專利名稱：重組抗體及組合物及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體，包括人狂犬病毒中和抗體的核酸和氨基酸序列，以及使用重組表達載體對其進行的制備。更具體地，本發(fā)明涉及針對狂犬病毒的抗體混合物的應(yīng)用，該混合物可在受試者暴露于狂犬病毒后用于預(yù)防治療。
背景技術(shù)：
狂犬病是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到狂犬病毒的感染而引起的急性神經(jīng)性疾病，狂犬病毒是棒狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)中的病毒。在于病毒的古老以及疾病的可怕性而具有重要歷史意義的狂犬病毒一直是人類和動物感染的重要威脅，因為其在各種野生動物中存在著廣泛的宿主。在世界的大部分地區(qū)，狂犬病毒在地區(qū)物種中是地方病，而不同地區(qū)的病毒變異體之間相似性很小。雖然在包括聯(lián)合王國，澳大利亞，日本，以及各個島嶼上沒有地方性狂犬病，英國和澳大利亞也已發(fā)現(xiàn)了狂犬病和蝙蝠相關(guān)的狂犬相關(guān)病毒。
盡管抗體能夠提供即時免疫，被動免疫已被廣泛地用于治療傳染性疾病，包括狂犬病(Casadeval，A.，Emerg.Infect.Dis.2002，8833-41)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)指導(dǎo)方針，3類狂犬病的暴露需要狂犬病暴露后預(yù)防(PEP)，這些暴露被定義為或單次或多次經(jīng)皮咬傷或黏膜被患有狂犬病動物的唾液污染(Human rabiesprevention-United States，2000Recommendations of the AdvisoryCommittee on Immunization Practices.MMWR 2000)。狂犬病的暴露后預(yù)防包括疫苗和抗狂犬病免疫球蛋白(RIG)的給藥。目前，從狂犬病毒免疫的人(人RIG[HRIG])或狂犬病毒免疫的馬(馬RIG[ERIG])的血清樣品中制備用于暴露后預(yù)防的RIG。由于與ERIG的使用相關(guān)的潛在不良效應(yīng)(例如過敏性休克)，在美國僅使用HRIG，暴露于狂犬病動物的人(每年～39,000人)接受HRIG和狂犬病毒(RV)疫苗的治療(Human rabies prevention-United States，2000Recommendations ofthe Advisory Committee on Immunization Practices.MMWR 2000)。然而，在發(fā)展中國家，因為沒有足夠量的可供使用的HRIG和ERIG或因為它們，特別是HRIG，過于昂貴，所有PEP中＜1％包括了RIG的給藥(Human rabies prevention-United States，1999Recommendations of theAdvisory Committee on Immunization Practices(ACIP).MMWR Recomm.Rep.1999，481-21)。此外，一些動物保護團體對于飼養(yǎng)動物用于血清制備的行為進行了聲討(Human rabies prevention-United States，1999Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices(ACIP).MMWR Recomm.Rep.1999 481-21)。另外，由已知或未知病原體造成HRIG污染的可能性是管理機構(gòu)關(guān)心的問題。通過制備人RV-中和單克隆抗體(MAbs)可以克服經(jīng)濟有效而安全的RIG在全球有限的供應(yīng)，該抗體可被用于與生物反應(yīng)器技術(shù)結(jié)合的高產(chǎn)表達系統(tǒng)(例如使用transfectomas的系統(tǒng))。
一旦個體暴露于狂犬病毒，可以通過合適的治療包括被動和主動免疫，容易地防止疾病(Human rabies prevention-United States，2000Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.MMWR 2000)。人們相信抗體的被動給藥對于在進入位點中和病毒以及干擾病毒向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的擴散很重要(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，897252-6)。這兩種作用很可能為發(fā)展對病毒的主動免疫提供時間，該免疫最終清除病毒。
RV-中和鼠或人單克隆抗體(MAbs)的給藥在鼠的暴露后預(yù)防中顯得很有效(WHO consultation on a monoclonal antibody cocktail forrabies post exposure treatment，WHO，2002年5月23-24日；Schumacher等，J.Clin.Invest.1989 84971-5；Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90)。隨著人單克隆抗體制備技術(shù)的進步，考慮在人體中使用鼠單克隆抗體可能是不必要的。在人體中使用鼠單克隆抗體可能帶來問題，因為它們對于人而言是是免疫原性的且其半衰期是有限的，可能造成血清病或過敏性休克。此外，人單克隆抗體和Fc受體之間的相互作用和相應(yīng)的鼠試劑之間的作用相比可能是更合適的。
目前，使用從混合人血清或從免疫的馬中制備的抗體治療受試者。但是，這些試劑中沒有任何試劑是可以輕易獲得、完全安全或生物活性穩(wěn)定的。
對于暴露于狂犬病毒的個體的暴露后預(yù)防治療需要新的方法。同樣需要新的方法治療存在暴露于狂犬病毒的風(fēng)險的受試者。本發(fā)明滿足了這些需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為狂犬病的治療和預(yù)防提供了狂犬病毒中和抗體的混合物。本發(fā)明還提供了含有編碼抗狂犬病抗體的核酸的重組棒狀病毒表達系統(tǒng)以及這些抗體的組合物和在哺乳動物細胞內(nèi)制備這些抗體的方法。
在此提供的重組狂犬病毒中和人抗體包括人抗體SOJA、SOJB和SO57。這三個抗體也分別被稱作MAb JA、MAb JB.1和MAb 57。
本發(fā)明因此提供了包含一種藥學(xué)上可接受的載體和至少兩種狂犬病毒中和人抗體的藥物組合物，其中至少兩種抗體中的至少一種選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQ IDNO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQ IDNO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQ IDNO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
本發(fā)明提供了對需要治療的受試者治療或預(yù)防狂犬病毒感染的方法。該方法包括對受試者以至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體的有效量給藥，其中抗體選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQ IDNO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQ IDNO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈和具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQ IDNO9成分同源的序列的抗體重鏈的抗體。
在一個具體實施方案中，至少兩種，更優(yōu)選三種抗體選自前述組。
在一個具體實施方案中，用至少三種不同的重組狂犬病毒中和人抗體進行給藥。
在一個具體實施方案中，抗體以至少兩種不同組合物的方式分別給藥。
在一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體對至少兩種或多種狂犬病毒呈現(xiàn)中和活性。
在本發(fā)明的一個方面中，不同的重組狂犬病毒中和人抗體以大約等摩爾濃度給藥。
在一個具體實施方案中，用重組狂犬病毒中和人抗體給藥，其中各重組狂犬病毒中和人抗體以與給藥的其它重組狂犬病毒中和人抗體大約相等的蛋白量給藥。一方面，重組狂犬病毒中和人抗體的給藥量在大約0.001mg/kg體重至大約100mg/kg體重之間。在本發(fā)明的另一方面中，重組狂犬病毒中和人抗體的給藥量在大約0.01mg/kg體重至大約60mg/kg體重之間。
在另一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體的給藥量基于重組狂犬病毒中和人抗體混合物的狂犬病毒中和活性。一方面，混合物活性在大約1IU/kg體重至大約50IU/kg體重之間。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了通過重組狂犬病毒中和抗體混合物給藥對受試者進行治療的方法，其中受治療的病毒為一種狂犬病毒街毒。在一些具體實施方案中，病毒選自銀毛蝠狂犬病毒、土狼狂犬病毒街毒/墨西哥狗狂犬病毒和狗狂犬病毒。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了通過重組狂犬病毒中和抗體混合物的給藥對受試者進行治療的方法，其中受治療的病毒是狂犬病毒固定毒。
接受治療的受試者優(yōu)選是人。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了重組棒狀病毒表達載體，包含編碼皰疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列，且進一步包含含有編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈和抗體重鏈的核酸序列的核酸。在另一個具體實施方案中，核酸序列編碼狂犬病毒中和人抗體的輕鏈而不是重鏈。在另一個具體實施方案中，核酸序列編碼狂犬病毒中和人抗體的重鏈而不是輕鏈。一方面，抗體是SOJA單克隆抗體。另一方面，抗體是SOJB單克隆抗體。再一方面，抗體是SO57單克隆抗體。一方面，核酸只編碼抗體輕鏈。另一方面，核酸僅編碼抗體重鏈。
在本發(fā)明的實踐中，提供了包含本發(fā)明重組棒狀病毒表達載體的哺乳動物宿主細胞。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，哺乳動物宿主細胞是BSR細胞、幼倉鼠腎細胞、VERO細胞、或中國倉鼠卵巢細胞。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的重組棒狀病毒表達載體在哺乳動物宿主細胞中制備重組狂犬病毒中和人抗體的方法。本方法包括用本發(fā)明的重組棒狀病毒表達載體感染哺乳動物細胞，該載體包含含有編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈和抗體重鏈的核酸序列的核酸，以及在允許抗體表達的條件下培養(yǎng)哺乳動物細胞。一方面，抗體是SOJA單克隆抗體。另一方面，抗體是SOJB單克隆抗體。再一方面，抗體是SO57單克隆抗體。一方面，核酸僅編碼抗體輕鏈。另一方面，核酸僅編碼重鏈。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，制備重組狂犬病毒中和人抗體的哺乳動物細胞是BSR細胞、幼倉鼠腎細胞、VERO細胞、或中國倉鼠卵巢細胞。
縮寫和簡寫形式在本說明書中使用以下縮寫和簡寫形式。
“BHK”指幼倉鼠腎。
“BSR”指BHK細胞亞克隆。
“CHO”指中國倉鼠卵巢。
“CNS”指中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
“COSRV”指犬類狂犬病毒變體。
“CVS”指標準攻擊毒株(challenge-virrus standard)。
“DRV-4”指狗狂犬病毒4。
“EBV-2”指歐洲蝙蝠病毒2。
“ED50”指50％受治療動物被保護的有效量。
“ERIG”指馬狂犬病免疫球蛋白。
“G”指糖蛋白。
“GSP”指基因特異性啟動子。
“HRIG”指人狂犬病免疫球蛋白。
“huMAb”指人單克隆抗體。
“Ig H”指免疫球蛋白重鏈。
“Lg L”指免疫球蛋白輕鏈。
“IU”指國際單位。
“MAb”指單克隆抗體。
“MIC LD50”指殺死50％的顱內(nèi)受感染小鼠的病毒劑量，即，小鼠顱內(nèi)LD50。
