專利名稱：融合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及異源融合蛋白質(zhì)，其包含活性治療肽和具有延長活性治療肽的體內(nèi)半壽期作用的免疫球蛋白的恒定重鏈(Fc)部分。這些異源融合蛋白質(zhì)可用于治療人類疾病以及多種其他病癥或疾病。
許多活性治療肽在治療多種疾病的臨床試驗(yàn)中很有前景。然而，使用這些肽的治療有用性由于許多肽活性差，在體內(nèi)迅速被清除或者具有非常短的體內(nèi)半壽期的事實(shí)受到局限。已經(jīng)進(jìn)行多種方法以在保持生物活性同時延長這些肽的清除半壽期或減少身體中這些肽的清除。一種方法包括融合活性治療肽與免疫球蛋白的恒定重鏈(Fc)部分。免疫球蛋白一般在體內(nèi)具有長的循環(huán)半壽期。例如IgG分子在人類中具有長達(dá)23天的半壽期。免疫球蛋白的Fc部分部分地與此體內(nèi)穩(wěn)定性相關(guān)。這些異源融合蛋白質(zhì)在保持該肽穩(wěn)定性的同時具有免疫球蛋白的Fc部分提供的穩(wěn)定性。
雖然此方法對肽治療法是可行的(見WO 02/46227)，但是會考慮半抗體形成、不需要的效應(yīng)子功能、糖基化位點(diǎn)和異質(zhì)性表達(dá)。本發(fā)明探索通過鑒定和替換在所述分子的Fc部分中多個位置上的氨基酸從而減少半抗體形成和減輕或消除效應(yīng)子功能來克服這些問題。另外，本發(fā)明還提供了鑒定和替換在所述分子的Fc部分中多個位置上的氨基酸從而使得所述分子在表達(dá)期間中不具有糖基化位點(diǎn)并具有降低的異質(zhì)性的方法。此外，希望鑒定和替換在所述分子的Fc部分中多個位置上的氨基酸從而在異源融合蛋白質(zhì)的反復(fù)和長期施用之后不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的化合物包括含有與免疫球蛋白的Fc部分融合的活性治療肽的異源融合蛋白質(zhì)，其中所述的免疫球蛋白的Fc部分包含SEQ ID NO1Xaa1-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230(SEQ ID NO1)的序列，其中1位的Xaa為Ala或不存在；16位的Xaa為Pro或Glu；17位的Xaa為Phe、Val、或Ala；18位的Xaa為Leu、Glu、或Ala；80位的Xaa為Asn或Ala；以及230位的Xaa為Lys或不存在。
本發(fā)明的肽部分和Fc部分直接或由接頭融合在一起。接頭的實(shí)例為具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)的富G的肽接頭。其他接頭的實(shí)例包括但不限于Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(1.5L)(SEQ ID NO4)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(2L)(SEQ ID NO6)、Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys(SEQ ID NO7)和Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO8)。
將肽部分的C端和Fc部分的N端融合到一起。備選地，將肽部分的N端部分和Fc部分的C端融合到一起。此外，將肽部分的C端與Fc部分的N端融合并且將另一肽分子的N端與Fc部分的C端融合得到肽-Fc-肽融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明異源融合蛋白質(zhì)的多核苷酸以及包含此類多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明也包括治療患有人類疾病以及多種其他病癥或疾病的患者的方法，其包括施用異源融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)包含活性治療肽部分和Fc部分。Fc部分包含人IgG4序列的替換，其與未和Fc序列融合的活性治療肽相比為異源融合蛋白質(zhì)提供增加的體內(nèi)穩(wěn)定性。
本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)含有來自人類IgG4，但是與野生型人類序列相比包括一個或多個替換的Fc部分。如此處所使用，免疫球蛋白的Fc部分具有免疫學(xué)領(lǐng)域通常賦予該術(shù)語的意義。該術(shù)語尤其指不含有來自該抗體兩個抗原結(jié)合區(qū)(Fab片段)的抗體片段。Fc部分由通過非共價相互作用和二硫鍵結(jié)合的抗體的兩個重鏈恒定區(qū)組成。Fc部分可以包含鉸鏈區(qū)，并經(jīng)CH2和CH3結(jié)構(gòu)域延伸到抗體C末端。Fc部分還可以包含一個或多個糖基化位點(diǎn)。
有五種類型的具有不同效應(yīng)子功能和藥物動力學(xué)特性的人類免疫球蛋白。IgG是五種類型中最穩(wěn)定的，在人體具有約23天的血清半壽期。有四個IgG亞類(G1、G2、G3和G4)，各亞類具有稱作效應(yīng)子功能的不同生物學(xué)功能。這些效應(yīng)子功能通常由與Fc gamma受體(FcγR)的相互作用或通過結(jié)合補(bǔ)體1(C1q)亞成分介導(dǎo)，其中所述的補(bǔ)體1亞成分識別并結(jié)合免疫球蛋白G或免疫球蛋白M的重鏈，啟動經(jīng)典補(bǔ)體途徑。與FcγR的結(jié)合可以導(dǎo)致抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，而與補(bǔ)體因子的結(jié)合可以導(dǎo)致補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。在僅利用Fc部分延長半壽期的能力的異源融合蛋白質(zhì)的設(shè)計中，將效應(yīng)子功能最小化是重要的。因此，本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)來自人類IgG4Fc區(qū)域，因其與其他IgG亞型相比結(jié)合FcγR和補(bǔ)體因子的能力降低。然而，已經(jīng)表明IgG4耗竭人體中靶細(xì)胞[Issacs等人，(1996)Clin.Exp.Immunol.106427-433]。因?yàn)楸景l(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)靶定體內(nèi)多種器官的細(xì)胞，在異源融合蛋白質(zhì)中使用IgG4衍生區(qū)域可通過異源蛋白質(zhì)與靶細(xì)胞上的受體相互作用啟動針對細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此，作為本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)一部分的IgG4 Fc區(qū)域含有消除效應(yīng)子功能的替換。本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)的IgG4 Fc部分可以含有一個或多個下列替換在殘基233處以脯氨酸替換谷氨酰胺，在殘基234處以丙氨酸或纈氨酸替換苯丙氨酸，以及在殘基235處以丙氨酸或谷氨酰胺替換亮氨酸(EU編號方式，Kabat，E.A.等人，(1991)《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第五版，U.S.Dept.of Health and HumanServices，Bethesda，MD，NIH出版91-3242)。這些殘基對應(yīng)于SEQ ID NO1中的第16、17和18位。另外，在對應(yīng)于SEQ ID NO1第80位的第297個殘基(EU編號)以Ala替換Asn而去除IgG4Fc區(qū)域中N-連接的糖基化位點(diǎn)是保證消除異源融合蛋白質(zhì)消除殘留效應(yīng)子活性的另一條路徑。
另外，本發(fā)明異源融合蛋白質(zhì)的IgG4Fc部分含有穩(wěn)定重鏈二聚體結(jié)構(gòu)和防止半IgG4Fc鏈形成的替換。本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)優(yōu)選以通過二硫鍵和多種非共價相互作用連接的二聚體存在。野生型IgG4含有在殘基224處(EU編號)開始的Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys(SEQ ID NO3)基序。單個活性治療肽-Fc鏈中的該基序與另一條活性治療肽-Fc鏈中的對應(yīng)基序形成二硫鍵。然而，該基序中絲氨酸的存在引起單鏈異源融合蛋白質(zhì)的形成。本發(fā)明包含異源融合蛋白質(zhì)，其中IgG4序列經(jīng)過進(jìn)一步修飾，從而以脯氨酸替換第228位(EU編號)的絲氨酸(SEQ ID NO1中的第11個氨基酸殘基)。
