專利名稱：蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及使用穩(wěn)定的和感受態(tài)的人肝細胞系的最優(yōu)化的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。
背景自二十世紀早期以來在科學和醫(yī)學界就已經(jīng)了解治療蛋白了，但是從組織或尿中獲得的少量蛋白使得替代治療難以進行，如果不是不可能的話。在1980年代，基因組技術(shù)上的進步已直接地促進了對負責生產(chǎn)大量潛在治療蛋白(‘生物治療藥物’)的基因的鑒定、分離和表征。
重組DNA技術(shù)使得可以大規(guī)模制造和生產(chǎn)許多治療蛋白質(zhì)。該方法可使用原核或真核來源的細胞進行擴增。任何蛋白的功能和效率，以治療蛋白為代表，主要依賴于基因序列；然而，幾種對蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在蛋白發(fā)揮最大功效的能力上可能起著極其重大的作用。
翻譯后修飾(PTMs)改變了氨基酸(蛋白質(zhì)的構(gòu)建模塊)側(cè)鏈基團的性質(zhì)，這樣其就改變了蛋白的功能?？偟卣f來，這些翻譯后修飾對蛋白最后的結(jié)構(gòu)和功能貢獻很大。因此，當制備用于人的治療蛋白時，對蛋白進行人模式的翻譯后修飾被認為是很重要的。
工業(yè)例子最初在原核細胞中生產(chǎn)的EPO是無效的，因為細菌宿主對其轉(zhuǎn)染的人的基因產(chǎn)物的翻譯后修飾模式既不正確也不足以給藥物提供合適水平的臨床效用。因此，決定在哺乳動物但非人細胞中生產(chǎn)EPO在所述藥物發(fā)展歷程中寫下了重要一筆。
天然的和重組的治療蛋白之間的已知差異關(guān)于正確的PTMs在生物治療藥物的生物學活性/治療功效方面的報道非常多，特別是在臨床進展上，新的生物治療藥物分子可以用即將到來的洪水來形容。下列是一些報道的研究例子。
重組糖蛋白的糖基化(主要的PTM)可深深地影響其生物學活性，包括循環(huán)清除速率，并且正確糖基化的重組蛋白具有比非正確糖基化的結(jié)構(gòu)顯著更長的血清半壽期(Chitlaru T，Kronman C，Zeevi M，KamM，Harel A，Ordentlich A，Velan B，Shafferman A(1998).Modulation of circulatory residence of recombinantacetylcholinesterase through biochemical or geneticmanipulation of sialylation levels.Biochem J 1998 336647-658.)。
重要的術(shù)語天然蛋白在不存在任何操作或基因工程的情況下，在天然生理條件下由給定的組織、器官、細胞常規(guī)合成的蛋白。
重組蛋白在通過細胞或生物體的基因工程改造后獲得的基因產(chǎn)物(蛋白)。
Misaizu T，Matsuki S，Strickland TW，Takeuchi M，Kobata A，Takasaki S((1995).Role of antennary structure of N-linkedsugar chains in renal handling of recombinant humanerythropoietin.Blood 864097-4104.)發(fā)現(xiàn)人重組促紅細胞生成素(EPO)糖基化的本質(zhì)和程度深深地影響其在體內(nèi)的活性。不正確的糖基化模式使總的身體清除速率增加超過三倍并導致非常低的刺激紅細胞祖先細胞的活性。
在許多情況下，天然和重組糖蛋白之間、不同細胞系表達的重組形式之間和來自不同器官的相關(guān)糖蛋白之間在糖基化上有顯著不同。Landberg E，Pahlsson P，Krotkiewski H，Stromqvist M，Hansson L，Lundblad A((1997).Glycosylation of bile-salt-stimulatedlipase from human milkcomparison of native and recombinantforms.Arch Biochem Biophys 34494-102.)發(fā)現(xiàn)來自人奶的膽汁鹽刺激的脂肪酶(BSSL)的天然和重組形式的糖基化不同。天然BSSL包含高含量的A2F家族N-聚糖而在CHO或小鼠成纖維細胞系中表達的重組形式主要具有A2家族聚糖。
