本發(fā)明屬于葡萄早熟有利基因挖掘和功能鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及葡萄早熟基因vvwrky13在調(diào)控植物中乙烯生物合成中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：葡萄作為一種世界廣適性水果，以其獨特的釀酒特性風靡全球。隨著經(jīng)濟增長，中國葡萄酒消費呈上升趨勢，葡萄種植面積隨之增加。據(jù)“國際葡萄與葡萄酒組織”(internationalorganizationofvineandwine，oiv)發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2014年中國用于釀造葡萄酒的葡萄種植面積為79.9萬公頃，占全球葡萄種植面積的11%，超過79.2萬公頃的法國躍居世界第二。目前，葡萄產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的一個重要產(chǎn)業(yè)。因此，探明葡萄果實生長發(fā)育的分子調(diào)控機制，對促進葡萄研究，提高我國葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，增加我國葡萄在國內(nèi)和國際市場的競爭力具有極為重要的現(xiàn)實意義。葡萄果實的生長發(fā)育呈現(xiàn)出一種典型的雙“s”型曲線，總體上分為3個生長階段：第一生長周期(幼果膨大期)、停滯期(硬核期)和第二生長周期。葡萄果實的第一生長周期(幼果膨大期)從開花期持續(xù)將近60天。在這一生長周期結(jié)束時，漿果和種胚基本形成，漿果普遍呈橢圓形并生長到成熟果實體積的70%。第二個時期叫做停滯期(硬核期)。這一時期持續(xù)時間的長短與葡萄品種特性有關(guān)，無核葡萄這一時期相對短些，有核葡萄主要進行種胚的發(fā)育、種皮的硬化。此期還進行風味物質(zhì)和芳香族化合物的合成、以及一些前體物質(zhì)的形成。停滯期(硬核期)結(jié)束的標志是葡萄果皮的顏色開始發(fā)生變化，因此這個轉(zhuǎn)折點也叫轉(zhuǎn)色期。一般認為葡萄果實的停滯期在很大程度上決定了漿果成熟時的品質(zhì)。之后，葡萄果實的發(fā)育進入最后一個時期——第二生長周期，漿果體積再次快速增大，含糖量急劇上升，含酸量迅速下降，單寧含量顯著降低，花色苷和芳香族化合物大量合成，從而使果實呈現(xiàn)出特有的色、香、味，達到最佳的食用狀態(tài)。目前，對果實生長發(fā)育的研究主要集中在第二生長周期即從果實轉(zhuǎn)色到成熟的階段，而對前兩個時期的關(guān)注很有限。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及葡萄早熟基因vvwrky13在調(diào)控植物中乙烯生物合成中的應(yīng)用，同時不改變果實成熟時品質(zhì)的功能和應(yīng)用，可以為葡萄早熟有利基因挖掘做出貢獻，從而解決縮短果實生長期的時候，難以保持果實品質(zhì)的生產(chǎn)問題。為達到解決上述生產(chǎn)問題的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：本發(fā)明提供了葡萄早熟基因vvwrky13在調(diào)控植物中乙烯生物合成中的應(yīng)用。進一步的：所述植物為番茄。進一步的：將含有葡萄早熟基因vvwrky13的農(nóng)桿菌菌株侵染番茄，進行共培養(yǎng)；將共培養(yǎng)后的外植體置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)；待外植體發(fā)芽后轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基培養(yǎng)；之后將芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至獲得轉(zhuǎn)基因vvwrky13番茄植株。進一步的：在花后7天和轉(zhuǎn)色期，乙烯在轉(zhuǎn)基因vvwrky13番茄株系中的釋放速率顯著高于野生型番茄，vvwrky13影響番茄果實發(fā)育前期乙烯的生成量。進一步的：乙烯合成關(guān)鍵酶基因slacs1b、slaco1和slaco4在轉(zhuǎn)基因vvwrky13番茄果實中的表達量顯著升高，vvwrky13通過影響番茄果實發(fā)育過程中乙烯合成相關(guān)基因的表達來調(diào)控番茄果實中乙烯的生物合成。進一步的：轉(zhuǎn)基因vvwrky13番茄植株種子具有典型的組成型三重反應(yīng)表型。進一步的：轉(zhuǎn)基因vvwrky13番茄植株中vvwrky13基因的相對表達量與野生型番茄相比顯著增加，vvwkry13過表達促進了乙烯的過量生成。進一步的：基因vvwrky13的過表達縮短了果實發(fā)育過程中的膨大期。進一步的：基因vvwrky13過表達番茄株系果實從開花到轉(zhuǎn)色比野生型早2-3天，vvwrky13縮短了果實幼果發(fā)育的時間。