“MOI”指感染的多重性。
“PCR”指聚合酶鏈式反應(yīng)。
“PEP”指暴露后預(yù)防。
“RIG”指狂犬病免疫球蛋白。
“rhuMAb”指重組人單克隆抗體。
“RhV”指棒狀病毒載體。
“RV”指狂犬病毒。
“SHBRV”指銀毛蝠狂犬病毒。
“VNA”指病毒中和抗體。
“VSV”指皰疹性口炎病毒。
“WHO”指世界衛(wèi)生組織。
定義本申請中使用的定義以說明為目的不對本發(fā)明的范圍進行限制。
在此使用的冠詞“一”指該冠詞的一或多于一個(即至少一個)的語法賓語。舉例來說，“一種成分”指一種或多于一種成分。
在此使用的各“氨基酸”由其全稱表示、通過其相應(yīng)的三字母代碼表示、或由其相應(yīng)的單字母代碼表示，如下表所示

在此使用的表達“氨基酸”包括天然的和合成的氨基酸，以及D型和L型氨基酸?！皹藴拾被帷敝冈谔烊簧傻碾闹薪?jīng)常發(fā)現(xiàn)的20種L-氨基酸中的任何一種?！胺菢藴拾被帷敝赋藰藴拾被嶂獾娜魏伟被?，無論其是通過合成制備的還是從天然來源衍生出來的。在此使用的“合成氨基酸”也包括化學(xué)修飾的氨基酸，包括但不限于鹽、氨基酸衍生物(例如酰胺)以及取代物。本發(fā)明的肽所包含的氨基酸，特別是位于羧基末端或氨基末端的氨基酸，可通過甲基化、酰胺化、乙?；蛴赡軌蚋淖冸牡难h(huán)半衰期而對肽活性不發(fā)生負面影響的其它化學(xué)基團取代而進行修飾。此外，在本發(fā)明的肽中可以出現(xiàn)或不出現(xiàn)二硫鍵。
術(shù)語“氨基酸”可與“氨基酸殘基”交替使用，可指代游離氨基酸和肽的氨基酸殘基。從使用該術(shù)語的上下文可以明顯看出該術(shù)語指游離氨基酸或肽的殘基。
氨基酸具有以下普遍的結(jié)構(gòu) 根據(jù)側(cè)鏈R可將氨基酸分為七類(1)脂肪族側(cè)鏈，(2)含有羥基(OH)的側(cè)鏈，(3)含有硫原子的側(cè)鏈，(4)含有酸性或酰胺基團的側(cè)鏈，(5)含有堿性基團的側(cè)鏈，(6)含有芳香環(huán)的側(cè)鏈，以及(7)脯氨酸，其側(cè)鏈與氨基基團結(jié)合的亞氨基酸。
用于描述本發(fā)明的肽化合物的命名法沿襲傳統(tǒng)習(xí)慣，其中氨基基團和羧基基團分別位于各氨基酸殘基的左邊和右邊。在表示所選的本發(fā)明特定具體實施方案的結(jié)構(gòu)式中，盡管沒有特別表示，除非特別說明，應(yīng)當(dāng)明白氨基和羧基末端基團以其在生理pH值呈現(xiàn)的形式存在。
在此使用的“抗體”，包括多克隆和單克隆抗體；重組抗體；以及嵌合、單鏈、人源化抗體，以及人抗體。“抗體”不僅包括完整的抗原結(jié)合免疫球蛋白分子，還包括其與抗原結(jié)合的片段，如Fv、Fab、Fab’以及F(ab’)2片段、單鏈Fv或免疫球蛋白表達文庫的產(chǎn)物。
在此使用的“抗體重鏈”指存在于所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較大的一類。
在此使用的“抗體輕鏈”指存在于所有抗體分子中的兩類多肽鏈中較小的一類。
在此使用的關(guān)于狂犬病毒中和重組抗體的“生物活性”指用作狂犬病毒活性中和劑的能力。
在此使用的狂犬病毒中和抗體的“有效量”或“治療有效量”是在暴露于狂犬病的受試者體內(nèi)足以抑制狂犬病毒感染進程的量或在有暴露于狂犬病風(fēng)險的受試者體內(nèi)足以預(yù)防狂犬病毒進程的量。
使用的關(guān)于狂犬病毒中和抗體mRNA的術(shù)語“表達”指狂犬病毒中和重鏈或輕鏈核酸序列的轉(zhuǎn)錄，造成狂犬病毒中和抗體mRNA的合成。使用的關(guān)于狂犬病毒中和抗體的“表達”指狂犬病毒中和抗體mRNA的翻譯，造成狂犬病毒中和抗體的合成。
在此使用的“同源”指兩個聚合分子之間的亞單元序列相似性，例如在兩個核酸分子如兩個DNA分子或兩個RNA分子之間，或在兩個多肽分子之間。當(dāng)兩分子中的亞單元位點被相同的單體亞單元占據(jù)，例如兩DNA分子中的位置均被腺嘌呤占據(jù)，在該位點它們就是同源的。兩序列間的同源性是匹配或同源位點數(shù)目的直接函數(shù)；例如如果兩序列中一半的位點(例如，長度為10個亞單元的聚合物中的5個位點)是同源的，兩序列為50％同源的；如果90％的位點(例如10個中的9個)是匹配或同源的，兩序列為90％同源的。舉例來說，DNA序列3’ATTGCC 5’和3’TATGGC 5’為50％同源的。
在此使用的核酸分子的“亞單元”是核苷酸，多肽的“亞單元”是氨基酸。
在此使用的“同源性”與“等同性”同義。
在此使用的術(shù)語“抑制”指相對于對照值以至少10％的比例抑制或阻斷活性或功能。優(yōu)選地，活性與對照值相比被抑制或阻斷50％，更優(yōu)選地為75％，甚至更優(yōu)選地為95％。
“分離的”指通過人的行為從天然狀態(tài)改變的或離開的。例如，天然存在于活體動物內(nèi)的核酸或肽不是“分離的”，但從其天然狀態(tài)的共存材料中部分或完全分離出的相同的核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以充分純化的形式存在，或存在于非天然環(huán)境中，例如宿主細胞中。
在此使用的關(guān)于狂犬病毒的“中和”，指在暴露于狂犬病的受試者體內(nèi)降低或抑制狂犬病毒的感染進程或在有暴露于狂犬病毒風(fēng)險的受試者體內(nèi)降低或預(yù)防進程。
“核酸”指聚核苷酸，包括聚核糖核苷酸和聚脫氧核糖核苷酸。
在此使用的術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可交替使用，指由氨基酸殘基通過肽鍵共價連接組成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須包含至少2個氨基酸，對于可以組成蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸的最大數(shù)目沒有設(shè)限。
“藥學(xué)上可接受的”指對于人或動物應(yīng)用在生理學(xué)上可容忍的。
在此使用的“藥物組合物”包括用于人或動物的配方。
“預(yù)防性的”或“預(yù)防的”治療是對沒有出現(xiàn)狂犬病毒暴露或感染的癥狀或僅出現(xiàn)早期癥狀的受試者進行的治療。進行預(yù)防的或預(yù)防性的治療的目的是降低發(fā)展狂犬病毒感染相關(guān)病原體的風(fēng)險。
在此使用的“狂犬病毒相關(guān)紊亂”指狂犬病毒的存在和狂犬病臨床癥狀之間存在關(guān)聯(lián)的紊亂。
在此使用的關(guān)于重組人抗體“狂犬病毒中和”指能夠降低狂犬病毒感染細胞或引起狂犬病程度的抗體或抗體的混合物。“狂犬病毒中和”和“狂犬病毒中和活性”可以交替使用。
在此使用的“樣品”指取自受試者的生物樣品，包括正常組織樣品、血液、唾液、糞便或尿液。樣品還可以是取自受試者的其它任何含有感興趣的化合物或細胞的材料。
在此使用的“受試者”可以是人或非人動物。非人動物包括，例如家畜和寵物，如綿羊、牛、豬、犬科、貓科和鼠科哺乳動物以及爬行動物、鳥類和魚。優(yōu)選地，受試者是人。
“充分純化的”指由于去除了初始存在的其它化合物(例如其它肽、核酸、碳水化合物、脂肪)或其它細胞而在性質(zhì)上基本上同源的肽或核酸序列?！俺浞旨兓摹辈灰馕吨鴮⑷斯さ幕蚝铣傻幕旌衔锱c其它化合物一起排除，也不排除對生物活性不發(fā)生干擾的雜質(zhì)的存在，以及例如因為不完全純化、穩(wěn)定劑的加入或配制藥學(xué)上可接受的制劑而可能存在的雜質(zhì)。
在此使用的“基本上同源的氨基酸序列”包括與參照抗體鏈的氨基酸序列至少具有大約95％同源性，優(yōu)選地至少有大約96％同源性，更優(yōu)選地至少有大約97％同源性，甚至更優(yōu)選地至少有大約98％同源性，以及最優(yōu)地至少具有大約99％或更高同源性的氨基酸序列。氨基酸序列的相似性或等同性可以通過采用BLASTP和TBLASTN程序計算，這些程序采用BLAST(基本局部相似性比對搜索工具)2.0.14運算法則。用于這些程序的默認設(shè)置適用于為本發(fā)明目的而識別充分相似的氨基酸序列。
“基本上同源核酸序列”指與參照核酸序列對應(yīng)的核酸序列，其中對應(yīng)序列編碼的肽與參照核酸序列編碼的肽具有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能；例如，僅有不會顯著影響肽功能的氨基酸發(fā)生改變的情況下。優(yōu)選地，充分相似的核酸序列編碼由參照核酸序列編碼的肽。充分相似的核酸序列和參照核酸序列之間的等同性的百分比為至少大約50％、65％、75％、85％、95％、99％或更高。核酸序列的充分相似性可以通過比較兩序列的序列等同性確定，例如通過物理/化學(xué)方法(即雜交法)或通過計算機算法的序列相似性比對。確定核苷酸序列和參照核苷酸序列充分相似的合適的核酸雜交條件為50℃的7％十二烷基磺酸鈉SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA，并于50℃用2X標準檸檬酸鈉(SSC)、0.1％SDS洗滌；優(yōu)選地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中并于50℃用1X SSC、0.1％SDS洗滌；優(yōu)選地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中并于50℃用0.5X SSC、0.1％SDS洗滌；以及更優(yōu)選地在50℃的7％(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中并于65℃用0.1X SSC、0.1％SDS洗滌。合適的用于確定兩核酸序列之間充分相似性的計算機算法包括GCS程序包(Devereux等，1984 Nucl.Acids Res.12387)以及BLASTN或FASTA程序(Altschul等，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1990 87145509-13；Altschul等，J.Mol.Biol.1990 2153403-10；Altschul等，1997 NucleicAcids Res.253389-3402)。這些程序提供的默認設(shè)置適于為本發(fā)明目的確定核酸序列間的充分相似性。
在此使用的術(shù)語“治療(動詞)”或“治療(名詞)”指進行狂犬病毒中和抗體或化合物的給藥以降低經(jīng)受狂犬病毒感染的效應(yīng)或癥狀的頻率，減輕癥狀的嚴重性，或防止效應(yīng)或癥狀的發(fā)生。
具體實施例方式
在本發(fā)明的實踐中，通過對需要治療的受試者進行重組狂犬病毒中和人抗體的給藥對狂犬病毒感染進行了治療或預(yù)防。重組狂犬病毒中和人抗體與各種狂犬病毒株的糖蛋白特異性的結(jié)合。使用兩種或多種不同抗體的暴露后治療可以在進入位點中和狂犬病毒并能防止病毒擴散進中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。因為病毒復(fù)制幾乎專門地限制在神經(jīng)細胞中，用本發(fā)明的抗體在病毒進入CNS前中和及清除病毒是有效的暴露后預(yù)防。
在本發(fā)明的實踐中，用重組狂犬病毒中和人抗體混合物的暴露后預(yù)防治療對狂犬病毒相關(guān)紊亂進行治療。該治療獲得安全的水平以及重復(fù)了HRIG的保護活性。
在一個具體實施方案中，用兩種或多種不同的重組狂犬病毒中和人抗體對受試者給藥。重組狂犬病毒中和人抗體不必以單一組合物給藥。例如，各不同的重組狂犬病毒中和人抗體可以通過分離的組合物給藥，或重組狂犬病毒中和人抗體以含有兩種或多種重組狂犬病毒中和人抗體的組合物形式一同給藥。另一方面，將三種或更多種不同的重組狂犬病毒中和人抗體給予受試者。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，通過至少兩種不同的重組狂犬病毒中和人抗體的給藥，在暴露于狂犬病毒的受試者體內(nèi)防止了狂犬病毒感染、或狂犬病臨床癥狀的發(fā)展。在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，通過至少兩種不同重組狂犬病毒中和人抗體的給藥，在存在暴露于狂犬病毒的風(fēng)險的受試者體內(nèi)預(yù)防了狂犬病毒的感染。