Jacquinot PM，Leger D，Wieruszeski JM，Coddeville B，Montreuil J，Spik G((1994).Change in glycosylation of chickentransferrin glycans biosynthesized during embryogenesis andprimary culture of embryo hepatocytes.Glycobiology 4617-624.)研究來自雞血清、雞胚胎血清和來自原代培養(yǎng)中的雞胚胎肝細胞的培養(yǎng)基中的運鐵蛋白的寡糖時發(fā)現(xiàn)其各具有不同的糖基化模式。
Tanigawara Y，Hori R，Okumura K，Tsuji J，Shimizu N，NomaS，Suzuki J，Livingston DJ，Richards SM，Keyes LD等人((1990).Pharmacokinetics in chimpanzees of recombinant humantissue-type plasminogen activator produced in mouse C127 andChinese hamster ovary cells.Chem Pharm Bull(Tokyo)1990 Feb；38(2)517-22)證明兩種具有不同糖結(jié)構(gòu)的r-tPA’s(重組組織纖溶酶原激活劑)制劑顯現(xiàn)不同的藥物動力學，強烈地暗示著糖結(jié)構(gòu)可影響t-PA的生物學活性，從而影響治療功效。
為什么是天然的蛋白？缺乏正確人翻譯后修飾的重組蛋白可引起中和抗體，導致功效降低。此外，重組產(chǎn)生的蛋白通常很快地被從循環(huán)系統(tǒng)中清除，需要經(jīng)常的注射或聚乙二醇化以延長半壽期。生產(chǎn)“聚乙二醇化”蛋白非常昂貴并且可能失去其的部分生物學活性，達到相同的功效需要更高的劑量。
相反地，來自人組織的天然蛋白完全是人糖基化的，提供了具有優(yōu)于目前治療物的明顯的活性/功效/安全有利方面由于在最終的蛋白產(chǎn)物上存在天然發(fā)生的聚糖結(jié)構(gòu)和亞型以及其它翻譯后修飾，導致其更好和更廣泛的功效，更加滿足人的治療要求；由于更低的劑量導致顯著更少的副作用；由于正確的PTMs導致在循環(huán)系統(tǒng)中更長的半壽期和較小的過敏反應；由于多個蛋白提取物來自單個細胞來源和生產(chǎn)過程導致更低的生產(chǎn)成本；由于使用單個永生化人細胞系和單一生產(chǎn)過程導致更低的調(diào)節(jié)障礙。
相對于產(chǎn)生于細菌的非糖基化的重組蛋白，糖基化蛋白更長的半壽期導致較少注射頻率。
工業(yè)例子II型糖原貯積病(GSDII)是由于蛋白質(zhì)GAA(酸性α-葡糖苷酶)(糖原降解溶酶體酶)缺陷造成的常染色體隱性疾病。
該缺陷導致在幾乎所有的身體組織中普便沉積溶酶體糖原并且最終可在兩歲前導致心力衰竭(因此GSDII是個威脅生命的病癥)。
目前對所述疾病的治療包括通過給患者注射重組蛋白來修復缺陷，所述重組蛋白制備自培養(yǎng)的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或分泌自兔子的奶中，所述兔子攜帶在奶特異性啟動子控制下的生產(chǎn)所述蛋白的轉(zhuǎn)基因。
這兩種產(chǎn)生的重組蛋白在其被吸收入靶組織和在靶組織中所發(fā)揮的功能都極其不足。
NIH(美國國立衛(wèi)生研究所)宣布了涉及肝細胞(無論培養(yǎng)的或體內(nèi)的)在生產(chǎn)天然人GAA中的用途的新技術(shù)。
所述NIH方法使用人肝細胞通過正確的糖基化在細胞中產(chǎn)生正確翻譯后修飾的酶，因此產(chǎn)生了能夠被輕易吸收和定位在靶組織中的優(yōu)良的酶。當?shù)竭_靶細胞后，所述酶降解存在于溶酶體中的糖原。
