專利名稱：一種真核細(xì)胞中重組糖蛋白高水平表達(dá)的載體系統(tǒng)pSA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種真核細(xì)胞中重組糖蛋白高 水平表達(dá)的載體系統(tǒng)PSA。本發(fā)明還提供了特別適合在動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)人活化蛋白C 的表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
目前已發(fā)展了多種蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)生物體的外源蛋白，比如大腸埃希氏菌 表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，高等真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，但這些系統(tǒng)仍存在某些有待改進(jìn)的缺 陷。如何應(yīng)用這些新的表達(dá)系統(tǒng)來高效表達(dá)所需目的基因，也是本領(lǐng)域中急需摸索和研究 的問題。例如大腸桿菌作為宿主可表達(dá)多種蛋白，但是其存在(1)缺少真核生物的蛋白翻 譯后的修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等；(2)表達(dá)的蛋白多形成不溶性包涵體， 需要經(jīng)過復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性；(3)菌體蛋白較不利于純化等缺點(diǎn)。而釀酒酵母系統(tǒng)也具有局限性(1)產(chǎn)量通常較低；(2)表達(dá)質(zhì)粒易于丟失；(3) 缺乏強(qiáng)有力的受嚴(yán)格調(diào)控的啟動(dòng)子；(4)外源蛋白過度糖基化修飾會(huì)嚴(yán)重的改變蛋白質(zhì)的 免疫原性、降低活性、縮短滯留時(shí)間；(5)分泌效率差，純化困難。綜上所述，目前人類的糖基化蛋白質(zhì)在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)存在表達(dá)量較低、生產(chǎn)成 本高，或在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)活性較低的技術(shù)難點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種在動(dòng)物細(xì)胞 中高效表達(dá)人類糖基化蛋白(尤其是人活化蛋白C)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種在動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)人類糖基化蛋白(尤其是人 活化蛋白C)的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種可用于在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載 體，其特征在于，所述的載體含有表達(dá)外源蛋白的表達(dá)盒，所述的表達(dá)盒從5’至3’依次具 有以下元件(a)第一啟動(dòng)子，所述的第一啟動(dòng)子選自CMV啟動(dòng)子；(b)多克隆位點(diǎn)以及任選的位于多克隆位點(diǎn)之中、之前或之后的外源蛋白的編碼 序列；(C)第一 POlyA序列，所述的第一 POlyA序列選自牛生長因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)；(d)第二啟動(dòng)子，所述的第二啟動(dòng)子選自SV40早期啟動(dòng)子；(e)選擇標(biāo)記基因，所述的選擇標(biāo)記基因選自Neo(R)基因；和(f)第二 polyA信號序列，所述的第二 polyA信號序列選自SV40 polyA信號序 列。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體還含有增強(qiáng)子。
在另一優(yōu)選例中，所示的表達(dá)載體在元件(a)和(b)之間還具有用于mRNA測序的 T7啟動(dòng)子序列。在另一優(yōu)選例中，所述的增強(qiáng)子位于外源蛋白的編碼序列的上游。在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白的編碼序列和所述選擇標(biāo)記基因含有起始密碼 子ATG和終止密碼子。在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白選自下組促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因 子、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經(jīng)期促性腺激素、胰島素樣生長因子(如生 長調(diào)節(jié)素-C)、角化細(xì)胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、血栓調(diào)節(jié)蛋白、堿 性纖維母細(xì)胞生長因子、胰島素、因子VII、因子VIII、生長激素、骨形態(tài)形成蛋白-2、血小 板產(chǎn)生的生長因子、水蛭素、及它們突變蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白是人活化蛋白C。在另一優(yōu)選例中，所述的人活化蛋白C來源于人。在另一優(yōu)選例中，所述的人活化蛋白C具有天然序列、變異序列或重組序列。更佳 地，所述的人活化蛋白C具有SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的抗性基因選自腺苷脫氨酶(ADA)、新霉素(neo)、二氫葉 酸還原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、胸苷激酶(tk)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn) 移酶(gpt)、多重耐藥基因(MDR)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性 (CAD)、或嘌呤霉素-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC)在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記基因是新霉素抗性基因(Neo)。