被選擇用于給藥的人抗體混合物優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)1)是IgG同型抗體；2)中和多于一種狂犬病毒株，優(yōu)選地為數(shù)種及其它狂犬病毒；以及3)其抗原決定簇識別專一性存在差異，以防止中和一抗性變體的逃脫(WHO consultation on a monoclonal antibody cocktail for rabies postexposure treatment，WHO，2002年5月23-24日)。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體衍生自雜交瘤JA、JB和J57的單克隆抗體。重組狂犬病毒中和人抗體分別命名為“SOJA”、“SOJB”和“SO57”。各人抗體中和多于一種狂大病毒株1)人單克隆抗體SO57中和RV固定毒株(例如Pitman-Moore、標準攻擊毒株[CVS]以及Evelyn-Rokitnicki-Abelseth)和街毒株(例如狗RV4[DRV-4]和銀毛蝠狂犬病毒18[SHBRV-18])(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90)；2)人單克隆抗體SOJB中和歐洲蝙蝠病毒2(EBV-2)；以及3)人單克隆抗體SOJA中和EBV-2、Lagos蝙蝠病毒和Mokola病毒(Champion等，J.Immunol.Methods 2000 23581-90；Hanlon等，Vaccine 2001 193834-42)。這表明這三種人單克隆抗體識別不同的抗原決定簇。
單克隆抗體SOJA包括含有氨基酸序列SEQ ID NO2(Genbank進入號AAO17825)的輕鏈和含有氨基酸序列SEQ ID NO1(Genbank進入號AAO17823)的重鏈。單克隆抗體SOJB包括含有氨基酸序列SEQ ID NO6(Genbank進入號AAO17826)的輕鏈和含有氨基酸序列SEQ ID NO4(Genbank進入號AAO17822)的重鏈。單克隆抗體SO57包括含有氨基酸序列SEQ ID NO7(Genbank進入號AAO17824)的輕鏈和含有氨基酸序列SEQ ID NO9(Genbank進入號AAO17821)的重鏈。
單克隆抗體SOJA的輕鏈由含有核酸序列SEQ ID NO10(Genbank進入號AY172961)的核酸編碼且重鏈由含有核酸序列SEQ ID NO11(Genbank進入號AY172959)的核酸編碼。單克隆抗體SOJB的輕鏈由含有核酸序列SEQ ID NO5(Genbank進入號AY172962)的核酸編碼且重鏈由含有核酸序列SEQ ID NO3(Genbank進入號AY172958)的核酸編碼。單克隆抗體SO57的輕鏈由含有核酸序列SEQ ID NO12(Genbank進入號AY172960)的核酸編碼且重鏈由含有核酸序列SEQID NO8(Genbank進入號AY172957)的核酸編碼。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，使用的重組狂犬病毒中和人抗體輕鏈或抗體重鏈是與參照抗體輕鏈或抗體重鏈的氨基酸序列具有實質(zhì)的序列同源性或等同性的抗體輕鏈或抗體重鏈。參照氨基酸序列是SEQ ID NOs1、2、4、6、7和9?；旧贤吹陌被嵝蛄兄概c參照肽具有至少95％、96％、97％、98％、99％或更多氨基酸序列等同性或相似性的肽或肽的部分。
多于一個核酸序列能編碼特定的氨基酸序列。因此，多于一個核酸序列能編碼一抗體輕鏈且多于一個核酸序列能編碼一抗體重鏈。由于在某些情況下核苷酸可以在不造成初始編碼氨基酸序列改變的情況下由其它核苷酸取代，簡并序列可以在遺傳密碼意義內(nèi)簡并。
在一個優(yōu)選具體實施方案中，給藥的不同重組狂犬病毒中和人抗體是SOJA、SOJB和SO57。重組SOJA和SO57 IgG1抗體是IgG1抗體，而SOJB是IgG3抗體。
根據(jù)一些具體實施方案，重組抗體是單鏈抗體，其中重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域由一間隔基團(spacer group)優(yōu)選地為肽連接。單鏈重組抗體可進一步包含效應(yīng)分子和/或信號序列，這些序列促進制備抗體的宿主細胞對抗體的加工。
在一個具體實施方案中，重組狂犬病毒中和人抗體通過重組DNA技術(shù)制備，該技術(shù)包括在允許重組抗體表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞并分離抗體。
一方面，通過培養(yǎng)宿主細胞制備重組狂犬病毒中和人抗體，該宿主細胞已被轉(zhuǎn)化了含有表達框的雜交載體。該表達框含有啟動子和編碼重組抗體的核酸序列。另一方面，啟動子與編碼信號肽的第一核酸序列連接，該序列在合適的閱讀框內(nèi)與編碼重組抗體的第二核酸序列連接。啟動子控制表達。隨后分離重組狂犬病毒中和人抗體。
通過體外制備技術(shù)可以獲得相對純的抗體制劑，該技術(shù)可以使制備擴大以產(chǎn)生大量的需要的抗體。本領(lǐng)域已知細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞培養(yǎng)技術(shù)，包括均勻懸浮式培養(yǎng)，例如在氣舉式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器內(nèi)，或固定或截留細胞培養(yǎng)，例如在中空纖維、微囊體內(nèi)、在瓊脂糖微?；蛱沾尚旧?。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)制備抗體，包括例如標準重組核酸技術(shù)和化學(xué)合成技術(shù)。
隨后根據(jù)實施例中說明的分析方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可對純化后抗體的生物學(xué)活性進行分析。
在一個具體實施方案中，包含核酸的雜交載體可用于制備抗體，該核酸進一步地包含編碼重組狂犬病毒中和人抗體的核酸序列。選擇性地，雜交載體包含復(fù)制原點或自主復(fù)制序列、一個或多個顯性標記序列、表達控制序列、信號序列和附加的限制性酶切位點。
編碼抗體輕鏈、抗體重鏈或兩者的重組表達載體系統(tǒng)可以與相容宿主細胞一起行使兩項功能。一項功能是促進編碼抗體鏈的核酸的克隆，即制備可利用量的核酸(克隆載體)。另一項功能是通過保持為染色體外遺傳因子或整合進宿主染色體在合適的宿主內(nèi)進行重組基因構(gòu)建體的復(fù)制和表達(表達載體)。克隆載體包括上述的重組核酸構(gòu)建體、復(fù)制原點或自主復(fù)制序列、顯性標記序列和選擇性地，信號序列和附加的限制性酶切位點。表達載體還包含重組核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的表達控制序列，由此制備重組狂犬病毒中和人抗體。
使用重組技術(shù)，可以構(gòu)建高水平表達(大約60pg/細胞)狂犬病毒中和人抗體的狂犬病毒載體(Morimoto等，J.Neurovirol.6373-812000；Morimoto等，J.Immunol.Methods 252199-206 2001；Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-3549 2000)。
在一個具體實施方案中，重組人抗體由棒狀病毒(RhV)表達系統(tǒng)制備，該系統(tǒng)從疫苗株狂犬病毒載體表達系統(tǒng)制備。制備狂犬病毒中和人抗體的RhV表達系統(tǒng)具有以下特征1)因為本發(fā)明的RhV表達系統(tǒng)不會引起細胞病變，受感染細胞可以長時間(＞2周)連續(xù)制備抗體，該狀況實現(xiàn)了經(jīng)濟有效的單克隆抗體制備；2)多種哺乳動物細胞培養(yǎng)物易受到重組RhV表達系統(tǒng)的感染，因此已被批準用作疫苗或抗體制備的細胞系(例如Vero非洲綠猴細胞和CHO細胞)可用于RhV對單克隆抗體的制備；以及3)使用UV照射或不改變抗體活性的化學(xué)試劑(例如非離子去污劑或乙醇)可以輕易地破壞RhV。此外，可以修飾RhV使其含有皰疹性口炎病毒糖蛋白(G)蛋白基因，而不是攜有負責(zé)RV病原性的主要決定子的狂犬病毒G基因(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 973544-49；Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983 8070-4)。因此，制備狂犬病毒中和人抗體的重組棒狀病毒表達系統(tǒng)僅呈現(xiàn)有限的生物安全顧慮。
編碼人抗體重鏈和輕鏈肽的重鏈和輕鏈抗體序列可被插入重組棒狀病毒表達系統(tǒng)中糖蛋白基因和聚合酶基因之間經(jīng)修飾的位點(Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-3549 2000)。此外，該重組棒狀病毒表達系統(tǒng)能感染各種哺乳動物細胞系且不是溶細胞的，由此允許使用常規(guī)用于制備狂犬病疫苗的細胞培養(yǎng)技術(shù)(Morimoto等，J.Neurovirol.6373-81 2000；Morimoto等，J.Immunol.Methods 252199-206 2001；Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 973544-35492000)。
在一個具體實施方案中，通過構(gòu)建含有外源的如來自猿猴病毒40(SV 40)或其它病毒源的復(fù)制原點的載體或通過宿主細胞的染色體機制提供復(fù)制原點或自主復(fù)制序列。
在另一個具體實施方案中，載體中的選擇標記實現(xiàn)了對含有載體的宿主細胞的選擇。選擇標記包括賦予重金屬如銅或抗生素如Geneticin(G-418)或潮霉素抗性的基因或彌補宿主細胞遺傳缺陷如缺乏胸苷激酶、次黃嘌呤磷?；D(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶等的基因。
在一些具體實施方案中，重組抗體的分泌被定向。例如信號序列可以是前序列或引導(dǎo)重組抗體分泌的分泌前導(dǎo)序列、剪切信號等。引導(dǎo)重組抗體分泌的信號序列的例子為衍生自ompA基因、pelB基因(果膠酸酯裂解酶)基因或phoA基因的序列。
抗體序列的轉(zhuǎn)錄由啟動子和轉(zhuǎn)錄起始和終止以及穩(wěn)定mRNA所必需的序列調(diào)節(jié)，以及選擇性地，由增強子和進一步的調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)。根據(jù)宿主細胞的性質(zhì)可以使用多種啟動子序列。強啟動子且同時被很好調(diào)節(jié)的啟動子是最有用的。例如翻譯起始序列是Shine-Dalgarno序列。轉(zhuǎn)錄起始和終止以及穩(wěn)定mRNA所必需的序列通常分別來自病毒或真核cDNA例如表達宿主的非編碼5’-區(qū)域和3’-區(qū)域。增強子是源自病毒的轉(zhuǎn)錄激活DNA序列，例如來自猿猴病毒、多瘤病毒、牛乳突淋瘤病毒或莫氏(Moloney)肉瘤病毒的，或源自基因組的，特別是鼠的。
載體的各種核酸片段可操作地連接，即這些片段相鄰并相互形成具有功能的關(guān)系。適用于在E.coli菌株中復(fù)制和表達的載體的實施例是噬菌體例如λ噬菌體的衍生物、或質(zhì)粒例如特別是質(zhì)粒ColE1及其衍生質(zhì)粒例如pMB9、pSF2124、pBR317或pBR322以及衍生自pBR322的質(zhì)粒例如pUC9、pUCK0、pHRil48和pLc24。合適的載體包含完整的復(fù)制子、標記基因、限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，因此外源DNA以及如果合適，表達控制序列以及選擇性的信號序列和增強子可被插入這些位點。
例如微生物啟動子是由溫度敏感抑制子控制的噬菌體λ的強左向啟動子PL。同樣合適的還有E.coli啟動子例如由lac抑制子調(diào)節(jié)并由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)的lac(乳糖)啟動子，由trp抑制子調(diào)節(jié)并由例如色氨酸饑餓誘導(dǎo)的trp(色氨酸)啟動子，以及由lac抑制子調(diào)節(jié)的tac(雜交trp-lac啟動子)。
多種載體也適于在酵母中的復(fù)制和表達且載體含有酵母復(fù)制起點和酵母的選擇性遺傳標記。這些載體中的一組包含所謂ars序列(自主復(fù)制序列)作為復(fù)制原點。這些載體在轉(zhuǎn)化后在酵母細胞內(nèi)保持在染色體外且自主復(fù)制。此外，可以使用含有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)全部或部分2μm質(zhì)粒的載體。這些載體將通過重組整合進已經(jīng)存在于細胞內(nèi)的2μm質(zhì)粒，或自主復(fù)制。在要實現(xiàn)高的轉(zhuǎn)化頻率和高拷貝數(shù)目時，2μm序列特別適用。