在此討論的異源融合蛋白質(zhì)的IgG4衍生的Fc部分中可以缺失存在于天然分子中的C末端賴氨酸殘基(SEQ ID NO1第230位；將缺失的賴氨酸稱為des-K)。某些細(xì)胞型(例如NS0細(xì)胞)表達(dá)的、其中賴氨酸由C末端密碼子編碼的異源融合蛋白質(zhì)是異質(zhì)的，因?yàn)橐徊糠址肿訉①嚢彼嶙鳛镃末端氨基酸，而一部分缺失賴氨酸。該缺失歸因于某些類型的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)過程中蛋白酶的作用。因此，為了避免這種異質(zhì)性，異源融合表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選缺乏C末端賴氨酸密碼子。
活性治療肽部分的C末端氨基酸優(yōu)選通過富含甘氨酸的接頭與IgG4Fc類似物部分的N末端融合?？梢酝ㄟ^加入小的肽接頭防止?jié)撛诘牟槐匾慕Y(jié)構(gòu)域相互作用來優(yōu)化本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)功能和穩(wěn)定性。另外，富含甘氨酸的接頭提供了一定的結(jié)構(gòu)柔性，使活性治療肽部分可以與靶細(xì)胞上的活性治療肽有效地相互作用。然而，這些接頭可以顯著增加異源融合蛋白質(zhì)體內(nèi)免疫原性的危險。因此，優(yōu)選不多于必要的長度以防止不必要的結(jié)構(gòu)域相互作用和/或優(yōu)化生物學(xué)活性和/或穩(wěn)定性。優(yōu)選的富含甘氨酸的接頭包括序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)。盡管在本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)中可以使用該接頭的更多拷貝，優(yōu)選使用該接頭的單拷貝以最小化與長期和反復(fù)施用有關(guān)的免疫原性危險。
活性治療肽可不局限地為酶、酶抑制劑、抗原、抗體、激素、參與凝固控制的因子、干擾素、細(xì)胞因子、生長因子和/或分化因子、參與骨組織發(fā)生/再吸收的因子、參與細(xì)胞運(yùn)動或遷移的因子、殺細(xì)菌或抗真菌因子、趨化因子、細(xì)胞靜止因子、血漿或間質(zhì)粘連分子或細(xì)胞外基質(zhì)，或備選地為與循環(huán)和間質(zhì)隔室病理和例如動脈或靜脈血栓形成、癌轉(zhuǎn)移、腫瘤血管發(fā)生、炎性休克、自身免疫病、骨和骨關(guān)節(jié)病理等等相關(guān)的分子和/或胞間相互作用的拮抗劑或激動劑?；钚灾委熾牡膶?shí)例包括但不限于G-CSF、GM-CSF、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)-CSF、巨噬細(xì)胞(M)-CSF、多CSF、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、c-kit配體、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)21、干細(xì)胞因子(SCF)、肥大細(xì)胞生長因子、紅細(xì)胞類增強(qiáng)活性(erythroidpotentiating activity)(EPA)、乳鐵蛋白(LF)、H亞基鐵蛋白(即酸性異鐵蛋白)、前列腺素(PG)E1和E2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、-β(即淋巴毒素)、干擾素(IFN)-α(1b、2a和2b)、-β、-ω和-γ；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、激活蛋白、抑制素、白血病抑制因子、制瘤素M、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1-α(即干細(xì)胞抑制劑)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1β、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-2-α(即GRO-β)、GRO-α、MIP-2-β(即GRO-γ)、血小板因子4、巨噬細(xì)胞趨化性和活化因子、IP-10、降鈣素、生長激素、PTH、TR6、BLyS、BLyS單鏈抗體、抵抗蛋白、生長激素釋放因子、VEGF-2、KGF-2、D-SLAM、KDI、TR2、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽4和神經(jīng)肽垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)、或者其受體PAC-1、VPAC-1或VPAC-2之一、或者前面提到的肽的任意一種的活性類似物、片段或衍生物。
本文所用的指異源融合蛋白質(zhì)的名稱定義如下L指具有序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO2)的接頭。緊接L前面的數(shù)字指將活性治療肽部分和Fc部分分開的接頭數(shù)。以1.5L表示的接頭指序列Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO4)。以2L表示的接頭指序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO6)。IgG4指SEQ ID NO1表示的人IgG4Fc序列類似物。異源融合蛋白質(zhì)IgG4Fc部分的替換顯示于圓括號中。野生型氨基酸以常用縮寫表示，其后跟隨使用EU編號系統(tǒng)的在整個IgG4序列中的位置號，隨后為該位置以常用縮寫表示的被替換的氨基酸。
盡管可以通過多種不同的方法制備本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)，但是由于異源融合蛋白質(zhì)的大小，優(yōu)選重組方法。對于在此處所公開并要求保護(hù)的本發(fā)明，下面定義下列常見分子生物學(xué)術(shù)語及縮寫。
此處使用的“堿基對”或“bp”指DNA或RNA。當(dāng)縮寫A、C、G和T出現(xiàn)在DNA分子中時，分別相應(yīng)于脫氧核糖核苷(脫氧)腺苷、(脫氧)胞苷、(脫氧)鳥苷和胸苷的5′-單磷酸形式。當(dāng)縮寫U、C、G和A出現(xiàn)在RNA分子中時，分別相應(yīng)于核糖核苷尿嘧啶核苷、胞苷、鳥苷和腺苷的5′-單磷酸形式。在雙鏈DNA中，堿基對可以指A與T或C與G的配對。在DNA/RNA中，異源雙鏈體堿基對可以指A與U或C與G的配對。(見下文“互補(bǔ)”的定義。)DNA的“消化”或“限制”指用限制酶的催化切割DNA，所述限制酶僅作用在DNA中特定序列(“序列特異性核酸內(nèi)切酶”)。此處使用的多種限制性酶可以通過商業(yè)途徑獲得，并且它們的反應(yīng)條件、輔因子和其他要求是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。特定限制性酶的適宜緩沖液和底物量由制造商說明，或者易于在文獻(xiàn)中找到。
“連接”指兩個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程。除非另有提供，可以使用公知緩沖液和條件以DNA連接酶例如T4DNA連接酶完成連接。
“質(zhì)?！敝溉旧w外(通常)自我復(fù)制的遺傳元件。
此處使用的“重組DNA克隆載體”指包含可以或已經(jīng)加入一個或多個額外DNA片段的DNA分子的任何自主復(fù)制的介質(zhì)，包括但是不限于質(zhì)粒和噬菌體。
此處使用的“重組DNA表達(dá)載體”指整合了控制插入DNA轉(zhuǎn)錄的啟動子的任何重組DNA克隆載體。
“轉(zhuǎn)錄”指將DNA核酸序列中含有的信息轉(zhuǎn)移到互補(bǔ)RNA序列的過程。
“轉(zhuǎn)染”指宿主細(xì)胞對表達(dá)載體的吸收，無論事實(shí)上是否表達(dá)任何編碼序列。普通技術(shù)人員已知大量轉(zhuǎn)染方法，例如磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔。當(dāng)該載體作用的任何指征出現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)時，一般認(rèn)為成功轉(zhuǎn)染。