進一步的：基因vvwrky13過表達番茄株系果實中的番茄紅素、可溶性糖和可滴定酸的含量與野生型相比均無變化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益技術(shù)效果是：1、本發(fā)明通過實驗證明所述vvwrky13基因在果實的幼果膨大期大量表達，在停滯期和第二生長期表達量迅速降低；并且經(jīng)轉(zhuǎn)基因番茄表型性狀驗證只在幼果膨大期起作用，對停滯期和第二生長期幾乎沒有影響。2、本發(fā)明所述vvwrky13基因通過調(diào)控內(nèi)源乙烯的生成量起作用，沒有新物質(zhì)的生成，安全可靠。3、本發(fā)明所述vvwrky13基因通過促進幼果膨大期內(nèi)源乙烯的生成，縮短幼果膨大期，從而達到縮短果實發(fā)育期，促進果實早熟的效果。4、本發(fā)明所述vvwrky13基因在影響果實品質(zhì)的重要階段—停滯期和第二生長期--表達量很低，幾乎不影響這兩個時期果實的生長發(fā)育，從而最后對果實品質(zhì)完全沒有負面影響。5、完熟后果實的品質(zhì)指標可溶性總糖、可滴定酸含量和番茄紅素的含量均無明顯變化。本發(fā)明選用漿果研究的模式作物—番茄為實驗材料。通過對vvwrky13轉(zhuǎn)基因番茄株系生長發(fā)育相關(guān)表型性狀的研究，證明vvwrky13通過調(diào)控果實幼果膨大期乙烯的生成，縮短果實的幼果膨大期，從而使果實早熟但不改變果實的品質(zhì)。附圖說明圖1是本發(fā)明中葉盤法轉(zhuǎn)化觀賞番茄品種‘micro-tom’的過程。從左至右的5幅圖片分別是萌發(fā)的番茄幼苗、預(yù)培養(yǎng)的番茄子葉、發(fā)芽的愈傷組織、生根培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移至土壤中的轉(zhuǎn)基因番茄植株。圖2是本發(fā)明中觀賞番茄品種‘micro-tom’的轉(zhuǎn)基因株系中vvwrky13的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖3是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實的乙烯生成量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖4是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slacs1a在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖5是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slacs1b在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖6是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slacs2在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖7是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slacs4在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖8是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slacs6在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖9是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slaco1在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖10是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slaco3在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖11是本發(fā)明中乙烯合成關(guān)鍵酶基因slaco4在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖12是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系的生長情況，其中a、b、c分別代表30天、45天和60天番茄植株的生長狀況。wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖13是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系的果實，其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖14是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系果實橫切圖，其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純和的轉(zhuǎn)基因株系。