例如，適于在酵母內(nèi)表達的表達控制序列是那些高水平表達的酵母基因的表達控制序列。因此，可以使用的啟動子有TRP1基因、ADHI或ADHII基因、酸性磷酸酯酶(PHO3或PHO5)基因、異細胞色素(isocytochrome)基因的啟動子或糖酵解通路中的啟動子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶基因的啟動子。
優(yōu)選的適于在哺乳動物細胞內(nèi)復(fù)制和表達的載體來自衍生自病毒源DNA的啟動序列，例如來自猿猴病毒40(SV40)、魯斯氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)、腺病毒2、牛乳突淋瘤病毒(BPV)、乳多空泡病毒(papova-virus)BK突變體(BKV)、棒狀病毒、狂犬病毒、或鼠或人細胞巨化病毒(CMV)?？蛇x擇地，載體可以包含來自哺乳動物表達產(chǎn)物的啟動子，例如肌動蛋白、膠原蛋白、肌漿球蛋白等，或與所需基因序列正常相關(guān)的天然啟動子和控制序列，即免疫球蛋白H-鏈或L-鏈啟動子。
其它載體適用于原核和真核宿主且基于病毒復(fù)制系統(tǒng)。特別優(yōu)選的是含有猿猴病毒啟動子例如pSVgpt或pSVneo的載體，載體進一步包含增強子，例如與免疫球蛋白基因序列正常相關(guān)的增強子，特別是鼠Ig H-或L-鏈增強子。
可以按照不同的方法獲得完整的四聚體輕鏈和重鏈抗體。在一個具體實施方案中，抗體輕鏈和抗體重鏈在相同的細胞中共表達實現(xiàn)胞內(nèi)結(jié)合和抗體輕鏈與抗體重鏈連接形成完整的四聚體輕鏈和重鏈抗體。
在一個具體實施方案中，編碼抗體輕鏈的核酸和編碼抗體重鏈的核酸出現(xiàn)在兩個相互兼容的表達載體上，其中各核酸受到不同或相同啟動子的控制。在該具體實施方案中，表達載體共轉(zhuǎn)化或分別轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明的具體實施方案中，用重組彈狀表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化宿主細胞，該表達系統(tǒng)含有編碼所需重組抗體的抗體輕鏈和/或抗體重鏈的核酸序列。因此，一方面，核酸序列能編碼單鏈重組抗體。
合適宿主的實施例為細菌，特別是大腸桿菌菌株例如E.coliX1776、E.coli Y1090、E.coli HB 101、E.coli W3110、E.coli HB101/LM1035、E.coli JA 221、E.coli DH5α、E.coli K12或E.coli CC118菌株，枯草桿菌、嗜熱桿菌、假單胞菌、嗜血桿菌、鏈球菌及其它，以及酵母例如釀酒酵母如釀酒酵母GRF 18。進一步適用的宿主細胞是更高等生物的細胞，特別是已建立的人或動物連續(xù)細胞系，例如人胚胎肺纖維原細胞L132、人惡性黑素瘤Bowes細胞、Hela細胞、被SV40病毒轉(zhuǎn)化的非洲綠猴COS-7腎細胞、BHK細胞、BSR細胞、VERO細胞、或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或源自淋巴的細胞，例如淋巴瘤、骨髓瘤、雜交瘤、三體瘤(trioma)或四體瘤(quadroma)細胞，例如PAI、Sp2/0或X63-Ag8.653細胞。
在一個具體實施方案中，制備了轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，其中合適的受體宿主細胞被雜交載體轉(zhuǎn)化，且使用本領(lǐng)域已知標準選擇轉(zhuǎn)化后的細胞。按照文獻中的說明進行微生物的轉(zhuǎn)化，例如對釀酒酵母(A.Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751929 1978)、枯草桿菌(Anagnostopoulos等，J.Bacteriol.81741 1961)和大腸桿菌(M.Mandel等，J.Mol.Biol.53159 1970)的轉(zhuǎn)化。
相應(yīng)地，例如E.coli細胞的轉(zhuǎn)化步驟包括用Ca2+對細胞進行預(yù)處理從而允許DNA的攝入以及將細胞與雜交載體培育。隨后例如通過將細胞轉(zhuǎn)移至選擇性培養(yǎng)基可以實現(xiàn)對轉(zhuǎn)化后細胞的選擇，該培養(yǎng)基根據(jù)載體DNA的標記序列的性質(zhì)可以將轉(zhuǎn)化細胞從親代細胞中分離出來。優(yōu)選地，使用的培養(yǎng)基不允許不含載體的細胞的生長。例如酵母細胞的轉(zhuǎn)化包含步驟有使用葡糖苷酶酶解去除酵母細胞壁，在聚乙二醇和Ca2+離子存在下用載體處理獲得的原生質(zhì)，以及將原生質(zhì)埋入瓊脂再生細胞壁。優(yōu)選地，以允許上述轉(zhuǎn)化細胞的再生和選擇同時進行的方法制備再生瓊脂。
對更高級的真核細胞例如哺乳動物細胞系的轉(zhuǎn)化通過諸如感染或轉(zhuǎn)染的方法實現(xiàn)。使用傳統(tǒng)技術(shù)進行轉(zhuǎn)染，例如磷酸鈣沉淀、微注射、原生質(zhì)體融合、電穿孔法，即通過能瞬間提高細胞膜通透性的短電脈沖，或在幫助化合物例如二乙氨乙基葡聚糖、二甲亞砜、甘油或聚乙二醇等的存在下引入DNA。在轉(zhuǎn)染步驟之后，通過例如在根據(jù)選擇標記性質(zhì)所選擇的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞識別和選擇被轉(zhuǎn)染細胞，例如含有相應(yīng)的抗生素的標準培養(yǎng)基如Dulbecco改良細胞培養(yǎng)基(DMEM)、最低必需培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基等。
在一優(yōu)選具體實施方案中，重組棒狀病毒表達系統(tǒng)包括使用核酸感染哺乳動物細胞例如BSR細胞、CHO細胞、VERO細胞和BHK細胞或其它經(jīng)批準用于抗體制備的細胞，該核酸包含編碼抗體輕鏈或抗體重鏈或編碼兩者的核酸序列。細胞可以在允許制備本發(fā)明抗體的條件下培養(yǎng)?？贵w可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)分離和純化。
用于給藥的重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈或抗體重鏈可以被其它物質(zhì)修飾。使用其它物質(zhì)修飾抗體的方法，特別是標記，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。抗體修飾可以改變抗體活性，例如通過改變其特征諸如體內(nèi)組織分配、肽的降解速率或狂犬病毒中和活性。修飾還可以賦予化合物額外的特性，例如被觀測、操作或定位的能力。
重組狂犬病毒中和人抗體可用聚合和大分子結(jié)構(gòu)(例如脂質(zhì)體、沸石、樹枝狀聚合物、磁性微粒以及金屬珠)或靶基團(例如信號肽序列、配體、外源凝集素或抗體)加以修飾。修飾物可以例如通過化學(xué)方法(例如通過共價鍵、靜電作用、范德華力、氫鍵、離子鍵、螯合作用等)或通過物理包埋與鏈相結(jié)合。例如抗體可以用標記物修飾(例如具有磁共振活性的物質(zhì)；輻射密度物質(zhì)；熒光物質(zhì)；放射性物質(zhì)；超聲可探測物質(zhì)；可見、紅外或紫外光可探測物質(zhì))。合適的標記物包括例如異硫氰酸熒光素、肽發(fā)色團如藻紅蛋白或藻藍蛋白等；生物發(fā)光肽如源自北美螢火蟲(Photinus pyrali)的熒光素酶；或源自海腎(Renilla reniformi)的熒光蛋白。
本發(fā)明的一方面，抗體可以包含天冬氨酸(D)殘基以提高抗體的溶解度。另一方面，可以通過添加加合物如蔗糖或聚乙二醇以延長抗體壽命。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮到受試者的身材和體重、疾病滲透程度、受試者年齡、健康狀況和性別、給藥途徑、以及給藥是局部的還是系統(tǒng)的等因素后可以容易地確定對受試者給藥的重組狂犬病毒中和人抗體的有效量。一般地，對受試者的抗體給藥量依賴于需要被中和的狂犬病毒的量和抗體呈現(xiàn)的狂犬病毒中和活性量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以推導(dǎo)出給藥的合適劑量和計劃以適應(yīng)特定情況和受試者的需要。例如，根據(jù)受試者暴露的狂犬病毒量或受試者存在暴露風(fēng)險的狂犬病毒量可以估計用于共同給藥的各抗體的合適劑量。典型地，抗體劑量在大約0.001mg/kg和大約100mg/kg體重之間。在某些特定具體實施方案中，劑量在大約0.01mg/kg和大約60mg/kg體重之間。
應(yīng)當(dāng)明白有效量將依賴于受藥者的年齡、性別、健康狀況和體重，同期治療的種類，如果有的話，治療的頻率以及需要實現(xiàn)的效應(yīng)性質(zhì)。最優(yōu)選的劑量將根據(jù)受試者個體裁定，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有不當(dāng)實驗的情況下可以理解和確定該劑量。
重組狂犬病毒中和人抗體的混合物可以等摩爾濃度對需要該治療的受試者給藥。在另一個實施例中，抗體可以非等摩爾濃度給藥。在其它實施例中，抗體可以相對于每千克體重的等質(zhì)量蛋白給藥。例如，抗體可以根據(jù)受試者的體重等量給藥。在另一個實施例中，抗體可以非等量給藥。在其它實施例中，各抗體的給藥量可以根據(jù)抗體的中和活性。例如，給藥的混合物的狂犬病毒中和活性可在大約1IU/kg體重和大約50IU/kg體重之間。
一般地，狂犬病毒中和人抗體混合物給藥的計劃和時間根據(jù)所進行步驟可接受的操作確定。
當(dāng)在體內(nèi)使用時，抗體優(yōu)選地作為藥物組合物給藥，該組合物包含一種混合物和一種藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物中存在的抗體量可以在0.001至99.9wt％，更優(yōu)選地在大約0.01至99.0wt％，以及甚至更優(yōu)選地在0.1至50wt％。為了實現(xiàn)好的血漿濃度，抗體或抗體的混合物例如可作為含有0.1至1.0％活性試劑的溶液通過靜脈注射給藥。
所有不同的重組狂犬病毒中和人抗體的給藥不必在單個組合物中一同給藥。不同的重組狂犬病毒中和人抗體可以在分開的組合物中給藥。例如，如果對三種不同抗體給藥，三種不同抗體可以三種在分開的組合物中給藥。此外，各抗體可以同時給藥，或抗體可以依次連續(xù)給藥。這樣，重組狂犬病毒中和人抗體混合物可以以單個組合物給藥，或以包含一種或多種重組狂犬病毒中和人抗體的多種組合物給藥。
重組狂犬病毒中和人抗體和包含這些化合物的藥物組合物可以通過經(jīng)設(shè)計可使化合物具有生理學(xué)效應(yīng)的任何方法給藥?？梢砸阅c道或非腸道給藥；例如口服、直腸、潴泡內(nèi)(intracistemally)、陰道內(nèi)、腹腔內(nèi)、局部(例如粉劑、軟膏或滴液)給藥。腸道內(nèi)給藥為優(yōu)選。特別優(yōu)選的腸道內(nèi)給藥方法包括血管內(nèi)給藥(例如靜脈內(nèi)高劑量注射、靜脈灌注、動脈內(nèi)高劑量注射、動脈灌注和用滴藥導(dǎo)管滴入脈管系統(tǒng))、靶組織周邊和靶組織內(nèi)注射、皮下注射或沉積包括皮下灌注(例如通過滲透泵)、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射以及例如通過導(dǎo)管或其它放置裝置直接應(yīng)用在靶區(qū)域。
藥學(xué)上可接受的載體包括生理學(xué)上可容忍或可接受的稀釋劑、賦形劑、溶劑或佐劑。組合物優(yōu)選地是無菌的和非致熱性的。合適載體的實施例包括但不限于水、常規(guī)鹽、右旋糖、甘露醇、乳糖或其它糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸、乙醇、多羥基化合物(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(例如橄欖油)、可注射有機酯例如油酸乙酯、乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇及山梨醇酐酯、微晶纖維素、甲羥基鋁(aluminum methahydroxide)、膨潤土、高嶺土、瓊脂以及黃蓍膠或這些物質(zhì)的混合物等。