“轉(zhuǎn)化”指將DNA引入生物體，該DNA從而可以作為染色體外元件或通過染色體整合而復(fù)制。轉(zhuǎn)化細(xì)菌和真核宿主的方法在本領(lǐng)域廣為人知，在J.Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》(1989)中總結(jié)了許多方法，例如核注射、原生質(zhì)體融合或通過使用氯化鈣的鈣處理。通常，將DNA引入酵母時，術(shù)語轉(zhuǎn)化與術(shù)語轉(zhuǎn)染相對使用。
此處使用的“翻譯”指使用信使RNA(mRNA)的遺傳信息指定并指導(dǎo)多肽鏈合成的過程。
“載體”指用于基因操作中細(xì)胞轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)化的核酸化合物，其攜帶對應(yīng)于適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子的多核苷酸序列，其當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂菩蛄薪M合時把特定性質(zhì)賦予將被轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。質(zhì)粒、病毒和噬菌體是適宜的載體。使用限制性酶和連接酶切割和連接不同來源的DNA分子構(gòu)建人工載體。此處使用的術(shù)語“載體”包括重組DNA克隆載體和重組DNA表達(dá)載體。
此處使用的“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”指雙鏈核酸中通過氫鍵結(jié)合的堿基對(嘌呤和嘧啶)。下列堿基對是互補(bǔ)的鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
“引物”指起酶或合成延伸的啟動底物功能的核酸片段。
“啟動子”指指導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄為RNA的DNA序列。
“探針”指與另一種核酸化合物雜交的核酸化合物或其片段。
“前導(dǎo)序列”指可以經(jīng)酶或化學(xué)去除產(chǎn)生所需目的多肽的氨基酸序列。
“分泌信號肽”指通常出現(xiàn)在較大多肽N末端區(qū)域的氨基酸序列，其功能是啟動所述多肽與細(xì)胞膜隔室例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合以及該多肽通過質(zhì)膜分泌。
可以從多種來源獲得野生型人類IgG4蛋白質(zhì)。例如，可以從以可檢測水平表達(dá)目的mRNA的細(xì)胞制備cDNA文庫以獲得這些蛋白質(zhì)。使用特定目的蛋白質(zhì)的公開的DNA或蛋白質(zhì)序列設(shè)計的探針可以對文庫進(jìn)行篩選。例如，在Adams等人，(1980)Biochemistry 192711-2719；Goughet等人，(1980)Biochemistry 192702-2710；Dolby等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 776027-6031；Rice等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA797862-7862；Falkner等人，(1982)Nature 298286-288；以及Morrison等人，(1984)Ann.Rev.Immunol.2239-256中描述了免疫球蛋白輕或重鏈恒定區(qū)。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)程序以所選探針篩選cDNA或基因組文庫，例如在Sambrook等人，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY(1989)中所述。分離編碼免疫球蛋白蛋白質(zhì)的基因的備選方法是使用PCR方法[Sambrook等人，如上；Dieffenbach等人，《PCR PrimerA Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY(1995)]?？梢曰谝寻l(fā)表的序列設(shè)計PCR引物。
從特定文庫克隆的全長野生型序列一般可用作產(chǎn)生本發(fā)明IgG4Fc類似物片段的模板，其中所述的IgG4Fc類似物片段保持對作為異源融合蛋白質(zhì)一部分的活性治療肽更長血漿半壽期的能力?？捎靡锸褂肞CR技術(shù)產(chǎn)生IgG4Fc類似物片段，其中所述的引物設(shè)計用來和與所述片段的所希望的末端對應(yīng)的序列雜交。也可設(shè)計PCR引物產(chǎn)生限制性酶切位點(diǎn)以便于克隆到表達(dá)載體中。
可通過多種不同方法產(chǎn)生編碼本發(fā)明活性治療肽的DNA，所述方法包括如前面所述的克隆方法以及化學(xué)合成DNA。如果編碼肽的長度短，那么化學(xué)合成是吸引人的。公知并公開了活性治療肽的氨基酸序列[Lopez，等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 805485-5489；Bell，等人(1983)Nature，302716-718；Heinrich，G.，等人(1984)Endocrinol，1152176-2181；Ghiglione，M.，等人(1984)Diabetologia 27599-600]。
然后可通過將編碼活性治療肽的DNA與編碼本文所述IgG Fc蛋白質(zhì)的DNA連接在框內(nèi)構(gòu)建編碼異源融合蛋白質(zhì)的基因?？稍谶B接前或在編碼完整異源融合蛋白質(zhì)的背景中突變編碼活性治療蛋白質(zhì)和IgG4Fc片段的DNA。本領(lǐng)域熟知多種誘變技術(shù)。編碼活性治療蛋白質(zhì)的基因和編碼IgG4Fc類似物蛋白質(zhì)的基因也可由編碼富含甘氨酸接頭肽的DNA連接在框內(nèi)。編碼本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)之一
Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A，des K)的DNA序列的實(shí)例在SEQ ID NO5中提供CACGGCGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAGGAGCAGGCCGCCAAGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGCGGCGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT(SEQ ID NO5)以此處所述用于異源融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在經(jīng)改良適于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼所希望的序列的基因的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。技術(shù)人員不用過多實(shí)驗(yàn)方法即可以選擇例如培養(yǎng)基、溫度、pH等培養(yǎng)條件。一般而言，可以在《Mammalian CellBiotechnologyA Practical Approach》，M.Butler編(IRL Press，1991)和如上之Sambrook等人著作中找到將細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)力最大化的原理、方法和實(shí)踐技術(shù)。普通技術(shù)人員已知轉(zhuǎn)染方法，例如CaPO4和電穿孔。在美國專利號4,399,216中描述了哺乳動物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面。通常根據(jù)van Solingen等人，J Bact.130(2)946-7(1977)和Hsiao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(8)3829-33(1979)的方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。然而，也可以使用將DNA引入細(xì)胞的其他方法，例如核微注射、電穿孔、細(xì)菌與完整細(xì)胞的原生質(zhì)體融合、或聚陽離子，例如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)或polyomithine。關(guān)于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的多種技術(shù)，見Keown等人，Methods in Enzymology 185527-37(1990)和Mansour等人，Nature 336(6197)348-52(1988)。