圖15是本發(fā)明中栽培番茄品種‘a(chǎn)ilsacraig’的vvwrky13過表達株系的pcr鑒定。s1-s3：轉(zhuǎn)基因樣品；w：野生型對照；o：陰性對照。圖16是本發(fā)明中栽培番茄品種‘a(chǎn)ilsacraig’的轉(zhuǎn)基因株系中vvwrky13的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖17是本發(fā)明中vvwrky13過表達番茄株系對乙烯的三重反應(yīng)。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖18是本發(fā)明中acc對vvwrky13過表達番茄株系胚軸長度的影響。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖19是本發(fā)明中aoa對vvwrky13過表達番茄株系三重反應(yīng)的影響。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖20是本發(fā)明中aoa對vvwrky13過表達番茄株系三重反應(yīng)中胚軸長度的影響。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖21是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植株不同時期的果實中果膠酶基因slpg1的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖22是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植株不同時期的果實中果膠酶基因slpg3的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖23是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系完熟果實中番茄紅素的含量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖24是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系完熟果實中可溶性總糖的含量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。圖25是本發(fā)明中vvwkry13過表達番茄株系完熟果實中可滴定酸的含量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉(zhuǎn)基因株系。具體實施方式以下結(jié)合附圖、附表和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細的說明。實施例1本發(fā)明所闡明的vvwrky13基因在乙烯生物合成中的功能和應(yīng)用的證明，具體包括如下步驟：1、vvwrky13過表達番茄的轉(zhuǎn)化和篩選：(1)取一定量的市售觀賞番茄品種‘micro-tom’的種子，用75%的乙醇浸泡消毒30s，迅速倒掉。再用4%的次氯酸鈉浸泡消毒15min，消毒后用無菌水洗滌7-8次，每次需充分洗滌，徹底去掉殘留的消毒劑。種子洗滌干凈后，將種子播在種子萌發(fā)培養(yǎng)基（1/2ms）。黑暗培養(yǎng)3-4天待種子發(fā)芽，發(fā)芽后移至25℃，光周期為16h/8h（光照/黑暗）的條件下培養(yǎng)。待長出子葉，子葉剛剛打開、未長出真葉之前的小苗用于轉(zhuǎn)化。(2)將vvwrky13的cds序列(genbank登錄號：jq692108)轉(zhuǎn)入含35s啟動子的super1300質(zhì)粒。之后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株eha105中，并保存于-80℃的超低溫冰箱中，備用。將保存于-80℃的含vvwrky13質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株在yeb液體培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)。其中培養(yǎng)農(nóng)桿菌所用的yeb液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，蔗糖5g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，ph7.0。分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷卻至室溫后加入50mg/l過濾滅菌的卡那霉素和利福平。(3)取步驟(1)未長出真葉的無菌子葉，剪去葉尖及葉柄部，將剩余子葉剪成3mm×3mm的大小的方塊，置于無抗生素的ms固體培養(yǎng)基上，28℃預(yù)培養(yǎng)2天。