藥物組合物還可以包含少量的無毒輔助藥物或賦形劑以及/或添加劑，例如潤濕劑、乳化劑、pH緩沖試劑、抗菌和抗真菌試劑(例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)。合適的添加劑包括但不限于生理學(xué)上生物相容的緩沖液(例如氨基丁三醇鹽酸)、螯合劑(例如DTPA或DPTA雙酰胺)或鈣螯合絡(luò)合物(例如鈣-DPTA或鈣鈉DPTA雙酰胺)的加入(例如0.01至10摩爾百分比)或選擇性地加入(例如1至50摩爾百分比)鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。如果需要，可以使用吸收增強或延緩試劑(例如脂質(zhì)體、單硬脂酸鋁或凝膠)。組合物可以制備成傳統(tǒng)形式，抑或是液體溶液或懸浮劑、在注射前適于形成溶液或懸浮劑的固體形式或乳劑。肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)組合物是例如等滲水溶液或懸浮劑，選擇性地在使用之前不久從凍干或濃縮制劑制備。油懸浮劑包含作為油性成分的常規(guī)用于注射的蔬菜、合成或半合成油。藥物化合物可以是無菌的且含有例如用于保存、穩(wěn)定、潤濕、乳化或溶解成分的添加劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、調(diào)節(jié)粘度的緩沖液和/或化合物，例如羧基纖維素鈉、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、右旋糖苷、聚乙烯吡咯烷酮或凝膠。根據(jù)本發(fā)明的藥物化合物可以以本領(lǐng)域熟知的技術(shù)方式制備。
在抗體通過注射或直接使用進行給藥時，注射或直接使用可以是一劑或多劑。在化合物的給藥是通過灌注時，灌注可以是在延長的時間區(qū)間內(nèi)的單劑持續(xù)劑或多次灌注。
本發(fā)明不應(yīng)被理解為僅限于在此說明的實驗和方法，而應(yīng)理解為也包括其它實驗和分析。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明白其它的實驗和方法可用于實現(xiàn)在此說明的步驟。
沒有進一步的說明，應(yīng)當(dāng)相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過使用之前的說明和之后的說明性實施例能夠制備和利用重組狂犬病毒中和人抗體并操作權(quán)利要求的方法。因此以下的操作實施例特別指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但不應(yīng)理解為以任何方式對公開的其它內(nèi)容的限制。
實施例1-抗狂犬病毒重組表達人抗體(rhuMAbs)的制備和病毒中和活性抗體cDNA的制備三個雜交瘤，JA、JB和J57分泌命名為“SOJA”、“SOJB”和“SO57”的人單克隆抗體。這些單克隆抗體的生成和分析的具體細節(jié)在其它地方已被報道(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-90；Champion等，J.Immunol.Methods 2000 23581-90)。從JA、JB和J57雜交瘤中分離免疫球蛋白重鏈(Ig H)和免疫球蛋白輕鏈(Ig L)mRNA，使用棒狀病毒載體(RhV)在BSR或CHO細胞中高水平表達抗體。
為獲得Ig H和Ig L mRNA的完整核酸序列，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，使用Tri-Reagent手冊(Sigma)和RNeasy RNA提取試劑盒(Qiagen)從各雜交瘤細胞系中分離總RNA。
使用cDNA末端快速擴增試劑盒(GIBCO-BRL)和Ig H和Ig L基因恒定區(qū)3’端的基因?qū)Ｒ恍砸?GSPs)擴增Ig L和Ig H cDNA片段。簡言之，使用ThermoScript反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technology)和GSP在55℃對2.5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄60分鐘。隨后用核糖核酸酶H降解mRNA，且使用GlassMAX離心管(spin cartridges)純化cDNA。在用脫氧核苷末端轉(zhuǎn)移酶和dCTP在cDNA上加上dC尾巴后，用精簡錨定引物(GIBCO-BRL)和第二GSP對cDNA進行PCR擴增以獲得巢式產(chǎn)物。使用第三GSP對PCR產(chǎn)物再擴增，并用凝膠電泳純化產(chǎn)物并測序。作為最后一步，用DNASTAR軟件(DNAstar)和國家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站工具對序列進行分析。
為克隆全長的Ig H和Ig L cDNAs，使用10pmol寡dT引物、200單位Superscript II以及20單位核糖核酸酶抑制劑在含有第一鏈緩沖液、200μM dNTP和10mM二硫蘇糖醇的40μl的反應(yīng)體系中對1μg的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。隨后使用Expand高保真PCR系統(tǒng)(Roche)和10pmol與Ig L和Ig H cDNAs的5’端和3’端互補的引物對5μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物進行擴增。
對克隆的Ig cDNAs進行測序且GenBank的進入號如下SOJA IgL，AY172961(SEQ ID NO10)；SOJA Ig H，AY172959(SEQ ID NO11)；SOJB Ig L，AY172962(SEQ ID NO5)；SOJB Ig H，AY172958(SEQ ID NO3)；SO57 Ig L，AY172960(SEQ ID NO12)；以及SO57 Ig H，AY172957(SEQ ID NO8)。為了基因組裝，使用對應(yīng)于cDNAs的5’端(JAHF，5′-AAACGTACGATGGAGTTTGGG-CTGAGCTGGCTT-3′(SEQ ID NO13)；JBHF，5′-AACGTACGA-TGGACACACTTTGCTCCACGCTCCT-3′(SEQ ID NO14)；以及J57HF，5′-AAACGTACGACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCT-3′(SEQ ID NO15))的引物以及與各Ig H cDNAs的3’端互補和與由狂犬病毒轉(zhuǎn)錄中止/起始信號組成的連接序列互補的HR引物5′-GCTAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGACTCATTTACCCGGGGACAGGG A-3′(SEQ ID NO16)對JA、JB和J57 Ig H的cDNAs進行擴增(Morimoto等，J.Immunol.Methods 2001 252199-206)。
使用LF引物以及cDNAs的3’端引物(JALR，5′-AAAGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3′(SEQ IDNO18)；JBLR，5′-AAAGCTAGCCTATGAACATTCTGTAGGGGCCA-CTGT-3′(SEQ ID NO19)以及J57LR，5′-AAATCTAGACTATGAACA-TTCTGTAGGGGCCAC-3′(SEQ ID NO20))對Ig L的cDNA進行再擴增，LF引物包含連接區(qū)域和對不同輕鏈cDNAs的5’端的具有專一性的區(qū)域(5′-GGTAAATGAGTCATGAAAAAAACTAACACCCC-TAGCNNNNNNNNNN NNNNNNNNNN-3′(SEQ ID NO17)，其中N是cDNA輕鏈的5’端)。
重組棒狀病毒載體的構(gòu)建使用前述的狂犬病毒載體制備重組棒狀病毒載體(RhV)(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 20009714680-14685)?？袢《咎堑鞍谆?GenBank進入號NP 056796)的膜外和跨膜結(jié)構(gòu)域(GenBank進入號NC 001542)由皰疹性口炎病毒糖蛋白基因(VSV G)(GenBank進入號J02428)的膜外和跨膜結(jié)構(gòu)域取代(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-14685；Schnell等，J.Virology 1996 702318-2323；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 924477-4481)，在載體中生成嵌合的糖蛋白基因。生成的質(zhì)粒命名為pSN-VSV-G。
狂犬病毒糖蛋白基因帶有負責(zé)狂犬病毒的病原性的主要決定子(Dietzschold等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983 8070-74)。通過使用皰疹性口炎病毒糖蛋白基因膜外和跨膜序列替換狂犬病毒糖蛋白基因膜外和跨膜序列，形成了只存在有限的生物安全顧慮的重組棒狀病毒表達系統(tǒng)。
為構(gòu)建pSN-VSV-G載體，狂犬病毒G的胞質(zhì)尾巴從pSN用引物RP8，5′-CCTCTAGATTACAGTCTGGTCTCACCCCC-3′(XbaI，粗體)(SEQ ID NO21)和RP29，5′-CCCGGGTTAACAGAAGA-GTCAATCGATCAGAAC-3′(HpaI，粗體)(SEQ ID NO22)PCR擴增(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-14685)。VSV G基因的膜外和跨膜結(jié)構(gòu)域(GenBank進入號J02428)用引物RP33，5′-TTAAGTTAACCAAGAATAGTCCAATGA-3′(HpaI，粗體)(SEQ ID NO23)和RP34，5′-TCTCGAGCCCGGGACTATGAAGTGCCTT-TTGTAC-3′(XbaI，粗體)(SEQ ID NO24)從pVSV-XN1擴增(Schnell等，J.Virology 1996702318-2323)。兩PCR產(chǎn)物均用HpaI酶切并連接。連接產(chǎn)物用引物RP8和RP34再次擴增，且將PCR產(chǎn)物克隆進pSN的XmaI和XbaI位點。生成的質(zhì)粒命名為pSV-VSV-G(Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 9714680-1468)。
進一步修飾上述質(zhì)粒pSN-VSV-G(此后稱作pSPBN)從而允許插入和表達包含編碼抗體輕鏈序列、重鏈序列或兩者的核酸。使用PCR策略在糖蛋白(G)基因和聚合酶(L)基因之間引入BsiWI和NheI位點對質(zhì)粒進行修飾(見例如Foley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 20009714680-1468和Schnell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000 973544-3549)。生成的重組棒狀病毒載體被稱作RhV。
包含輕鏈和重鏈核酶序列的質(zhì)粒和重組病毒的制備通過PCR連接以上制備的Ig H和Ig L的cDNAs，且用BsiWI和NheI酶切生成的Ig L+連接子+Ig H cDNA并插入上述質(zhì)粒pSPNB的相應(yīng)位點。插入三種不同的Ig L+Ig H cDNAs，生成質(zhì)粒pSPBN-SOJA、pSPBN-SOJB以及pSPBN-SO57。
通過哺乳動物細胞制備抗體由上述質(zhì)粒產(chǎn)生的重組病毒按別處說明的方法(Morimoto等，J.Neurovirol.20006373-81)回收并用于以0.1MOI感染幼倉鼠腎(BHK)細胞的亞克隆BSR細胞或感染CHO細胞。在感染后，用Cellgro-FREE培養(yǎng)基(Mediatech)在34℃培養(yǎng)細胞。在培養(yǎng)3天后，收集組織培養(yǎng)上清并進行UV照射將病毒滅活。
表1證實了由受感染BSR細胞分泌至組織培養(yǎng)上清液中的三種不同重組表達人抗體的量?？梢钥闯鲇砂幋aSOJA、SOJB或SO57抗體的核酸的重組病毒感染的各BSR細胞以大約40μg/ml/48小時的速率生成重組人抗體。BSR細胞或CHO細胞的感染導(dǎo)致高水平的制備(≤40μg/ml/48小時)。
表1 抗狂犬病毒重組表達人單克隆抗體(rhuMAbs)的制備和病毒中和活性

