的調(diào)節(jié)序列。
38.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，進一步包括一個基因。
39.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，進一步包括一個或多個可選取的標記基因。
40.依據(jù)權(quán)利要求39的DNA構(gòu)建體，進一步包括一個可擴增的標記基因。
41.一種改變細胞基因組中靶基因表達的方法，包括步驟(a)用DNA構(gòu)建體將細胞轉(zhuǎn)染，DNA構(gòu)建體包括(i)導向序列；(ii)外源調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)剪接供體位點；(v)內(nèi)含子；(vi)剪接受體位點，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(b)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，細胞中外源調(diào)節(jié)序列定位控制包括(iii)-(vi)的序列和靶基因編碼序列的轉(zhuǎn)錄。(c)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄的條件下，在外源調(diào)節(jié)序列的控制下，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄體。
42.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中外顯子包括CAP位點。
43.依據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中外顯子包括核苷酸序列ATG。
44.一種融合蛋白質(zhì)，依據(jù)權(quán)利要求43制備并含有由DNA構(gòu)建體的外顯子編碼的第一氨基酸序列和由靶基因編碼的第二氨基酸序列。
45.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中導向序列與靶基因的內(nèi)生調(diào)節(jié)序列的上游序列同源。
46.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中構(gòu)建體進一步包括與靶基因的內(nèi)生調(diào)節(jié)序列的上游序列同源的第二導向序列。
47.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中細胞是人類細胞。
48.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼治療性蛋白質(zhì)。
49.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼激素，細胞因子，抗原，抗體，酶，凝血因子，運輸?shù)鞍踪|(zhì)，受體，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或轉(zhuǎn)錄因子。
50.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括調(diào)鈣素，生長激素，胰島素，促胰島素，類胰島素生長因子，甲狀旁腺激素，α-干擾素，β-干擾素，γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，免疫球蛋白，催化抗體，蛋白激酶C，葡糖腦苷脂酶，過氧化物歧化酶，組織血纖維蛋白溶酶激活劑，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子VIII，血液凝血因子IX，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，脫脂蛋白E，脫脂蛋白A-I，珠蛋白，低密度脂蛋白受體，IL-2受體，IL-2拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，免疫反應修飾劑和可溶CD4。
51.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼α-半乳糖苷酶。
52.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼α-干擾素。
53.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼葡糖腦苷脂酶。
54.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中外源調(diào)節(jié)序列是啟動子，增強子，骨架-連接區(qū)域，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
55.依據(jù)權(quán)利要求54的方法，進一步包括第二調(diào)節(jié)序列。
56.依據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中外源調(diào)節(jié)序列是腺病毒基因的調(diào)節(jié)序列，SV-40基因的調(diào)節(jié)序列，或細胞巨化病毒基因的調(diào)節(jié)序列。
57.依據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中調(diào)節(jié)序列是鼠金屬硫因-I基因的調(diào)節(jié)序列，膠原質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié)序列，或EF-1α基因的調(diào)節(jié)序列。
58.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，進一步包括步驟(f)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄體剪接和翻譯的條件下；(g)證實產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄體的翻譯產(chǎn)品。
59.依據(jù)權(quán)利要求58制備的葡糖腦苷脂酶。