克隆或表達(dá)此處載體中核酸(例如DNA)的合適的宿主細(xì)胞包括酵母或高等真核細(xì)胞。
真核微生物例如絲狀真菌或酵母是異源融合蛋白質(zhì)載體的合適的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)[Beach和Nurse，Nature 290140-3(1981)；1995年5月2日公布的EP 139,383]；Muyveromyces宿主[美國專利號4,943,529；Fleer等人，Bio/Technology9(10)968-75(1991)]例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574)[de Louvencourt等人，J.Bacteriol.154(2)737-42(1983)]；脆壁克魯維酵母(K.fiagilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克魯維酵母(K wickeramii)(ATCC24,178)、K waltii(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36.906)[Van den Berg等人，Bio/Technology 8(2)135-9(1990)]；K.thermotoierans和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；yarrowia(EP402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)[Sreekrishna等人，J.Basic Microbiol.28(4)265-78(1988)]；假絲酵母屬(Candida)；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)[Case等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 76(10)5259-63(1979)]；許旺酵母屬(Schwanniomyces)，例如許旺酵母(Schwanniomyces occidentulis)(EP394,538，1990年10月31日發(fā)表)；以及絲狀真菌例如脈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、Tolypocladium(WO 91/00357，1991年1月10日發(fā)表)以及曲霉屬(Aspergillus)宿主，例如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)[Balance等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.112(1)284-9(1983)]；Tilburn等人，Gene 26(2-3)205-21(1983)；Yelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(5)1470-4(1984)]和黑曲菌(A.niger)[Kelly和Hynes，EMBO J.4(2)475-9(1985)]。甲基營養(yǎng)酵母選自漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬、球擬酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Rhodotorula)?？梢栽贑.Antony，《The Biochemistry of Methylotrophs》，269(1982)中找到這類酵母示范性的特定種的名單。
表達(dá)本發(fā)明異源融合蛋白質(zhì)的合適的宿主細(xì)胞來自多細(xì)胞生物。無脊椎動物細(xì)胞的實(shí)例包括昆蟲細(xì)胞，例如果蠅S2和灰赤夜蛾(Spodoptera)Sp、灰赤夜蛾high5及植物細(xì)胞。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括NSO骨髓瘤細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、SP2和COS細(xì)胞。更特定的實(shí)例包括以SV40轉(zhuǎn)化的猴腎臟CVI系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎系[293或在懸浮培養(yǎng)中生長的亞克隆293細(xì)胞，Graham等人，J.GenVirol.，36(1)59-74(1977)]；中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR[CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]；小鼠支持細(xì)胞[TM4，Mather，Biol.Reprod.23(1)243-52(1980)]；人類肺細(xì)胞(W138.ATCC CCL 75)；人類肝細(xì)胞(Hep G2、HB 8065)；以及小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCC CCL51)。產(chǎn)生本發(fā)明異源融合蛋白質(zhì)的優(yōu)選細(xì)胞系是可從歐洲動物細(xì)胞保藏中心(European Collection of Cell Cultures)獲得的NS0骨髓瘤細(xì)胞系(ECACC，目錄號#85110503)，其在Galfre，G.和Milstein，C.描述((1981)Methods in Enzymology 73(13)3-46；及《Preparation ofMonoclonal AntibodiesStrategies and Procedures》，Academic Press，N.Y.，N.Y.)中描述。
可以直接或作為具有信號序列或其他附加序列蛋白質(zhì)重組產(chǎn)生本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)，所述其他附加序列在成熟異源融合蛋白質(zhì)N末端產(chǎn)生特異剪切位點(diǎn)。一般，信號序列可以是載體組分，或可以是插入到載體中的編碼異源融合蛋白質(zhì)的DNA的一部分。對于酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母和克魯維氏酵母cc-因子前導(dǎo)序列，后者在美國專利號5,010,182中有描述)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白假絲酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列(EP 362,179)或WO 90/13646中描述的信號。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動物信號序列可以用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，例如相同或相關(guān)物種分泌多肽的信號序列和病毒分泌性前導(dǎo)序列。
表達(dá)和克隆載體都含有使載體能夠在一種或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。表達(dá)和克隆載體一般將含有選擇基因，也稱為選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼(a)賦予抗生素或其他毒素(例如新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)抗性、(b)彌補(bǔ)自養(yǎng)缺陷、或(c)補(bǔ)充不能從復(fù)雜培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物(例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因)的蛋白質(zhì)。