注“CVS”是標準攻擊毒株；“DRV-4”是狗狂犬病毒4；“HRIG”是人狂犬病免疫球蛋白；“SHBRV-18”銀毛蝠狂犬病毒。
a在測試前，將純化的rhuMAbs和rhuMAb混合物(SOJA∶SOJB∶SO57蛋白質(zhì)比例1∶1∶1)調(diào)節(jié)至1mg/ml的蛋白濃度。
bHRIG按生產(chǎn)商制備的進行使用(150IU/ml；Bayer)。
親和層析對抗體的純化隨后從培養(yǎng)上清中純化出分泌至組織培養(yǎng)基中的各重組人抗體且將各樣品校準并調(diào)整至相同的蛋白含量。
使用蛋白A柱(蛋白A瓊脂糖凝膠，Amersham Pharmacia Biotech)純化IgG1抗體。簡言之，經(jīng)過0.45μm膜過濾使上清澄清并用1N NaOH將pH調(diào)整至8.0。上清以大約100cm/小時的線性流速經(jīng)過柱體。用PBS(pH 8)洗滌后，用0.1M檸檬酸溶液將抗體從柱上洗脫并對PBS進行透析。
IgG3抗體用蛋白G柱(蛋白G瓊脂糖凝膠，Amersham PharmaciaBiotech)純化。含有IgG3的上清通過0.45μm膜過濾澄清且用1N NaOH將pH調(diào)至7.0。上清以大約11cm/小時的線性流速流經(jīng)柱體。在用PBS洗滌后，用0.1M甘氨酸緩沖液，pH 3.0將抗體從柱上洗脫并隨后對PBS進行透析。
透析后的抗體制劑的蛋白濃度用以下蛋白質(zhì)檢測實驗確定(Bio-Rad Laboratories，Hercules CA)。將100μl樣品加入5ml染料濃縮劑的1/5稀釋液并在室溫放置10分鐘。在各試驗中包括陰性PBS對照和各種牛血清白蛋白(BSA)標準。在放置后，用分光光度計在595nm對樣品讀數(shù)。測試樣品的蛋白濃度參考BSA標準的吸收值計算。所有抗體制劑的純度用還原條件下的12.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定。純化后的抗體在SDS-PAGE上出現(xiàn)兩條主帶，對應(yīng)于分離出的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。
病毒中和活性由包含重組狂犬病毒中和人抗體的重組棒狀病毒表達系統(tǒng)感染的哺乳動物細胞產(chǎn)生的病毒中和活性量由快速熒光聚焦抑制實驗(RFFIT)確定(Morimoto等，J.Immunol.Methods 2001 252199-206)。確定病毒滴度降低是否為真的一種方法是當(dāng)病毒滴度降低＞100個感染單位實現(xiàn)的時候(Dietzschold等，J.Virol.1990 643087-3090)。此外，病毒中和抗體(VNA)滴度可以以國家健康研究所的參考血清作為標準用國際單位表達。中和活性典型地表達為單位每克蛋白或單位每毫升。用于病毒中和的狂犬病毒株在別處有所說明(Dietzschold等，J.Hum.Virol.2000 350-7；Morimoto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998953152-6)。用RFFIT分析各轉(zhuǎn)化細胞系的上清樣品中狂犬病毒中和抗體的存在。在96孔平底板(Nunc)中稀釋上清樣品(50μl)。在各測試樣品中加入已知能造成指示細胞80-90％感染的狂犬病毒稀釋液，將板在37℃培養(yǎng)1小時。在各實驗中包括了陰性培養(yǎng)基和陽性狂犬病免疫血清對照樣品。在培養(yǎng)后，在各孔中加入30μl濃度為1.8×106細胞/ml的BHK細胞并在37℃將培養(yǎng)物過夜培養(yǎng)。隨后用冰冷的PBS將板洗滌一次并用冰冷的90％丙酮在-20℃固定20分鐘。在固定后，去除丙酮將板風(fēng)干。為檢測受感染的BHK細胞，將40μl FITC抗狂犬病核蛋白單克隆球蛋白(Centocor，Malvern PA)在37℃加入各孔45分鐘。隨后用蒸餾水將板洗滌3次并在熒光顯微鏡下檢測。
對已從培養(yǎng)物上清中純化出的各重組人抗體測試它們中和狂犬病毒固定株(例如CVS-N2c和CVS-11)和街毒株(例如SHBRV-18和DRV-4)的能力。如同快速熒光聚焦抑制實驗所測試的，三種重組人抗體在中和不同狂犬病毒的能力上呈現(xiàn)出質(zhì)和量上的差異(表1)。此外，通過含有等摩爾濃度的三種重組人抗體的混合物獲得的狂犬病毒株的病毒中和抗體(VNA)滴度相對率與從HRIG獲得的相似，除了抗SHBRV-18 HRIG VNA滴度略高之外。
實施例2 用抗狂犬病人單克隆抗體混合物對小鼠的暴露后預(yù)防為確定SOJA、SOJB和SO57的重組人抗體混合物在體內(nèi)的保護活性，用10LD50狂犬病毒CVS-N2c鼻腔內(nèi)感染雌性Swiss Webster小鼠(10只/組)。1小時后，小鼠接受混合物或HRIG的單次治療。各治療后小組接受含有不同活性的混合物。制備的混合物中SOJA∶SOJB∶SO57蛋白比例為1∶1∶1。各抗體或抗體混合物的活性以國際單位(IU)表示。通過對WHO標準抗血清的滴定確定抗體的IU。小鼠接受的混合物的范圍在0-20IU/kg體重之間。隨后對小鼠進行5周觀察確定它們是否發(fā)展了狂犬病的臨床癥狀。計算接受SOJA∶SOJB∶SO57混合物治療的動物和接受HRIG治療的動物的治療有效量，在該劑量50％動物受到保護避免致命攻擊(ED50)。
如果狂犬病的臨床癥狀變得明顯，用CO2中毒對小鼠實施安樂死。在疑似患有狂犬病的動物腦組織印模上進行直接熒光抗體實驗對狂犬病的診斷進行確認。
用重組狂犬病毒中和人抗體混合物進行的暴露后預(yù)防治療在體內(nèi)預(yù)防了致命的狂犬病毒感染(表2)。此外，發(fā)現(xiàn)人抗體混合物的保護活性與HRIG的保護活性相當(dāng)(表2)。在使用20IU/kg時混合物保護了10只小鼠中的8只沒有發(fā)展狂犬病的臨床癥狀，但在2.5IU/kg的濃度下，沒有任何小鼠受保護未發(fā)展狂犬病臨床癥狀。小鼠發(fā)展狂犬病癥狀的ED50劑量是3.38IU/kg的HRIG和4.47IU/kg的rhuMAB混合物。
表2.用人狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)和抗狂犬病重組表達人單克隆抗體(rhuMAB)混合物進行小鼠的暴露后預(yù)防

aHRIG或混合物的給藥量。bSOJA∶SOJB∶SO57蛋白比例1∶1∶1。數(shù)據(jù)表示為出現(xiàn)狂犬病臨床癥狀的小鼠數(shù)目/測試小鼠數(shù)目。
實施例3-用重組抗狂犬病人單克隆抗體混合物進行倉鼠的暴露后預(yù)防在倉鼠暴露后預(yù)防模型中進一步檢測重組人抗體混合物的功效。
用50μl取自天然感染狂犬病的山狼的唾液腺組織勻漿攻擊2月大(100克；10只/組)的雌性敘利亞倉鼠(Harlan-Sprague-Dawley)。在左腓腸肌對動物進行接種。在用狂犬病毒接種4小時后，在10只倉鼠中起始含有20IU/kg rhuMAb混合物(如實施例2中所述)的暴露后預(yù)防治療。用50微升抗體制劑在動物接種病毒的相同位點進行一次給藥。沒有接受暴露后預(yù)防治療混合物的10只倉鼠作為對照動物。
此后，每日觀察動物共90天。如果在一只動物中的狂犬病臨床癥狀變得明顯，通過CO2中毒對該動物施行安樂死。在安樂死后對狂犬病的診斷進行確認。使用直接熒光抗體實驗對狂犬病診斷進行確認，該實驗在疑似患有狂犬病的動物腦組織壓模上進行。
用SOJA/SOJB/SO57抗體混合物給藥的所有10只倉鼠均存活。但是，所有的對照動物均死于狂犬病。使用的病毒劑量含有～106.8MICLD50/ml濃度的犬類RV變體(COSRV)，該變體在美國/墨西哥接壤地區(qū)流行，因此成為公共健康的重要關(guān)注。預(yù)計該劑量在肌肉內(nèi)接種后導(dǎo)致80-100％的死亡率。
在此引用的各專利、專利申請以及公開物的公開內(nèi)容由此完整地作為參考加以引用。
盡管參考特定具體實施方案對本發(fā)明進行了公開，很明顯的，在不悖離本發(fā)明的真正精神和范圍的基礎(chǔ)上本領(lǐng)域的其它技術(shù)人員可以實現(xiàn)其它具體實施方案和本發(fā)明的變化。所附權(quán)利要求書應(yīng)當(dāng)被理解為包括所有這些具體實施方案和等同的變化。
序列表<110>托馬斯杰斐遜大學(xué)(Thomas Jefferson University)<120>重組抗體及組合物及其制備和使用方法<130>EP05-2817-XC20<150>US 10/461,148<151>2003-06-13<160>24<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>474<212>PRT<213>人<400>1Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly His Ser Thr Tyr Leu Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Glu Val Thr Met Ile Val Val Leu Asn115 120 125Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys145 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175
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catatcagca gcttcccgtg gttcgattcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420tcagcttcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctct 480gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc ggtgacggtg 540tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660acctacacct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720ctcaaaaccc cacttggtga cacaactcac acatgcccac ggtgcccaga gcccaaatct 780tgtgacacac ctcccccgtg cccacggtgc ccagagccca aatcttgtga cacacctccc 840ccgtgcccac ggtgcccaga gcccaaatct tgtgacacac ctcccccatg cccacggtgc 900ccagcacctg aactcctggg aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggat 960acccttatga tttcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1020gaccccgagg tccagttcaa gtggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1080aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1140caccaggact ggctgaacgg taaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1200gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggacagc cccgagaacc acaggtgtac 1260accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1320aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcagcgggca gccggagaac 1380aactacaaca ccacgcctcc catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1440ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacatct tctcatgctc cgtgatgcat 1500gaggctctgc acaaccgctt cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1557<2l0>4<211>518<212>PRT<213>人<400>4Met Asp Thr Leu Cys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Ser Trp1 5 10 15Val Leu Ser Gln Ile Thr Leu Lys Glu Thr Gly Pro Thr Leu Val Lys20 25 30Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu35 40 45Ser Thr Ser Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys50 55 60Ala Leu Glu Trp Val Thr Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr65 70 75 80Ser Pro Ser Leu Glu Asn Arg Val Thr Ile Arg Lys Asp Thr Ser Lys85 90 95Asn Gln Val Ala Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Leu Asp Thr Gly100 105 110Thr Tyr Tyr Cys Ala HisArg Gln His Ile Ser Ser Phe Pro Trp Phe115 120 125Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