60.一種培養(yǎng)的脊椎動物細胞，在其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，其中轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，剪接供體位點，內(nèi)含子，和剪接受體位點，所有都位于內(nèi)生基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，這樣外源調(diào)節(jié)序列定位控制包括外源外顯子，剪接供體位點，內(nèi)含子，剪接受體位點的序列和靶基因編碼序列的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄體。
61.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中外源外顯子包括CAP位點。
62.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，和剪接供體位點在內(nèi)生基因的編碼序列的上游。
63.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因的內(nèi)生調(diào)節(jié)序列是缺失的。
64.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因的第一內(nèi)生外顯子是缺失的。
65.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼激素，細胞因子，抗原，抗體，酶，凝血因子，運輸?shù)鞍踪|(zhì)，受體，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，或轉(zhuǎn)錄因子。
66.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括調(diào)鈣素，生長激素，胰島素，促胰島素，類胰島素生長因子，甲狀旁腺激素，α-干擾素，β-干擾素，γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，免疫球蛋白，催化抗體，蛋白激酶C，葡糖腦苷脂酶，過氧化物歧化酶，組織血纖維蛋白溶酶激活劑，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子VIII，血液凝血因子IX，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，脫脂蛋白E，脫脂蛋白A-I，珠蛋白，低密度脂蛋白受體，IL-2受體，IL-2拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，免疫反應修飾劑和可溶CD4。
67.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼α-干擾素。
68.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼α-半乳糖苷酶。
69.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼葡糖腦苷脂酶。
70.一種植物或真菌源培養(yǎng)細胞，在其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，其中轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，剪接供體位點，內(nèi)含子，和剪接受體位點，所有都位于內(nèi)生基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，這樣外源調(diào)節(jié)序列定位控制包括外源外顯子，剪接供體位點，內(nèi)含子，剪接受體位點的序列和靶基因編碼序列的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄體。
71.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是哺乳動物細胞。
72.依據(jù)權(quán)利要求71的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是原生或次生哺乳動物細胞。
73.依據(jù)權(quán)利要求71的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是原生或次生人類細胞。
74.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是無限增殖化哺乳動物細胞。
75.依據(jù)權(quán)利要求74的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是無限增殖化人類細胞。
76.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是從下列組中選取的，包括HeLa細胞，HeLa細胞衍生物，MCF-7乳腺癌細胞，K-562白血病細胞，KB癌細胞，2780AD卵巢癌細胞，Raji細胞，Jurkat細胞，Namalwa細胞，HL-60細胞，Daudi細胞，RPMI 8226細胞，U-937細胞，Bows黑素瘤細胞，WI-38VA13亞種系細胞和MOLT-4細胞。
77.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞是HT1080細胞。
78.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中細胞表達治療性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)錄體翻譯制備。
79.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中外源調(diào)節(jié)序列是啟動子，增強子，骨架-連接區(qū)域，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