由肝細胞天然產(chǎn)生的蛋白肝臟是最有前景的提供生產(chǎn)型細胞的器官/組織之一，所述生產(chǎn)型細胞具有廣譜的遞送具有治療目的的天然蛋白的潛力，所述天然蛋白可作為直接的生物學藥物或作為經(jīng)證明有效的用于藥物小分子開發(fā)的藥物靶。事實上，該器官合成整套宿主的重要蛋白，包括酶、激素、凝血因子和免疫因子。幾種通過肝合成的蛋白是正確地發(fā)揮血液功能所必需的；這些蛋白包括幫助保持正確的血液體積的結(jié)合蛋白和白蛋白。由肝產(chǎn)生的凝血因子包括血纖蛋白原、凝血酶原(因子II)、因子VII、VIII、IX、X和von Willebrand因子。急性期蛋白(APP)是另一套由肝響應組織破環(huán)和與損傷和/或感染性疾病相關(guān)的炎癥而合成的血漿蛋白。運鐵蛋白(Tf)、α-2-巨球蛋白(a2M)、血紅素結(jié)合蛋白恰好是一些重要的急性期蛋白。
(請參考附錄中的由肝細胞產(chǎn)生的蛋白的詳盡列表)。。
天然肝臟蛋白方法的局限原代肝細胞不會增殖，因此從該細胞類型生產(chǎn)蛋白需要穩(wěn)定地提供新的來自人肝活檢組織的細胞制劑。這代表笨拙而昂貴的具有許多相關(guān)問題(QA，批與批之間變化、幾乎沒有標準化、調(diào)節(jié)紊亂)的方法。通過TGE-Corp的in-licensing策略(Multicell Technologies的單一永生化和標準化的完全感受態(tài)的人肝細胞)已經(jīng)解決該問題。
對于生產(chǎn)用于治療或其它用途的天然肝蛋白，剩下的限制很明顯取決于以適當?shù)漠a(chǎn)量從培養(yǎng)的肝細胞中獲得的成套蛋白。所述附錄部分列出了所有主要的蛋白，所述蛋白可以以‘天然蛋白’大量生產(chǎn)。
必須使用基因工程策略生產(chǎn)任何其它治療蛋白候選者。然而，即使在這種情況下，這些細胞底物的人性質(zhì)/來源(MCT的肝細胞系)應當保證目前可獲得的最好的翻譯后修飾，因而導致產(chǎn)生具有明顯競爭優(yōu)勢的重組終產(chǎn)物，包括有利的調(diào)節(jié)前景。
附錄1表達治療蛋白質(zhì)的高效、誘導型啟動子-基因構(gòu)建體的構(gòu)建基礎構(gòu)建表達載體，所述表達載體允許在原核和真核細胞中通過zeocin抗生素(Cayla)的篩選來選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子?？蓮膒ZeoSV質(zhì)粒(Invitrogen)中以限制性消化片段獲得Zeocin抗性基因并且將其連接至含有細菌復制起始位點的片段上，所述片段通過pUC19(NewEngland Biolabs)的PCR擴增獲得。然后將該連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸肝菌(E.coli)細胞并在含有Zeocin的細菌培養(yǎng)板上選擇想要的重組質(zhì)粒(pUC-Zeo)。獲得合成的poly(A)序列(作為pGL3-Basic(Promega)降解的限制性片段)并將其連接到pUC-Zeo的HSP70B啟動子上游，并且就Zeocin抗性選擇想要的重組體(pUC-ZeoA)。以限制性片段的方式獲得HSP70B驅(qū)動的表達盒(Hi-Hot)，所述限制性片段來自pHi&Hot-MCS(V3)(David Harris，University of Arizona)的PCR擴增片段，并且其多克隆區(qū)域中的XhoI片段已被刪除。將Hi-Hot表達盒連接入pUC-ZeoA的合成poly(A)序列下游并就Zeocin抗性選擇想要的重組體(pHiHot-Zeo)?？蓪⑿枰贖i-Hot系統(tǒng)控制下表達的基因插入來源于pHi&Hot-MCS的多克隆序列的單一XhoI和XbaI位點。所述Hi-Hot質(zhì)粒構(gòu)建體來源于Tsang等人，Biotechniques，2051-52，1996和Tsang等人，Biotechniques，2268的構(gòu)建體。
在使用表達白細胞介素-2的Lewvis肺癌細胞系的瞬時轉(zhuǎn)染實驗中比較表達系統(tǒng)，獲得下列結(jié)果Hsp70B啟動子-468pg/ml白細胞介素-2CMV啟動子-573pg/ml白細胞介素-2Hi-Hot啟動子-18,409pg/ml白細胞介素-2HI-HOT啟動子比HSP70B啟動子強39.3倍，比CMV啟動子強32.1倍附錄2天然的肝臟蛋白候選者名單縮寫 蛋白名稱