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145 150 155 160Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val165 170 175Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr180 185 190Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu195 200 205Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln210 215 220Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu225 230 235 240Cys Ser<210>8<211>1431<212>DNA<213>人<400>8atggactgga cctggaggtt cctctttgtg gtggcagcag ctacaggtgt ccagtcccag 60gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc 120tgcaaggctt ctggaggcac cttcaacagg tatactgtca actgggtgcg acaggcccct 180ggacaagggc ttgagtggat gggaggcatc atccctatct ttggtacagc aaactacgca 240cagaggttcc agggcagact caccattacc gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg 300gagctgagca gcctgagatc tgatgacacg gccgtgtatt tctgtgcgag agagaatctc 360gataattcgg ggacttatta ttatttctca ggctggttcg acccctgggg ccagggaacc 420ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 480tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 600gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 720gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1320gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaatg a 1431
<210>9<211>476<212>PRT<213>人<400>9Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe35 40 45Asn Arg Tyr Thr Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala65 70 75 80Gln Arg Phe Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Asn Leu Asp Asn Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr115 120 125Phe Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val130 135 140Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser145 150 155 160Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys165 170 175Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu180 185 190Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu195 200 205Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr210 215 220Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val225 230 235 240Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro245 250 255Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe260 265 270Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val275 280 285Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
290 295 300Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro305 310 315 320Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr325 330 335Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val340 345 350Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala355 360 365Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg370 375 380Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly385 390 395 400Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro405 410 415Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser420 425 430Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln435 440 445Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His450 455 460Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470 475<210>10<211>705<212>DNA<213>人<400>10atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120ctcgcctgca gggccagtca gactgctagc aggtacttag cctggtacca acagaaacct 180ggccaggctc ccagactcct catctatgat acatccaaca gggccactgg catcccagcc 240aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctct ccatcagcag cctggagcct 300gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtttcaact ggccgtggac gttcggccaa 360gggaccaagg tggaattcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705<210>11
<211>1425<212>DNA<213>人<400>11atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgt tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gggggtccct gagactctcc 120tgtgcagcct ctggattcac ctttagcaac tatgccatga gctgggtccg ccaggctcca 180gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtgctagtg gtcatagcac atatttggca 240gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agatcgagag 360gttactatga tagttgtact taatggaggc tttgactact ggggccaggg aacccgggtc 420accgtctcct ccgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 480agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 600ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 660ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 780ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 900aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 960gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1020ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1320aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aatga 1425<210>12<211>729<212>DNA<213>人<400>12atgagtgtcc ccaccatggc ctgggctctg ctcctcctca gcctcctcac tcagggcaca 60ggatcctggg ctcagtctgc cctgactcag cctcgctcag tgtccgggtc tcctggacag 120tcagtcacca tctcctgcac tggaaccagc agtgatattg gtggttataa ctttgtctcc 180tggtaccaac aacacccagg caaagccccc aaactcatga tttatgatgc cactaagcgg 240ccctcagggg tccctgatcg cttctctggc tccaagtctg gcaacacggc ctccctgacc 300atctctgggc tccaggctga ggatgaggct gattattact gctgctcata tgcaggcgac 360tacaccccgg gcgtggtttt cggcggaggg accaagctga ccgtcctagg tcagcccaag 420gctgccccct cggtcactct gttcccgccc tcctctgagg agcttcaagc caacaaggcc 480