80.依據(jù)權(quán)利要求79的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中外源調(diào)節(jié)序列是腺病毒基因的調(diào)節(jié)序列，SV-40基因的調(diào)節(jié)序列，或細胞巨化病毒基因的調(diào)節(jié)序列。
81.依據(jù)權(quán)利要求79的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中外源調(diào)節(jié)序列是鼠金屬硫因-I基因的調(diào)節(jié)序列，膠原質(zhì)基因的調(diào)節(jié)序列，肌動蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，免疫球蛋白基因的調(diào)節(jié)序列，HMG-CoA還原酶基因的調(diào)節(jié)序列，或EF-1α基因的調(diào)節(jié)序列。
82.一種制備同源重組細胞的方法，包括步驟(a)提供細胞，其基因組包括(i)含有內(nèi)生調(diào)節(jié)區(qū)域的靶基因；(ii)在靶基因內(nèi)或上游的靶位點；(b)提供DNA構(gòu)建體，包括(i)與靶位點同源的導向序列；(ii)外源調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)剪接供體位點；(v)內(nèi)含子；(vi)剪接受體位點，(c)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(d)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，除了靶基因的所有內(nèi)生外顯子外，細胞基因組包括(ii)-(vi)。
83.依據(jù)權(quán)利要求82的方法制備的同源重組細胞。
84.一種改變細胞內(nèi)靶基因表達的方法，包括步驟(a)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，構(gòu)建體包括(i)導向序列；(ii)調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)剪接供體位點；(v)內(nèi)含子；(vi)剪接受體位點，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(b)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，在其中外源調(diào)節(jié)序列定位控制包括(iii)-(vi)的序列和靶基因全部編碼序列的轉(zhuǎn)錄；(c)將同源重組細胞保持在適于外源調(diào)節(jié)序列表達的條件下。
85.一種改變細胞內(nèi)靶基因表達的方法，包括步驟(a)提供細胞，其基因組包括(i)靶基因；(ii)在靶基因內(nèi)或上游的靶位點；(b)提供DNA構(gòu)建體，包括(i)與靶位點同源的導向序列；(ii)從哺乳動物肌動蛋白或膠原質(zhì)基因獲得的啟動子；(c)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(d)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，細胞的基因組含有定位啟動子控制靶基因的轉(zhuǎn)錄；(e)將同源重組細胞保持在在啟動子控制下適于靶基因轉(zhuǎn)錄的條件下。
86.一種培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其基因組中摻入含有外源或膠原質(zhì)啟動子的定位控制內(nèi)生基因轉(zhuǎn)錄的新型轉(zhuǎn)錄單位，其中內(nèi)生基因既不編碼肌動蛋白也不編碼膠原質(zhì)。
87.一種改變細胞染色體內(nèi)靶基因表達的方法，包括步驟(a)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，包括(i)與靶基因的編碼區(qū)域內(nèi)或上游的基因組DNA同源的導向序列；(ii)肌動蛋白或膠原質(zhì)啟動子；(iii)外顯子；(iv)外顯子3’末端的未配對的剪接供體位點；從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(b)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞；(c)將同源重組細胞保持在啟動子控制下的適于靶基因表達的條件下。
88.一種通過改變細胞內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的靶基因的表達制備蛋白質(zhì)的方法，包括步驟(a)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，DNA構(gòu)建體包括(i)與靶基因的編碼區(qū)域內(nèi)或上游的基因組DNA同源的導向序列；(ii)肌動蛋白或膠原質(zhì)啟動子；從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(b)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞；(c)將同源重組細胞保持在啟動子控制下的適于蛋白質(zhì)表達的條件下，其中靶基因既不編碼肌動蛋白也不編碼膠原質(zhì)。
89.一種給哺乳動物提供蛋白質(zhì)的方法，包括給哺乳動物細胞引入權(quán)利要求22-24的任何一個的細胞，其中內(nèi)生基因編碼蛋白質(zhì)。
90.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細胞在引入到哺乳動物前封存在允許蛋白質(zhì)從屏障裝置內(nèi)部向屏障裝置外部通過的屏障裝置內(nèi)。
91.依據(jù)權(quán)利要求90的方法，其中屏障裝置可防止細胞從屏障裝置中溢出。
92.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中DNA構(gòu)建體進一步包括編碼可擴增標記的，可選取含有多拷貝編碼可擴增標記序列的細胞的序列；在引入到哺乳動物前，將細胞在選取含有多拷貝編碼可擴增標記序列的細胞的條件下培養(yǎng)。