(4)將步驟(2)擴搖后的菌液在5000r/min離心10min，沉淀用無菌水稀釋至od600=0.5-0.6作為侵染液。將步驟(3)預(yù)培養(yǎng)2天后的外植體在侵染液中侵染5min。置于無抗生素的ms固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，在28℃暗室共培養(yǎng)2天。共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。(5)將共培養(yǎng)2天后的外植體從暗室取出，全部置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在光下培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。第一次繼代培養(yǎng)后，一般每隔2周進行下一次繼代培養(yǎng)，直至外植體發(fā)芽完全。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa。(6)經(jīng)過芽誘導(dǎo)期后，待外植體發(fā)芽芽長約為2-3cm時轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-4周。芽伸長培養(yǎng)基成分是ms+0.5mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。(7)當芽伸長至4-5cm時，剪掉愈傷組織后將芽轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)中，培養(yǎng)3-4周。其中生根培養(yǎng)基成分是1/2ms+10mg/l潮霉素+2mg/liba。(8)將生根旺盛，生長到一定高度的小苗即時轉(zhuǎn)入土盆里。葉盤法轉(zhuǎn)化番茄的整個過程如圖1所示。2、vvwrky13轉(zhuǎn)基因番茄的篩選和純合（1）提取土培階段正常生長的番茄葉片dna，用基因的特異引物進行pcr鑒定。將檢測得到的陽性植株進行正常培養(yǎng)，并標記為t1代。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列為：vvwrky13-fp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’；vvwrky13-rp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’；（2）為得到純合的轉(zhuǎn)基因株系，單株收獲t1代種子并播種，得到t2代轉(zhuǎn)基因番茄幼苗。（3）提取t2代轉(zhuǎn)基因番茄葉片dna，去除產(chǎn)生基因分離植株，收獲t2代種子。種植收獲的種子，得到t3代的轉(zhuǎn)基因番茄幼苗。（4）pcr檢測t3代轉(zhuǎn)基因番茄群體的分離情況。在t3代中不出現(xiàn)基因分離的株系即為純合的轉(zhuǎn)基因株系。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列與(1)中的一致。（5）采用qrt-pcr技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因株系中vvwrky13基因的相對表達量。檢測結(jié)果如圖2所示。檢測vvwrky13基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：vvwrky13-fp：5’-ggttgccaacaatccct-3’；vvwrky13-rp：5’-gtcatctccaccgatacttc-3’；（6）收集純合的轉(zhuǎn)基因番茄株系的種子，用于后續(xù)實驗。3、vvwrky13過表達番茄株系乙烯生成量、三重反應(yīng)和乙烯合成基因表達量的檢測（1）以野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，分別選取大小均勻的果實3-4個，測定花后7天、轉(zhuǎn)色期和完熟期果實的乙烯釋放速率。結(jié)果如圖3所示，在花后7天和轉(zhuǎn)色期乙烯在vvwrky13異源過表達株系中的釋放速率顯著高于野生型，而在完熟期差別不明顯，表明vvwrky13影響了番茄果實幼果的乙烯生成量。在乙烯合成途徑中，acc合成酶與acc氧化酶為該途徑的限速酶和關(guān)鍵酶。關(guān)鍵酶基因的表達決定著乙烯的生成量，以同時期的野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，選取大小均勻的野生型和過表達植株的番茄果實3-4個，測定花后7d、轉(zhuǎn)色期和完熟期果實的乙烯合成途徑相關(guān)基因表達量。結(jié)果如圖4-11所示，slacs1b、slaco1和slaco4在轉(zhuǎn)基因果實中比野生型的相對表達量高；其余則無較大差異。綜合分析表明，vvwrky13主要影響了番茄幼果發(fā)育過程中乙烯合成關(guān)鍵酶基因的表達，進而影響番茄乙烯的生成。