哺乳動物細(xì)胞合適的選擇標(biāo)記的實(shí)例是能夠鑒定有能力吸收異源融合蛋白質(zhì)編碼核酸的細(xì)胞的那些選擇標(biāo)記，例如DHFR或胸苷激酶。當(dāng)使用野生型DHFR時，恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是如描述[Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]所描述的制備并增殖的DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系。在酵母中使用的合適的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因[Stinchcomb等人，Nature 282(5734)39-43(1979)；Kingsman等人，Gene 7(2)141-52(1979)；Tschumper等人，Gene 10(2)157-66(1980)]。Trpl基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L的能力的酵母突變株例如ATCC No.44076或PEPC1提供選擇標(biāo)記[Jones，Genetics 8523-33(1977)]。
表達(dá)和克隆載體通常含有與異源融合蛋白質(zhì)編碼核酸序列有效連接以指導(dǎo)mRNA合成的啟動子。由多種可能的宿主細(xì)胞識別的啟動子廣為人知。與酵母宿主使用的合適的啟動子序列實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255(24)12073-80(1980)]或其他糖酵解酶[Hess等人，J.Adv.Enzyme Reg.7149(1968)；Holland，Biochemistry17(23)4900-7(1978)]，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、已糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。其他酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮素代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)，所述啟動子是可誘導(dǎo)的啟動子，具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外的優(yōu)點(diǎn)。在EP 73,657中進(jìn)一步描述了用于酵母表達(dá)的合適的載體和啟動子。例如，通過啟動子可以控制異源融合蛋白質(zhì)編碼mRNA從哺乳動物宿主細(xì)胞中載體的轉(zhuǎn)錄，所述啟動子可以來自病毒基因組，例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿病毒40(SV 40)；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，以及熱休克啟動子，條件是這些啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
可以通過向載體中插入增強(qiáng)子序列增加高等真核細(xì)胞對編碼異源融合蛋白質(zhì)的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄的DNA順式作用元件，通常約10至300bp。已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、a-酮蛋白(ketoprotein)和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而，人們一般將使用真核細(xì)胞病毒啟動子。實(shí)例包括復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp 100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子、以及腺病毒增強(qiáng)子。可以將增強(qiáng)子在異源融合蛋白質(zhì)編碼序列的5′或3′位剪接在載體中，但是優(yōu)選位于啟動子5′位。
用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或其他多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體也將含有轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA的5′以及偶然從3′非翻譯區(qū)獲得這些序列。這些區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄為編碼異源融合蛋白質(zhì)的mRNA中非翻譯部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
可以從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞裂解物中回收多種形式的異源融合蛋白質(zhì)。如果是膜結(jié)合的，可以使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X 100)或酶切割將其從膜上釋放?？梢酝ㄟ^多種物理或化學(xué)方法(例如循環(huán)凍融、超聲處理、機(jī)械破碎或細(xì)胞裂解試劑)來破碎異源融合蛋白質(zhì)表達(dá)中使用的細(xì)胞。
一旦在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)，就可以分離并純化類似物。下列步驟是適宜的純化步驟的代表羧甲基纖維素分級分離；凝膠過濾例如Sephadex G-75；陰離子交換樹脂例如DEAE或Mono-Q；陽離子交換例如CM或Mono-S；金屬鰲合柱以結(jié)合多肽的表位標(biāo)簽形式；反相HPLC；層析聚焦；硅膠；乙醇沉淀；以及硫酸銨沉淀。
可以使用多種蛋白質(zhì)純化方法，這類方法為本領(lǐng)域所公知并在例如Deutscher，Methods in Enzymology 18283-9(1990)和《Scopes，ProteinPurificationPrinciples and Practice》，Springer-Verlag，NY(1982)中得到描述。所選的純化步驟取決于使用的生產(chǎn)方法以及產(chǎn)生的特定異源融合蛋白質(zhì)的性質(zhì)。例如，使用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親合基質(zhì)可以有效純化包含F(xiàn)c片段的異源融合蛋白質(zhì)?？梢允褂玫突蚋遬H緩沖液從親合基質(zhì)洗脫異源融合蛋白質(zhì)。溫和的洗脫條件將有助于防止異源融合蛋白質(zhì)的不可逆變性。
可以用一種或多種賦形劑配制本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)可以與可藥用的緩沖液、經(jīng)調(diào)節(jié)提供可接受的穩(wěn)定性的pH、以及可施用(例如胃腸外施用)的pH組合。任選地，可以添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。間甲酚和苯酚是優(yōu)選的可藥用抗微生物劑?？梢蕴砑右环N或多種可藥用鹽溶液以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或張力?？梢蕴砑右环N或多種賦形劑以進(jìn)一步調(diào)節(jié)制劑的等滲性。甘油是等滲性調(diào)節(jié)賦形劑的實(shí)例?？伤幱靡馕吨m于施用于人類或其他動物，因此不含有毒性成分或不希望的污染物，并且不干擾其中活性化合物的活性。
可以以溶液制劑或能夠用合適的稀釋劑重構(gòu)的凍干粉配制本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)。凍干劑型是其中異源融合蛋白質(zhì)穩(wěn)定的一種劑型，具有或不具有重構(gòu)產(chǎn)品在預(yù)期的使用貨架期內(nèi)保持pH的緩沖能力。包含在此討論的異源融合蛋白質(zhì)的溶液在凍干前優(yōu)選是等滲的，使之重構(gòu)后能夠形成等滲溶液。
本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)的可藥用鹽溶液形式在本發(fā)明范圍內(nèi)。常用于形成酸加成鹽的酸為無機(jī)酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等，以及有機(jī)酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。優(yōu)選的酸加成鹽是與無機(jī)酸，例如鹽酸和氫溴酸形成的鹽。
堿加成鹽包括從無機(jī)堿，例如銨、堿或堿土金屬氫氧化物衍生的那些鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽等。在制備本發(fā)明的鹽溶液中有用的這類堿因此包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、碳酸鉀等。