acactggtgt gtctcataag tgacttctac ccgggagccg tgacagtggc ctggaaggca 540gatagcagcc ccgtcaaggc gggagtggag accaccacac cctccaaaca aagcaacaac 600aagtacgcgg ccagcagcta cctgagcctg acgcctgagc agtggaagtc ccacagaagc 660tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc accgtggaga agacagtggc ccctacagaa 720tgttcatag 729<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13aaacgtacga tggagtttgg gctgagctgg ctt 33<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14aacgtacgat ggacacactt tgctccacgc tcct 34<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15aaacgtacga ccatggactg gacctggagg ttcct35<210>16<211>49<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>16tgctaggggt gttagttttt ttcatgactc atttacccgg ggacaggga 49<210>17<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物，其中n是輕鏈cDNAs的5’端<221>misc_feature<222>(1)...(56)<223>n＝A，T，C or G<400>17ggtaaatgag tcatgaaaaa aactaacacc cctagcnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 56<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18aaagctagcc taacactctc ccctgttgaa gctc 34<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19aaagctagcc tatgaacatt ctgtaggggc cactgt 36<210>20
<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20aaatctagac tatgaacatt ctgtaggggc cac 33<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21cctctagatt acagtctggt ctcaccccc 29<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>22cccgggttaa cagaagagtc aatcgatcag aac 33<210>23<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23ttaagttaac caagaatagt ccaatga 27<210>24
<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24tctcgagccc gggactatga agtgcctttt gtac 3權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，含有藥學(xué)上可接受的載體和至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體，其中至少兩種抗體中的至少一種選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9的抗體重鏈的抗體。
4.一種在需要治療的受試者體內(nèi)治療或預(yù)防狂犬病毒感染的方法，包括以至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體的有效量對受試者給藥，其中至少兩種抗體中至少一種選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體呈現(xiàn)出對不同狂犬病毒的中和活性。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中用至少兩種不同重組狂犬病毒中和人抗體分別給藥。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中用至少三種不同重組狂犬病毒中和人抗體給藥。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9的抗體重鏈的抗體。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體以大約等摩爾濃度的混合物給藥。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體以大約等重量給藥。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中給藥的抗體量在大約0.001mg/kg體重至大約100mg/kg體重之間。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中給藥的抗體量在大約0.01mg/kg體重至大約60mg/kg體重之間。
14.如權(quán)利要求5所述的方法，其中至少三種不同重組狂犬病毒中和人抗體包含大約1IU/kg體重至大約50IU/kg體重之間的狂犬病毒中和活性。
15.如權(quán)利要求5所述的方法，其中狂犬病毒是狂犬病毒固定毒株或街毒株。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中狂犬病毒街毒株選自銀毛蝠狂犬病毒、山狼狂犬病毒街毒/墨西哥狗狂犬病毒以及狗狂犬病毒。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中銀毛蝠狂犬病毒是銀毛蝠狂犬病毒-18。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中狗狂犬病毒是狗狂犬病毒-4。
19.如權(quán)利要求5所述的方法，其中受試者是人。
20.如權(quán)利要求5所述的方法，其中至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體腸道外給藥。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中腸道外給藥方式選自血管內(nèi)給藥、組織周邊和組織內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、皮下沉積和皮下灌注。
22.一種重組棒狀病毒表達載體，包含(i)編碼皰疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列；以及(ii)編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈或抗體重鏈或抗體輕鏈和抗體重鏈兩者的核酸序列。
23.如權(quán)利要求22所述的重組棒狀病毒表達載體，其中載體進一步包含編碼啟動子序列的核酸序列，所述序列與(i)編碼皰疹性口炎病毒糖蛋白序列的核酸序列；以及(ii)編碼重組狂犬病毒中和人抗體的抗體輕鏈、或抗體重鏈、或抗體輕鏈以及抗體重鏈兩者的核酸序列可操作地連接。
24.如權(quán)利要求23所述的重組棒狀病毒表達載體，其中載體編碼抗體輕鏈，所述抗體輕鏈選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈。
25.如權(quán)利要求23所述的重組棒狀病毒表達載體，其中載體編碼抗體重鏈，所述抗體重鏈選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQ ID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQ ID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQ ID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈。
26.一種宿主哺乳動物細胞，包含重組棒狀病毒表達載體，所述載體選自如權(quán)利要求22、23、24和25所述的重組棒狀病毒表達載體。
27.如權(quán)利要求26所述的宿主哺乳動物細胞，其中哺乳動物細胞選自BSR細胞、幼倉鼠細胞、VERO細胞和中國倉鼠卵巢細胞。
28.一種在哺乳動物細胞中制備重組狂犬病毒中和人抗體的方法，包含在允許重組狂犬病毒中和人抗體表達的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求26所述的細胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中重組狂犬病毒中和人抗體在哺乳動物細胞內(nèi)制備，所述哺乳動物細胞選自BSR細胞、幼倉鼠細胞、VERO細胞以及中國倉鼠卵巢細胞。
30.至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體的混合物在制備用于治療和預(yù)防需要治療的受試者體內(nèi)的狂犬病毒感染的藥物上的應(yīng)用，其中至少一種抗體選自a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
31.如權(quán)利要求30所述的抗體混合物的應(yīng)用，其中至少兩種重組狂犬病毒中和人抗體呈現(xiàn)出對不同狂犬病毒的中和活性。
32.如權(quán)利要求30所述的抗體混合物的應(yīng)用，其中混合物包含至少三種不同的重組狂犬病毒中和抗體。
33.如權(quán)利要求32所述的抗體混合物的應(yīng)用，其中抗體包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1或與SEQID NO1基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4或與SEQID NO4基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7基本上同源的序列的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9或與SEQID NO9基本上同源的序列的抗體重鏈的抗體。
34.如權(quán)利要求33所述的抗體混合物的應(yīng)用，其中抗體包含a)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO2的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO1的抗體重鏈的抗體；b)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO6的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO4的抗體重鏈的抗體；以及c)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO7的抗體輕鏈以及具有氨基酸序列SEQ ID NO9的抗體重鏈的抗體。
全文摘要
為狂犬病毒中和抗體在對暴露于狂犬病毒的受試者進行暴露后預(yù)防治療中的應(yīng)用提供了方法和組合物。包含狂犬病毒中和抗體混合物的組合物以及編碼這些抗體的核苷酸和氨基酸序列可用于對暴露于狂犬病毒的受試者的治療。本發(fā)明還提供了使用重組表達載體在哺乳動物細胞內(nèi)制備重組狂犬病毒中和人抗體的方法。
文檔編號C12N15/00GK1805757SQ200480016584
公開日2006年7月19日 申請日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月13日
發(fā)明者道格拉斯·C·胡珀, 伯恩哈德·迪奇奧德 申請人:托馬斯杰斐遜大學(xué)