附錄3現(xiàn)存的人細胞系生產(chǎn)系統(tǒng)生物技術(shù)最初的成功(即將DNA序列轉(zhuǎn)移至活細胞中并使其大規(guī)模產(chǎn)生治療蛋白/肽的能力)要追溯到大約30年前。重組胰島素的產(chǎn)生是第一個這種方法的例子，在1970年代通過將胰島素基因?qū)爰毦?可獲得的最簡單細胞類型)中獲得重組胰島素。然后，這些‘經(jīng)基因工程改造的細菌’產(chǎn)生至今仍在成功地用于對抗糖尿病的胰島素。
隨著生物技術(shù)工業(yè)逐漸對更復雜的蛋白藥物生產(chǎn)產(chǎn)生興趣，需要更復雜的生產(chǎn)型細胞作為生產(chǎn)平臺。在80年代早期，在哺乳動物細胞中大規(guī)模生產(chǎn)治療蛋白代表了主要突破。今天，動物細胞例如嚙齒類動物細胞系，特別是中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)，代表了用于生產(chǎn)生物治療藥物(包括一些轟動的生物技術(shù)藥物)的最重要的平臺。
然而，在近年來的臨床實驗中，特別是使用重組鼠科動物抗體的實驗中，很快清楚地了解到非人抗體具有引起免疫應答的潛能，因此阻礙了治療功效。這些觀察強調(diào)了復雜蛋白產(chǎn)物的正確‘人類型’翻譯后修飾的重要性。
PER.C6TMIntrogen b.v.(Leiden，NL)公司，即現(xiàn)在的Crucell，使生物生產(chǎn)方法從嚙齒類動物向人生產(chǎn)平臺邁進了一步。PER.C6TM是由能夠產(chǎn)生用于人治療使用的生物治療藥物的人細胞系組成的表達平臺。PER.C6細胞系產(chǎn)生自人視網(wǎng)膜來源的原代細胞，所述細胞通過插入腺病毒E1基因而被永生化。所述細胞系以受控和完全已知的方式來源于單一的健康人細胞來源。公司已永生化所述細胞以使其能夠無限地進行自我復制，這與正常人細胞不同，所述自我復制是以足以用于商業(yè)銷售的量來生產(chǎn)重組生物治療藥物產(chǎn)品所必需的前提特征。
目前，為了下列目的，Crucell改進其PER.C6生產(chǎn)平臺通過rDNA技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體；生產(chǎn)除了mAb以外的各種治療蛋白；
疫苗生產(chǎn)；用于基因治療應用的腺病毒載體生產(chǎn)；功能基因組。
為什么是PER.C6TMCrucell，即PER.C6TM擁有者公司，宣稱其平臺代表當今應用例如上述1-4的工業(yè)標準。其主要原因是源自下列斷言“Crucell的技術(shù)保持‘人’糖基化模式?！笔褂肞ER.C6細胞生產(chǎn)生物藥物產(chǎn)品的主要有利方面翻譯后修飾(特別是糖基化)在半壽期、生物活性和免疫相容性方面，最佳的重組藥物蛋白產(chǎn)品包含人聚糖結(jié)構(gòu)(即糖基化模式)。哺乳動物細胞如CHO(生物技術(shù)‘生產(chǎn)器’)或其它已建立的非人哺乳動物細胞系給重組蛋白或抗體加上非人聚糖結(jié)構(gòu)。PER.C6細胞進行人糖基化模式，導致更高的生物學活性和更長的半壽期。
調(diào)控問題隨著PER.C6已發(fā)展成用于生物治療藥物的生產(chǎn)平臺，從開始到現(xiàn)在已匯集了了大量關(guān)于所述細胞系產(chǎn)生和特征的參考資料。這些參考資料已由FDA作為生物產(chǎn)品主文件(BMF)保存。PER.C6已被批準用于生產(chǎn)用于基因治療實驗的重組腺病毒，和已被接受進行HIV疫苗的I/II期臨床試驗，所述疫苗被施用給健康和無免疫應答的個體。
產(chǎn)品產(chǎn)率-單克隆目前用于生產(chǎn)單克隆抗體的表達平臺是CHO和NS/0細胞，所述細胞在最終生產(chǎn)過程中總共具有平均大約0.5g/l的表達產(chǎn)率。PER.C6在非最優(yōu)化的系統(tǒng)中產(chǎn)生類似的抗體水平并且預期在最優(yōu)化的補料分批培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)率會有顯著增加。
知識產(chǎn)權(quán)Crucell，Leiden，NL，完全擁有與PER.C6相關(guān)的技術(shù)和實際知識，其具有明晰的專利狀況，這與所有其它用于生物治療藥物的生產(chǎn)平臺的情況大不相同。