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)記基因具有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的載體還含有用于在大腸桿菌中擴(kuò)增載體的復(fù)制起點(diǎn) (puc)、以及用于在大腸桿菌中進(jìn)行篩選的另一篩選基因。其中，所述的篩選基因、所述的標(biāo) 記基因和所述的編碼外源蛋白的基因各不相同。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是包含序列如SEQ ID NO :1所示外源蛋白編碼 序列和序列如SEQ ID NO :2所示的標(biāo)記基因的表達(dá)載體(pSA/APC)。在本發(fā)明的第二方面，提供了由本發(fā)明第一方面中任一所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)和人胚胎腎細(xì)胞 (HEK)。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞中具有3-20個(gè)所述的表達(dá)載體、3-20個(gè)所述的 表達(dá)盒、或、3-20個(gè)拷貝的所述外源基因的編碼序列。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的速度> 1.5pg/細(xì)胞/天，較佳 地> 2. Opg/細(xì)胞/天，更佳地> 3. Opg/細(xì)胞/天，更佳地> 4. Opg/細(xì)胞/天，> 5. Opg/ 細(xì)胞/天。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備外源蛋白的方法，其特征在于，所述的方法 包括(a)培養(yǎng)本發(fā)明第二方面中所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述的外源蛋白；(b)分離出表達(dá)的所述的外源蛋白。
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應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具 體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。例如，就某一大范圍 (如10-100)的上限可以與另一優(yōu)選的較小范圍(如20-80)的下限20進(jìn)行組合，從而構(gòu)成 另一范圍(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。


圖1 :pSA載體和pSA/APC載體構(gòu)建過程示意圖。其中，各元件如下 圖 2 :pSA/APC 酶切圖譜。圖3 :pSA/APC轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞所得高表達(dá)細(xì)胞株的免疫活性結(jié)果，后者采用的抗體 是鼠源抗人APC的單克隆抗體。
具體實(shí)施例方式在重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域，要獲得高表達(dá)量的表達(dá)載體更是取決于眾多因素。例如所 采用的表達(dá)方式有關(guān)、所采用的表達(dá)盒中的各元件、各元件的組合位置、基因拷貝數(shù)等。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次開發(fā)了將待表達(dá)的外源基因與一抗性的標(biāo) 記基因偶聯(lián)(或配對連接)，從而構(gòu)成一“偶聯(lián)的”、整體性的雙基因表達(dá)盒。在該表達(dá)盒中， 外源基因的翻譯和標(biāo)記基因(如Neo)的翻譯是相對獨(dú)立，但又有聯(lián)系。在宿主細(xì)胞的培養(yǎng) (或篩選)條件下，標(biāo)記基因的表達(dá)是為了保證外源基因的表達(dá)，從而使外源基因隨選擇標(biāo) 記基因拷貝數(shù)在基因擴(kuò)增過程中的增加而增加，從而獲得高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株。在此 基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。外源蛋白如本文所用，術(shù)語“外源蛋白的編碼序列”、“異源編碼序列”、“異源基因序列”、“異 源基因”、“重組基因”、“感興趣的基因”、“目的基因”和“轉(zhuǎn)基因”可互換使用。這些術(shù)語用 于DNA序列時(shí)指編碼重組或異源基因產(chǎn)物的DNA序列。所述異源基因序列在宿主細(xì)胞中天然不存在而且來自不同種的生物?？墒贡景l(fā)明的重組或異源基因產(chǎn)物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá)和大量收集。所述基因產(chǎn)物可以是肽或多肽，可以是任何感興趣的蛋白質(zhì)，如治療蛋白質(zhì) (如白介素)或酶或多聚蛋白質(zhì)的亞單元(如抗體或其片段)。所述重組產(chǎn)物的基因可包 含信號序列，其編碼的信號肽可使宿主生產(chǎn)細(xì)胞表達(dá)的多肽分泌出來的。在本發(fā)明的進(jìn)一 步優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)物蛋白是為分泌蛋白質(zhì)。代表性的外源蛋白包括(但并不限于)促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、 粒_巨噬細(xì)胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經(jīng)期促性腺激素、胰島素樣生長因子(如生長 調(diào)節(jié)素-C)、角化細(xì)胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子、血栓調(diào)節(jié)蛋白、堿性 纖維母細(xì)胞生長因子、胰島素、因子VII、因子VIII、生長激素、骨形態(tài)形成蛋白-2、血小板 產(chǎn)生的生長因子、水蛭素、及它們突變蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白?！N特別優(yōu)選外源蛋白是人活化蛋白C。