93.依據(jù)權(quán)利要求92的方法，其中可擴增標記是從下列組中選取的，包括二氫葉酸還原酶，腺苷脫氨酶，三官能酶-氨甲酰磷酸合成酶-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和二氫乳清酸酶(CAD)。
94.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細胞是人類細胞。
95.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細胞是原生或次生細胞。
96.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細胞是無限增殖化細胞。
97.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細胞是哺乳動物成纖維細胞。
98.依據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中細胞是人類成纖維細胞的原生或次生細胞。
99.一種制備蛋白質(zhì)的方法，包括(a)提供HT1080細胞，含有包括與編碼蛋白質(zhì)的序列可操作地結(jié)合的外源調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA，(b)在適于制備蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)細胞，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，(c)證實產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，其中，蛋白質(zhì)是從下列組中選取的，包括α-干擾素，β-干擾素，γ-干擾素，神經(jīng)生長因子，F(xiàn)SHβ，TGF-β，腫瘤壞死因子，胰高血糖素，骨生長因子-2，骨生長因子-7，TSH-β，白細胞介素1，白細胞介素2，白細胞介素3，白細胞介素6，白細胞介素11，白細胞介素12，GSF-粒細胞(G-CSF)，CSF-巨噬細胞(M-CSF)，CSF-粒細胞/巨噬細胞(GM-CSF)，蛋白激酶C，尿激酶，抗凝血酶III，DNA-se，α-半乳糖苷酶，酪氨酸羥化酶，血液凝血因子V，血液凝血因子VII，血液凝血因子X，血液凝血因子XIII，IL-2拮抗劑和可溶CD4。
100.依據(jù)權(quán)利要求99的方法，其中包括(i)外源調(diào)節(jié)區(qū)域；(ii)編碼蛋白質(zhì)的序列，的DNA通過轉(zhuǎn)染引入到HT1080細胞的前體中。
101.依據(jù)權(quán)利要求99的方法，其中蛋白質(zhì)是血液凝血因子VIII。
102.依據(jù)權(quán)利要求99的方法，其中蛋白質(zhì)是血液凝血因子IX。
103.DNA質(zhì)粒pREPO18。
104.依據(jù)權(quán)利要求25的DNA構(gòu)建體，其中靶基因編碼促血紅細胞生成素。
105.依據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中靶基因編碼促血紅細胞生成素。
106.依據(jù)權(quán)利要求60的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼促血紅細胞生成素。
107.一種培養(yǎng)的植物或真菌源細胞，其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，其中轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，和外源外顯子的3’末端的剪接供體位點，所有都位于內(nèi)生基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，剪接供體位點與內(nèi)生基因的第二內(nèi)生外顯子的內(nèi)生剪接受體位點可操作地結(jié)合。
108.一種給哺乳動物提供蛋白質(zhì)的方法，包括給哺乳動物引入權(quán)利要求60-81，83，86，和107的任何一個的細胞，其中內(nèi)生基因編碼蛋白質(zhì)。
109.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中細胞在引入到哺乳動物前封存在允許蛋白質(zhì)從屏障裝置內(nèi)部向屏障裝置外部通過的屏障裝置內(nèi)。
110.依據(jù)權(quán)利要求109的方法，其中屏障裝置可防止細胞從屏障裝置中溢出。
111.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中DNA構(gòu)建體進一步包括編碼可擴增標記的，可選取含有多拷貝編碼可擴增標記序列的細胞的序列；在引入到哺乳動物前，將細胞在選取含有多拷貝編碼可擴增標記序列的細胞的條件下培養(yǎng)。
112.依據(jù)權(quán)利要求111的方法，其中可擴增標記是從下列組中選取的，包括二氫葉酸還原酶，腺苷脫氨酶，三官能酶-氨甲酰磷酸合成酶-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶和二氫乳清酸酶(CAD)。
113.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中細胞是人類細胞。
114.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中細胞是原生或次生細胞。
115.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中細胞是無限增殖化細胞。
116.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中細胞是哺乳動物成纖維細胞。
117.依據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中細胞是人類成纖維細胞的原生或次生細胞。權(quán)利要求118-132對應取消的權(quán)利要求57-71。