本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)具有生物活性。生物活性指異源融合蛋白質(zhì)在體內(nèi)結(jié)合和激活受體并引起反應(yīng)的能力。檢測了代表性數(shù)量的異源融合蛋白質(zhì)的體外以及體內(nèi)活性。實(shí)施例1和2提供了基于異源融合蛋白質(zhì)與人GLP-1受體相互作用并激活GLP-1受體的能力的體外活性陳述。兩組實(shí)驗(yàn)中都使用了過量表達(dá)人GLP-1受體的HEK293細(xì)胞。這些細(xì)胞中GLP-1受體的激活引起腺苷酸環(huán)化酶的活化，其又誘導(dǎo)環(huán)AMP應(yīng)答元件(CRE)驅(qū)動的報告基因的表達(dá)。實(shí)施例1(表1)提供了典型數(shù)據(jù)，其中報告基因?yàn)棣?內(nèi)酰胺酶，實(shí)施例2(表2)提供了典型數(shù)據(jù)，其中報告基因?yàn)槲灩馑孛?。?shí)施例3提供了對大鼠施用本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)之后產(chǎn)生的典型數(shù)據(jù)。實(shí)施例4(表6)提供了對猴子施用本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)之后產(chǎn)生的典型數(shù)據(jù)。實(shí)施例5(表7)提供了反復(fù)皮下注射異源融合蛋白質(zhì)之后評價可能的抗體形成的典型數(shù)據(jù)。實(shí)施例6(表8)提供了對猴子注射本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)之后藥物動力學(xué)研究的典型數(shù)據(jù)。實(shí)施例7(表9)提供了對大鼠注射三種不同劑量之后藥物動力學(xué)研究的典型數(shù)據(jù)。實(shí)施例8(表10)提供了對小鼠施用本發(fā)明的不同異源融合蛋白質(zhì)之后產(chǎn)生的典型數(shù)據(jù)。典型數(shù)據(jù)一起表明異源融合蛋白質(zhì)能結(jié)合并激活其受體，比活性治療肽表現(xiàn)更為有效，在體內(nèi)有活性并比活性治療肽具有更長的半壽期，非免疫原性并且為劑量應(yīng)答的。
可通過普通醫(yī)生已知有效的任何途徑施用異源融合蛋白質(zhì)。外周腸胃外為一種這樣的方法。在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中腸胃外施用通常理解為通過無菌注射器或一些其他機(jī)械裝置如輸注泵注射劑型到體內(nèi)。外周腸胃外途徑可包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用途徑。
本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)也可以進(jìn)行經(jīng)口、直腸、經(jīng)鼻或下呼吸道途徑施用，它們是非腸胃外途徑。這些非腸胃外途徑中，優(yōu)選下呼吸道途徑和經(jīng)口途徑。
本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)可以用于治療多種疾病和病癥。
此處描述的異源融合蛋白質(zhì)的有效量是施用于需要活性治療肽受體刺激的受試者時引起所希望的治療和/或預(yù)防效果而不導(dǎo)致不可接受的副作用的量?！八Ｍ闹委熜孕Ч卑ㄏ铝幸豁?xiàng)或多項(xiàng)1)疾病或病癥相關(guān)癥狀的改善；2)疾病或病癥相關(guān)癥狀發(fā)作的延遲；3)與沒有治療相比增長的壽命；以及4)與沒有治療相比更好的生活質(zhì)量。
優(yōu)選每兩周一次或每周一次施用本發(fā)明的異源融合蛋白質(zhì)。取決于所治療的疾病，可能有必要更頻繁地施用該異源融合蛋白質(zhì)，例如每周兩至三次。
現(xiàn)在僅以非限制性實(shí)例參考下列實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述。
實(shí)施例實(shí)施例1-體外GLP-1受體激活試驗(yàn)使用CRE-BLAM系統(tǒng)將表達(dá)人類GLP-1受體的HEK-293細(xì)胞以20,000至40,000細(xì)胞/孔/100μl含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基接種到多聚-d-賴氨酸包被的96孔黑色透明底板中。接種后一天，彈去(flick off)培養(yǎng)基，添加80μl無血清DMEM培養(yǎng)基。接種后第三天，將含0.5％BSA、含有不同濃度的多種GLP-1-Fc異源融合蛋白質(zhì)的無血清DMEM培養(yǎng)基20μl加入各孔，以產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線。通常，使用含有3納摩爾至30納摩爾異源GLP-1Fc融合蛋白質(zhì)的14種稀釋液來產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線，從該曲線可以確定EC50值。以融合蛋白質(zhì)孵育5小時后，加入20μl β-內(nèi)酰胺酶底物(CCF2/AM，PanVera LLC)，并持續(xù)培養(yǎng)1小時，此時在細(xì)胞熒光計上測定熒光。在Zlokarnik等人，(1998)，Science，27884-88中進(jìn)一步描述了該測定。測試多種GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)，EC50值在表1中給出。這些值是相對于Val8-GLP-1(7-37)OH的測定值，Val8-GLP-1(7-37)OH作為各實(shí)驗(yàn)內(nèi)部對照。
表1
化合物活性標(biāo)準(zhǔn)差Val8-GLP-1 100％Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A)301％99Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A) 314％45Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A)468％120Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A) 441％35實(shí)施例2-體外GLP-1受體激活試驗(yàn)使用CRE-熒光素酶系統(tǒng)將穩(wěn)定表達(dá)人類GLP-1受體的HEK-293細(xì)胞以30,000個細(xì)胞/孔/80μl低血清DMEM F12培養(yǎng)基接種于96孔板中。接種后一天，將溶于0.5％BSA的待測蛋白質(zhì)的20μl等分試樣與細(xì)胞混合并孵育5小時。對于每種待測蛋白質(zhì)，一般以5×濃度制備含有3pM至3nM的12個稀釋物后加入細(xì)胞，從而產(chǎn)生劑量反應(yīng)曲線，從中確定EC50值。孵育后，將100μl熒光素酶直接加入各板，輕輕混合2分鐘。將板置入Tri-lux發(fā)光計并計算熒光素酶表達(dá)引起的光輸出。測試多種GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)，EC50值呈于表2中。這些值是相對于Val8-GLP-1(7-37)OH的測定值，Val8-GLP-1(7-37)OH作為各實(shí)驗(yàn)內(nèi)部對照。由于下面測試的異源融合蛋白質(zhì)為二聚體，考慮摩爾濃度2倍差異校正所述值。
表2化合物活性標(biāo)準(zhǔn)差Val8-GLP-1100％Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A) 535％240Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A) 595％43Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A) 1119％128Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A)398％62Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-1L-IgG4(S228P，F(xiàn)234A，L235A)417％40