如本文所用，術(shù)語“人活化蛋白C基因”、“APC基因”可互換使用，均指包含本發(fā)明 SEQ ID NO :1所示的序列，且可表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明的人活化蛋白C的核苷酸序列。該術(shù)語還 包括人活化蛋白C基因的天然序列、變異序列或重組序列在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可通過常規(guī)分子生物學(xué)方法獲得所述的外源基因 (例如人活化蛋白C基因)，所述方法可按照常規(guī)條件如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室 指南》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。其他元件在本發(fā)明中，可使用的標(biāo)記基因沒有特別限制，代表性的標(biāo)記基因選自下組二氫 葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素 抗性基因。在本發(fā)明中，可使用的啟動(dòng)子(包括第一啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子)沒有特別限制，代 表性的啟動(dòng)子選自(但并不限于)大腸桿菌的Iac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真 核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄 病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。 特別優(yōu)選的第一啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，可以選用各種常規(guī)的多克隆位點(diǎn)(MCS)，以便插入外源蛋白的編碼序 列。當(dāng)然，插入的外源蛋白的編碼序列可以位于在多克隆位點(diǎn)之中、之前或之后。在本發(fā)明中，可使用的polyA序列(包括第一 polyA序列和第二 polyA序列)沒 有特別限制，代表性的PolyA序列選自(但并不限于)牛生長因子polyA (bovine growth factor hormone polyA), SV40 早期啟動(dòng)子。優(yōu)選的第一 polyA序列是牛生長因子polyA。另外，第二啟動(dòng)子宜與第二 polyA序列來源于同一物種，或來源于同一基因，例如 當(dāng)?shù)诙?dòng)子是SV40早期啟動(dòng)子，則第二 polyA序列為SV40 polyA信號序列；如本文所用，術(shù)語“間隔序列，，指位于各元件之間的起到間隔作用的序列。在本發(fā) 明中，優(yōu)選地，間隔序列位于元件外源蛋白的編碼序列和SV40啟動(dòng)子之間。間隔序列可以 源自天然序列或人工合成的序列。源自天然序列的間隔序列的例子是基因的非翻譯區(qū)，代 表性的例子包括Histone H3. 3 putativetranscription pause site的非翻譯區(qū)，禾口腦心 肌炎病毒(Enc^phaloMycardiatis Virus, EMCV)的 5，非翻譯區(qū)等。
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本發(fā)明的外源基因以及其他元件(如啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、POlyA序列、間隔序列) 的核苷酸全長序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。以外源基因?yàn)?例，對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè) 計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模 板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列片段。然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、或其他 載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。通常，將獲得的用于構(gòu)成本發(fā)明表達(dá)盒的各元件，按正確的順序連接在一起，就可 形成本發(fā)明的表達(dá)盒。然后，將本發(fā)明的表達(dá)盒插入常規(guī)的或市售的表達(dá)載體，即可形成本 發(fā)明的表達(dá)載體。本發(fā)明的適合在動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)人類糖基化蛋白(尤其是人活化蛋白C)的 載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代 表性例子有大腸桿菌，CHO、C0S、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。優(yōu)選的宿 主細(xì)胞是肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、CH0。更佳地，宿主細(xì)胞是腎細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)) 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的合適培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域熟知的，例如可見 US5, 633, 162中的描述。用于實(shí)驗(yàn)室燒瓶培養(yǎng)或低密度細(xì)胞培養(yǎng)可滿足特定類型細(xì)胞需 要的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)液的例子包括但不限于Roswell Park MemorialInstitute (RPMI) 1640 培養(yǎng)液(Morre, G, The journal of the American MedicalAssociation, 199 :519,1967)、 L-15 培養(yǎng)液(Leibovitz，A 等，Amer. J. ofHygiene,78 :173，1963) ,Dulbecco 改良 Eagle 培 養(yǎng)液、Eagle 最簡單基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Eagle，s minimal essential medium, MEM)、Ham F12 培 養(yǎng)液(Ham, R等，Proc. Natl. Acad. Sc. 53 =288,1965)或缺少白蛋白、運(yùn)鐵蛋白和卵磷脂的 Iscoves 改良 DMEM (Iscoves 等，J.Exp, med. 1 :923，1978)。