118.一種融合蛋白，通過改變細胞內(nèi)靶基因表達的方法制備，方法包括步驟(a)提供細胞，其基因組包括(i)含有內(nèi)生調(diào)節(jié)區(qū)域的靶基因；(ii)靶位點；(b)提供DNA構(gòu)建體，包括(i)與靶位點同源的導向序列；(ii)外源調(diào)節(jié)序列；(iii)外顯子；(iv)編碼可擴增標記的，可選取含有多拷貝編碼可擴增標記的序列的細胞的序列；(v)在外顯子3’末端未配對的剪接供體位點，(c)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)染細胞；(d)將轉(zhuǎn)染細胞保持在適于同源重組的條件下，從而產(chǎn)生同源重組細胞，除了靶基因的所有外顯子外，細胞的基因組還包括外源調(diào)節(jié)序列，構(gòu)建體衍生外顯子，和構(gòu)建體衍生剪接供體位點；(e)將同源重組細胞在選取含有多拷貝編碼可擴增標記的序列的細胞的條件下培養(yǎng)；(f)將同源重組細胞保持在外源調(diào)節(jié)序列控制下適于轉(zhuǎn)錄的條件下，產(chǎn)生構(gòu)建體衍生外顯子，靶基因，和存在于構(gòu)建體衍生外顯子和靶基因之間的任何序列的轉(zhuǎn)錄體，其中對應構(gòu)建體衍生剪接供體位點的轉(zhuǎn)錄體RNA與對應于靶基因內(nèi)一個位點的轉(zhuǎn)錄體中剪接受體位點定向剪接；(g)將同源重組細胞保持在適于轉(zhuǎn)錄體剪接和翻譯的條件下；(h)證實產(chǎn)生了轉(zhuǎn)錄體的翻譯產(chǎn)品，其中融合蛋白含有由構(gòu)建體衍生外顯子編碼的第一氨基酸序列和由部分或全部靶基因編碼的第二氨基酸序列，第一氨基酸序列不同于由靶基因的第一內(nèi)生外顯子編碼的氨基酸序列。
119.依據(jù)權(quán)利要求118的融合蛋白，其中靶基因是促血紅細胞生成素。
120.依據(jù)權(quán)利要求118的融合蛋白，其序列包括人類生長激素信號肽的氨基酸1-3。
121.一種培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，其中轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，和外源外顯子的3’末端的剪接供體位點，剪接供體位點與內(nèi)生基因的第二內(nèi)生外顯子的內(nèi)生剪接受體位點可操作地結(jié)合，其中細胞包括構(gòu)建體衍生的可擴增標記基因。
122.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼從下列組中選取的蛋白質(zhì)，包括調(diào)鈣素，胰島素，促胰島素，類胰島素生長因子，甲狀旁腺激素，神經(jīng)生長因子，白細胞介素，免疫球蛋白，催化抗體，過氧化物歧化酶，組織血纖維蛋白溶酶激活劑，血液凝血因子VIII，脫脂蛋白E，脫脂蛋白A-I，珠蛋白，低密度脂蛋白受體，IL-2受體，IL-2受體拮抗劑，α-1抗胰蛋白酶，免疫反應修飾劑。
123.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼生長激素。
124.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼干擾素。
125.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼血液凝血因子IX。
126.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼葡糖腦苷脂酶，
127.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼集落刺激因子。
128.依據(jù)權(quán)利要求121的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼促血紅細胞生成素。
129.一種培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其基因組中摻入轉(zhuǎn)錄單位，其中轉(zhuǎn)錄單位包括外源調(diào)節(jié)序列，外源外顯子，和外源外顯子的3’末端的剪接供體位點，所有都位于內(nèi)生基因的內(nèi)生轉(zhuǎn)錄起始的上游，剪接供體位點與內(nèi)生基因的第二內(nèi)生外顯子的內(nèi)生剪接受體位點可操作地結(jié)合，其中細胞是從下列組中選取的，包括Raji細胞，Jurkat細胞，Namalwa細胞，HL-60細胞，Daudi細胞，RPMI 8226細胞，U-937細胞，Bows黑素瘤細胞，WI-38VA13亞種系細胞和MOLT-4細胞。
130.一種給哺乳動物提供蛋白質(zhì)的方法，包括給哺乳動物引入權(quán)利要求121-129的任何一個的培養(yǎng)的脊椎動物細胞，其中內(nèi)生基因編碼蛋白質(zhì)。
131.依據(jù)權(quán)利要求130的方法，其中培養(yǎng)的脊椎動物細胞在引入到哺乳動物前封存在允許蛋白質(zhì)從屏障裝置內(nèi)部向屏障裝置外部通過的屏障裝置內(nèi)。
132.依據(jù)權(quán)利要求131的方法，其中屏障裝置可防止細胞從屏障裝置中溢出。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有下述成分的構(gòu)建體:a)擊靶序列;b)調(diào)節(jié)序列;c)外顯子和d)未配對的拼接－供體位點。本發(fā)明還涉及體外或體內(nèi)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法,該方法包括在細胞中同源重組上述構(gòu)建體。然后在允許轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯的條件下維持該同源重組體細胞,而導致蛋白質(zhì)的表達。本發(fā)明還涉及同源重組體細胞,包括初級、次級或永久化脊椎動物細胞,制備這些細胞的方法、同源重組以產(chǎn)生融合基因的方法,改變細胞中基因表達的方法,以及采用本發(fā)明的構(gòu)建體于細胞中制造蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C12N15/63GK1346887SQ01136069
公開日2002年5月1日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月13日
發(fā)明者道格拉斯·A·特科, 邁克爾·W·哈特林, 理查德·F·塞爾登 申請人:轉(zhuǎn)移染色體治療公司