實(shí)施例3 大鼠中靜脈內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)在大鼠靜脈內(nèi)葡萄糖耐重測定中評價異源融合蛋白質(zhì)Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)。三組中每組包含至少四只大鼠。I組接受載體(表3)，II組接受1.79mg/kg的Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)作為單次皮下注射(表4)，III組接受0.179mg/kg的Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)作為單次皮下注射(表5)。在第一天早晨皮下注射大鼠。首次注射二十四小時之后，每克大鼠體重1μL葡萄糖(D50)以快速濃注灌注。在葡萄糖快速濃注灌注后的2、4、6、10、20和30分鐘采集血液樣品。
表3
表4
得到的PK參數(shù)值的代表總結(jié)于表6中。來自RIA的單劑SC PK與446.7ng/mL的平均Cmax及相應(yīng)17.3小時的Tmax關(guān)聯(lián)。平均清除半壽期約79.3小時(3.3天)。來自ELISA的PK與292.2ng/mL的平均Cmax及相應(yīng)16.7小時的Tmax關(guān)聯(lián)。評價清除半壽期約51.6小時(2.2天)。
表6
a觀察到的最大血漿濃度。
b觀察到的最大血漿濃度的時間。
c血漿濃度-時間曲線下測量的0至無窮大的面積。
d清除半壽期。
e總機(jī)體清除率關(guān)于生物利用率的函數(shù)。
f分布體積關(guān)于生物利用率的函數(shù)。
SD＝標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)施例5 重復(fù)皮下注射后抗體潛在形成的評價使用直接ELISA形式對指定獼猴血清樣品測試抗Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)抗體的形成。以0.1μg/mL濃度的Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4(S228P、F234A、L235A)包被微量滴定板。將猴血清樣品50、500、1000和5000倍稀釋到封閉溶液中，孵育0.05mL樣品/孔約一小時。將二級抗體山羊<人Fab′2>-過氧化物酶(與人類75％的交叉反應(yīng)性)10,000倍稀釋于封閉溶液中，以0.05mL/孔加入并孵育約一小時。在450nm-630nm光密度讀取使用四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物的顯色。將一式兩份讀數(shù)平均。使用GLP-1抗體作為陽性對照，山羊<兔>(H+L)-過氧化物酶綴合物是用于檢測的二級抗體。在給藥前、第二次給藥24小時后、第一次和第二次皮下給藥168小時后收集時點(diǎn)血清樣品(Point serum samples)以評價可能的免疫原性。通過與給藥前血清樣品和陽性對照的比較解釋對G8E22-CEX-L-hIgG4的抗體效價的存在。代表性結(jié)果呈于表7。
表7
實(shí)施例6 禁食狀態(tài)和分級靜脈內(nèi)葡萄糖注射期間單次皮下注射獼猴后的藥物動力學(xué)研究1期(研究第一天)施用載體的皮下灌注。灌注載體后立即施用5、10、和25mg/kg/min的分級靜脈內(nèi)葡萄糖(20％右旋糖)灌注。2期(研究第三天)施用GLP-1融合蛋白質(zhì)(0.1mg/kg)的皮下灌注。3期在GLP-1融合蛋白質(zhì)灌注后約96小時進(jìn)行分級靜脈內(nèi)葡萄糖灌注。
在16小時過夜禁食后經(jīng)過鎮(zhèn)靜的猴中進(jìn)行分級靜脈內(nèi)葡萄糖灌注步驟。對于兩次靜脈內(nèi)葡萄糖灌注，將每10分鐘共20分鐘取基線樣品以定義基線。在+20分鐘以5mg/kg/min的速率啟動升高的葡萄糖灌注，隨后為10mg/kg/min和25mg/kg/min的灌注。各灌注速率監(jiān)測20分鐘時程。以10分鐘間隔采集血液樣品以測量葡萄糖、胰島素和胰高血糖素。在葡萄糖灌注前-20、-10分鐘、0分鐘以及1和3期葡萄糖灌注后10、20、30、40、50和60分鐘收集約1.0mL血液。
數(shù)據(jù)顯示于表8。
表8
以載體和GLP-1融合蛋白質(zhì)給藥的猴子之間胰高血糖素水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
實(shí)施例7 禁食狀態(tài)和分級靜脈內(nèi)葡萄糖灌注期間三個不同劑量單次皮下注射大鼠后的藥物動力學(xué)研究將長期置入導(dǎo)管的大鼠分配到載體對照(鹽溶液)和三個治療組之一(GLP-1融合蛋白質(zhì)；0.0179mg/kg、0.179mg/kg、或1.79mg/kg)。通過皮下注射施用GLP-1融合蛋白質(zhì)和載體。治療二十四小時后，使過夜禁食(16h)的大鼠受到分級靜脈內(nèi)葡萄糖灌注測試。分級葡萄糖灌注測試由基線鹽溶液灌注射期(20分鐘)、隨后的分別為5和15mg/kg/min的兩個30分鐘葡萄糖灌注期組成。在葡萄糖灌注前-20、-10分鐘、0分鐘(基線)以及10、20、30、40、50和60分鐘收集血漿樣品。
數(shù)據(jù)表示于表9中。
表9
*與載體相對P≤0.05實(shí)施例8 FGF-21融合蛋白質(zhì)的藥物代謝動力學(xué)分析通過靜脈內(nèi)(IV)和皮下(SC)途徑以0.4mg/kg的劑量給CD-1小鼠施用FGF-21融合蛋白質(zhì)。動物在給藥后0-336小時之間的多個時間取血。從每一個樣品中收集血漿并通過放射免疫測定法分析。使用模型依賴性(IV數(shù)據(jù))和非依賴性(SC數(shù)據(jù))方法(winNonlin Pro)計算藥物動力學(xué)參數(shù)并在下面表10中報告。通過IV施用，F(xiàn)GF-21-Fc融合蛋白質(zhì)與天然FGF-21的0.5小時的清除半壽期比較具有大約53.9小時的清除半壽期。通過SC施用，F(xiàn)GF-21-Fc融合蛋白質(zhì)與天然FGF-21的0.6小時的清除半壽期比較具有大約24小時的清除半壽期。通過兩種施用途徑FGF-21-Fc融合蛋白質(zhì)與天然FGF-21比較表現(xiàn)延長的作用時間。
表10
a觀測到的最大血漿濃度b觀測到最大血漿濃度的時間c從0到無窮大測量的血漿濃度-時間曲線下的面積d以時間為單位的清除半壽期e全身清除率作為生物利用率的函數(shù)f生物利用率百分比序列表<110>伊萊利利公司<120>融合蛋白<130>X-16821<150>60/477880<151>2003-06-12<150>60/570908<151>2004-05-13<160>8<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>230<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>1位的Xaa為Ala或不存在<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(16)..(16)<223>16位的Xaa為Pro或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(17)..(17)<223>17位的Xaa為Phe，Val，或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(18)..(18)<223>18位的Xaa為Leu，Glu，或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(80)..(80)<223>80位的Xaa為Asn或Ala<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(230)..(230)<223>230位的Xaa為Lys或不存在<400>1