例如，Ham FlO 或 F12 培養(yǎng)液是 專門為CHO細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的。特別適合于CHO細(xì)胞培養(yǎng)的其它培養(yǎng)液見EP-481791中所述。 已知此類培養(yǎng)液中可增添胎牛血清(FBS，也稱為胎小牛血清FCS)，后者提供了天然來源的 豐富激素和生長因子。目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)是常規(guī)操作，在科學(xué)教科書和手冊中有全 面的描述，細(xì)節(jié)可參見R. IanFresney，《動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)》(Culture of Animal cells)，手 冊,第 4 版，Wiley-Liss/N. Y.，2000。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
I=I O在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了 一種pSA/人活化蛋白C表達(dá)載體。在該載體中， 外源基因和作為選擇的標(biāo)記基因(新霉素抗性基因，Neo(R))這兩個(gè)基因由Histone H3. 3 putative transcription pause site的非翻譯區(qū)相互連接。在該非翻譯區(qū)之后還含有另 外一個(gè)SV40啟動(dòng)子，保證目的基因的翻譯和Neo(R)的翻譯是獨(dú)立進(jìn)行的。Neo(R)基因的 表達(dá)是為了保證目的基因的表達(dá)。表達(dá)載體PSA/人活化蛋白C表達(dá)動(dòng)物細(xì)胞分泌型的人 活化蛋白C，所分泌表達(dá)重組的人活化蛋白C具有同天然的人活化蛋白C相同的氨基酸序 列，并具有足夠臨床使用的效價(jià)，因此適用于商業(yè)化。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(i)使外源基因隨選擇標(biāo)記基因拷貝數(shù)在基因擴(kuò)增過程中的增加而增加，從而獲 得高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株。(ii)可以快速地獲得高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株。(iii)所獲得的表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株的表達(dá)速度高。通常，所述的細(xì)胞株表達(dá)外 源蛋白的速度彡2. Opg/細(xì)胞/天，甚至彡5. Opg/細(xì)胞/天。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如 Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York =ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1pSA載體和pSA/人活化蛋白C載體構(gòu)建參見圖1，先用常規(guī)PCR方法獲得人活化蛋白C基因以及下表中所示的各元件
Neo(R)基因用于細(xì)胞株篩選的選擇標(biāo)記基因SV40 polyA 位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄后RNA加工信號將pCMV(CMV啟動(dòng)子)、pT7(T7啟動(dòng)子)、MCS (多克隆酶切位點(diǎn))、BGHPolyA(牛生 長因子PolyA位點(diǎn))、SV40早期啟動(dòng)子、Neo (R)基因、和SV40 polyA位點(diǎn)用連接酶依次連 接，形成表達(dá)盒。然后，將表達(dá)盒插入含pUC復(fù)制起點(diǎn)和Amp (R)抗性基因的質(zhì)粒，形成表達(dá)載體 pSA。將人活化蛋白C基因插入用表達(dá)載體pSA的多克隆位點(diǎn)，形成質(zhì)粒pSA/人活化蛋 白C。pSA/人活化蛋白C的酶切圖譜結(jié)果如圖2所示，顯示質(zhì)粒構(gòu)建正確。 接著，將表達(dá)載體pSA/人活化蛋白C用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化自幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)，用在 含新霉素的條件下篩選，獲得多株高表達(dá)人活化蛋白C的細(xì)胞株。對于所得高表達(dá)人活化蛋白C白C的細(xì)胞株，用常規(guī)方法(ELISA)進(jìn)行免疫活性 檢測，其中采用的抗體是鼠源抗人APC的單克隆抗體。結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)化的APC細(xì)胞株培養(yǎng)24小時(shí)后取上清500倍稀釋ELISA測量， 并計(jì)數(shù)其細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算表達(dá)量為3. 2pg/細(xì)胞/天。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>蘇州澤璟生物制藥有限公司<120> 一種真核細(xì)胞中重組糖蛋白高水平表達(dá)的載體系統(tǒng)pSA<130)093123<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>1386<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1atgtggcagctcacaagcctcctgctgttcgtggccacctggggaatttccggcacacca60
gctcctcttgactcagtgttctccagcagcgagcgtgcccaccaggtgctgcggatccgc120