使用的靈活性所述細胞容易在無血清和無動物組分培養(yǎng)系統(tǒng)中以貼壁或懸浮培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng)，并且可容易地從一種培養(yǎng)基中或培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)移至另一種培養(yǎng)基中或培養(yǎng)條件下。
可量測性腺病毒E1基因的存在抑制了PER.C6細胞的衰亡，當在分批生產(chǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)時導致很長的壽命。PER.C6細胞容易規(guī)?；?目前將所述細胞培養(yǎng)在2,500L反應器中并且正進行進一步擴大規(guī)模。
穩(wěn)定性用表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PER.C6細胞是有效的，隨后產(chǎn)生穩(wěn)定的亞克隆。重要的是，在缺少基因擴增的情況下觀察到重組蛋白的高表達水平，于是產(chǎn)生了優(yōu)于使用需要擴增以獲得足夠蛋白表達的細胞系的可觀的時間有利方面。
在2002年5月的聽證會(http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/briefing/3750b1_01.htm)上，F(xiàn)DA考慮了在使用兩種新的細胞底物即HEK293細胞和PER.C6細胞上的潛在風險。通過用5型腺病毒(Ad5)的轉(zhuǎn)化早期區(qū)域1(E1)轉(zhuǎn)化人胚胎腎細胞(293)和人胚胎視網(wǎng)膜細胞(PER.C6)來開發(fā)這些細胞系。由于細胞系例如293和PER.C6表達Ad5 E1區(qū)域，所以其能與缺陷型Ad5載體的生長互補，所述載體已通過刪除E1被“致殘”。缺陷型Ad5載體已通過基因工程改造表達外源基因例如來自人免疫缺陷病毒(HIV)、AIDS病原體的基因，并且因為其的經(jīng)證明產(chǎn)生針對HIV的細胞介導的免疫應答的能力，這種類型的載體被認為具有用于疫苗開發(fā)的重大潛力。然而，與Ad5-轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)的調(diào)節(jié)重要性的特征是其在免疫缺陷動物例如裸鼠中形成腫瘤的能力。
考慮到與使用所謂的Designer Cell Substrates-即贅生性細胞(來源于經(jīng)確定的病毒或細胞癌基因轉(zhuǎn)化或經(jīng)永生化細胞基因(例如端粒酶)轉(zhuǎn)化的正常細胞)-相關(guān)的潛在風險，OVRR/CBER正考慮概括于“確定的風險”評估(Lewis等人，″A defined-risks approachto the regulatory assessment of the use of neoplastic cells assubstrates for viral vaccine manufacture″，In EvolvingScientific and Regulatory Perspectives on Cell Substrates forVaccine Development.Brown，Lewis，Peden，Krause(eds.)Develop.Biol.Stand.)框架內(nèi)的方法，該框架意欲檢查，以及如果可能的話，定量“傳遞”用于疫苗生產(chǎn)的細胞底物的致瘤性組分的潛在風險和確定所述“傳遞”是否可能造成風險，特別是癌基因?qū)臃N人員的風險?？捎绊懪c使用Designer Cell Substrates相關(guān)的風險的因素包括(a)已知的導致致瘤性細胞發(fā)育的細胞轉(zhuǎn)化機制；(b)殘余的細胞DNA；和(c)外來因子特別是致癌病毒的存在。
CRUCELLCrucell發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了利用人免疫系統(tǒng)對抗疾病的完全的人生物治療藥物。Crucell擁有的技術(shù)平臺MAbstractTM、AdVacTM和PER.C6TM使得能夠發(fā)現(xiàn)、發(fā)展和生產(chǎn)新的抗原、抗體和疫苗。Crucell將其技術(shù)提供給藥物和生物技術(shù)伙伴，并利用其建立Crucell自己的生產(chǎn)線。