Xaa Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp20 25 30Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp35 40 45Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly50 55 60Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa65 70 75 80Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp85 90 95Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro100 105 110Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu115 120 125Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn130 135 140Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile145 150 155 160Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr165 170 175Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg180 185 190Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Ash Val Phe Ser Cys195 200 205Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu210 215 220Ser Leu Ser Leu Gly Xaa
225 230<210>2<211>15<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>2Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>3<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3ProPro Cys Pro Ser Cys1 5<210>4<211>22<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>4Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly1 5 10 15Ser Gly Gly Gly Gly Ser20<210>5<211>825<212>DNA<213>人<400>5cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 60gaattcatcg cctggctggt gaagggcggc ggcggtggtg gtggctccgg aggcggcggc120tctggtggcg gtggcagcgc tgagtccaaa tatggtcccc catgcccacc ctgcccagca180
cctgaggccg ccgggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc240atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc300gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg360cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag420gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc480atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg540cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc600ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gaaagcaatg ggcagccgga gaacaactac660aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc720gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct780ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggt825<210>6<211>30<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>6Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser20 25 30<210>7<211>25<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>7Asp Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Asp Ala Ala Ala Arg Glu1 5 10 15Ala Ala Ala Arg Asp Ala Ala Ala Lys20 25
<210>8<211>14<212>PRT<213>人工的<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>8Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.異源融合蛋白質(zhì)，其包含與免疫球蛋白的Fc部分融合的活性治療肽，所述免疫球蛋白的Fc部分包含SEQ ID NO1Xaa1-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa80-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-S er-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-S er-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa230(SEQ ID NO1)的序列，其中1位的Xaa為Ala或不存在；16位的Xaa為Pro或Glu；17位的Xaa為Phe、Val、或Ala；18位的Xaa為Leu、Glu、或Ala；80位的Xaa為Asn或Ala；以及230位的Xaa為Lys或不存在。
2.權(quán)利要求1的異源融合蛋白質(zhì)，其中活性治療肽的C端氨基酸與Fc部分的N末端丙氨酸殘基通過肽接頭融合，其中所述的肽接頭包含選自下面的序列a)Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)；b)Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO4)；c)Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO6)；d)Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys(SEQ ID NO7)；和e)Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO8)。
3.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1或2的異源融合蛋白質(zhì)。
4.載體，其包含權(quán)利要求3的多核苷酸。
5.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4的載體。
6.宿主細(xì)胞，其表達(dá)權(quán)利要求1或2的異源融合蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
8.權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞為NS0細(xì)胞。
9.產(chǎn)生異源融合蛋白質(zhì)的方法，其包括在異源融合蛋白質(zhì)以可檢測的量表達(dá)的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求3的多核苷酸的步驟。
10.治療患者的方法，其包括施用權(quán)利要求1或2的異源融合蛋白質(zhì)的治療有效量。
11.權(quán)利要求10的方法，其中異源融合蛋白質(zhì)每周施用一次。
12.權(quán)利要求1或2的異源融合蛋白質(zhì)的用途，用作藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了與特定IgG4－Fc衍生物融合的活性治療肽。這些融合蛋白質(zhì)具有增加的半壽期、降低的半抗體形成和降低的效應(yīng)子活性，而無免疫原性。所述融合蛋白質(zhì)可用于治療人類疾病以及多種其他病癥或疾病。
文檔編號C12N15/62GK1802167SQ200480015957
公開日2006年7月12日 申請日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者W·格萊斯納, R·L·小米利肯, Y·甸, S－H·R·奇昂, A·M·維克 申請人:伊萊利利公司