aaacgtgccaactccttcctggaggagctccgtcacagcagcctggagcgggagtgcata180
gaggagatctgtgacttcgaggaggccaaggaaattttccaaaatgtggatgacacactg240
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gactgccgcagcggctgggagggccgcttctgccagcgcgaggtgagcttcctcaattgc420
9
tcgctggacaacggcggctgcacgcattactgcctagaggaggtgggctggcggcgctgt480
agctgtgcgcctggctacaagctgggggacgacctcctgcagtgtcaccccgcagtgaag540
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gacatcaaggaggtcttcgtccaccccaactacagcaagagcaccaccgacaatgacatc900
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agctggggtgagggctgtgggctccttcacaactacggcgtttacaccaaagtcagccgc1320
tacctcgactggatccatgggcacatcagagacaaggaagccccccagaagagctgggca1380
ccttag1386
<210>2
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>新霉素抗性基因
<400>2
atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60
ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgCCgCCgtgttccggctgtca120
gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180
caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240
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ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780
gacgagttcttctga79權(quán)利要求
一種可用于在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述的載體含有表達(dá)外源蛋白的表達(dá)盒，所述的表達(dá)盒從5’至3’依次具有以下元件(a)第一啟動(dòng)子，所述的第一啟動(dòng)子選自CMV啟動(dòng)子；(b)多克隆位點(diǎn)以及任選的位于多克隆位點(diǎn)之中、之前或之后的外源蛋白的編碼序列；(c)第一polyA序列，所述的第一polyA序列選自牛生長因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)；(d)第二啟動(dòng)子，所述的第二啟動(dòng)子選自SV40早期啟動(dòng)子；(e)選擇標(biāo)記基因，所述的選擇標(biāo)記基因選自Neo(R)基因；和(f)第二polyA信號序列，所述的第二polyA信號序列選自SV40 polyA信號序列。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述的外源蛋白是人活化蛋白C。
3.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述的人活化蛋白C來源于人。
4.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述的人活化蛋白C具有天然序列、變異序列或重組 序列；更佳地，所述的人活化蛋白C具有SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述的標(biāo)記基因是新霉素抗性基因(Neo)。
6.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，所述的標(biāo)記基因具有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
7.一種由權(quán)利要求1-6中任一所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞選自幼倉鼠腎細(xì)胞 (BHK)和人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞中具有3-20個(gè)所述的 表達(dá)載體、3-20個(gè)所述的表達(dá)盒、或、3-20個(gè)拷貝的所述外源基因的編碼序列；和/或所述的宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的速度> 1. 5pg/細(xì)胞/天，較佳地> 2. Opg/細(xì)胞/天， 更佳地> 3. Opg/細(xì)胞/天，更佳地> 4. Opg/細(xì)胞/天，> 5. Opg/細(xì)胞/天。
10.一種制備外源蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述的外源蛋白；(b)分離出表達(dá)的所述的外源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種真核細(xì)胞中重組糖蛋白高水平表達(dá)的載體系統(tǒng)pSA，具體地，本發(fā)明提供了可用于在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白的表達(dá)載體，它含有表達(dá)外源蛋白的表達(dá)盒，所述的表達(dá)盒從5’至3’依次具有以下元件(a)第一啟動(dòng)子；(b)多克隆位點(diǎn)以及任選的外源蛋白的編碼序列；(c)第一polyA序列；(d)第二啟動(dòng)子；(e)選擇標(biāo)記基因；和(f)第二polyA信號序列。本發(fā)明的表達(dá)載體特別適合在動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)人活化蛋白C。
文檔編號C12N15/85GK101906435SQ20091005257
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者盛澤林 申請人:蘇州澤璟生物制藥有限公司