PER.C6TM是人細胞生產(chǎn)平臺，其已成為用于生產(chǎn)重組腺病毒載體的工業(yè)標準。PER.C6TM已被證明是用于生產(chǎn)抗體和疫苗的優(yōu)良平臺。
Crucell擁有19個其PER.C6TM技術(shù)的被許可方，包括Novartis、Pfizer、GSK、Aventis、Genzyme和Schering。
Crucell’s Press Releases中的PER.C6TM。
PER.C6TM是用于開發(fā)和生產(chǎn)生物治療藥物產(chǎn)品例如抗體、蛋白和疫苗的人細胞平臺。PER.C6TM的優(yōu)良的產(chǎn)率和可測量性以及詳盡的歷史和安全記錄使得PER.C6成為藥物工業(yè)所要求的安全、成本效率和大體積生產(chǎn)平臺。與Merck & Co.訂立了排他性許可協(xié)議，同意其使用PER.C6作為疫苗平臺生產(chǎn)其HIV疫苗，Crucell致力于擴大其PER.C6在疫苗領域的商業(yè)業(yè)務。目前與Rhein Biotech的協(xié)議支持了該策略。
權(quán)利要求
1.用于在人細胞中生產(chǎn)有活性的基因產(chǎn)物的方法，所述方法包括下列步驟提供DNA構(gòu)建體，其中編碼目的蛋白的基因有效地連接至經(jīng)修飾的熱誘導啟動子上；通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染將所述DNA構(gòu)建體導入人細胞系以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細胞系；使所述轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細胞系經(jīng)受短暫升溫并允許在溫度已回復到所述宿主細胞的正常生長溫度后發(fā)生蛋白翻譯，從而產(chǎn)生所述目的蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)修飾的熱誘導啟動子是Hi-Hot啟動子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述人細胞系是感受態(tài)人肝細胞系。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述表達的基因編碼治療蛋白。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述表達的基因包括治療性基因，例如干擾素、白細胞介素、凝血因子、胰島素、生長激素、尿激酶、EPO、TPA、FSH、促生長素抑制素、抗體、DNA酶、肌紅蛋白、促血管生成因子和抗血管生成因子和獸醫(yī)目的的蛋白。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述表達的基因是天然肝臟蛋白。
全文摘要
提供了在人類細胞中生產(chǎn)活性基因產(chǎn)物的方法，該方法包括下列步驟提供DNA構(gòu)建體，其中編碼目的蛋白的基因有效地與修飾的熱誘導啟動子連接；通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染把所述DNA構(gòu)建體導入人類細胞系，形成轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細胞系；使所述轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的細胞系接受短暫升溫，并允許在溫度回復到所述宿主細胞的正常生長溫度后，實現(xiàn)蛋白翻譯，從而實現(xiàn)所述目的蛋白的生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/00GK1809641SQ200480017078
公開日2006年7月26日 申請日期2004年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者彼得·布羅姆利 申請人:彼得·布羅姆利