檢測slacs1b、slaco1和slaco4基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：slacs1b-fp：5’-tgttctgaacctggttggt-3’；slacs1b-rp：5’-taaaatcatccaatcttcga-3’；slaco1-fp：5’-gtacccgatcttgacga-3’；slaco1-rp：5’-gaagtatgatgcctcctg-3’；slaco4-fp：5’-ctgtcatatttccagcacc-3’；slaco4-rp：5’-aagttgacagtagtctccacag-3’。（2）植物對乙烯的三重反應(yīng)是植物所特有的反應(yīng)，可以用于乙烯的生物鑒定。被乙烯處理后的植物幼苗呈現(xiàn)出上下胚軸伸長生長的抑制，上胚軸的橫向加粗，和頂點鉤的擴大。將野生型和vvwkry13過表達番茄種子，無菌處理之后，點種在含有10μmacc和10μmol/laoa的ms培養(yǎng)基上，28℃正常培養(yǎng)12h后，進行黑暗照培養(yǎng)7d，觀測其生長情況。結(jié)果顯示：相對于野生型番茄，vvwrky13過表達番茄植株在沒有外源乙烯處理下，上下胚軸生長受抑制，表現(xiàn)出對乙烯的組成型三重反應(yīng)。在含有10μm乙烯合成抑制劑aoa的培養(yǎng)基上，vvwkry13過表達番茄株系和野生型番茄的三重反應(yīng)差異變小。以上結(jié)果在表型上證明了vvwkry13過表達促進了乙烯的過量生成。4、vvwrky13過表達番茄株系果實各生長期長短的檢測（1）觀察同時播種的野生型番茄和vvwrky13過表達的番茄株系果實的發(fā)育情況。結(jié)果如圖12、表1和表2所示，vvwrky13過表達株系番茄果實從開花到轉(zhuǎn)色的時間大約提前2-3天，而轉(zhuǎn)色到完熟時間均為10天。表明vvwrky13縮短了番茄果實幼果的發(fā)育時間。表1從開花至果實轉(zhuǎn)色的時間統(tǒng)計株系轉(zhuǎn)色時間（dpa）wt42.67a±1.15l136.33b±1.52l239.33ab±4.0l336.33b±1.52表2果實從轉(zhuǎn)色至成熟的時間統(tǒng)計株系轉(zhuǎn)色到成熟（d）wt10a±1.15l110a±1.52l210a±4.04l310a±1.52（2）多聚半乳糖醛酸酶屬于果膠酶類，能降解細胞壁中的果膠使細胞壁分解，參與果實的軟化，其合成酶基因為slpg。檢測其合成基因slpg1和slpg3的表達量，發(fā)現(xiàn)其在野生型和vvwrky13過表達番茄株系中的相對表達量并無差異。vvwkry13過表達番茄株系的果實如圖13和圖14所示。檢測slpg1和slpg3基因表達量所用的引物序列為：slpg1-fp：5’-tgaggaccaaatcggaatc-3’；slpg1-rp：5’-tgtcggactaagaaagaataacc-3’；slpg3-fp：5’-atacaacagttttcagcagttcaagt-3’；slpg3-rp：5’-ggttttccactttcccctactaa-3’。5、vvwrky13過表達番茄株系完熟果實品質(zhì)的檢測番茄紅素屬于類胡蘿卜素，是一種天然的食用色素，主要集中在各種果菜和水果的紅色果肉或組織當中，因其缺乏維生素原活性，對氧自由基具有粹滅作用，因此有預(yù)防癌癥、養(yǎng)顏美容、預(yù)防心腦血管疾病，也是衡量番茄果實品質(zhì)的關(guān)鍵指標之一。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系果實為材料，測定完熟期果實中番茄紅素的含量。結(jié)果顯示番茄紅素在野生型和vvwrky13過表達番茄植株果實中的含量沒有發(fā)生明顯變化。由此可知vvwrky13的過量表達并沒有對番茄果實中的番茄紅素含量產(chǎn)生影響。6、番茄甜度是番茄品質(zhì)性狀的重要組成部分，它主要取決于番茄果實中可溶性糖含量，因此可以用可溶性糖含量來評價番茄的品質(zhì)。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料，測定可溶性糖含量。結(jié)果顯示vvwrky13轉(zhuǎn)基因株系果實與野生型果實的糖含量沒有發(fā)生明顯改變，表明vvwrky13的過表達沒有影響番茄果實中可溶性糖含量。7、果實中的酸主要是指總有效有機酸根的陰離子，在番茄中主要可滴定酸為檸檬酸，在番茄的風味中發(fā)揮著重要作用。我們以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料檢測可滴定酸的含量。結(jié)果表明二者并無明顯差異，說明vvwrky13不影響番茄中可滴定酸含量。綜上表明葡萄vvwrky13通過促進幼果膨大期內(nèi)源乙烯的生成，縮短幼果膨大期，從而達到縮短果實發(fā)育期，促進果實早熟的效果，但對果實品質(zhì)沒有負面影響。實施例2本發(fā)明所闡明的vvwrky13在乙烯生物合成中的功能和應(yīng)用的證明，具體包括如下步驟：1、vvwrky13過表達番茄的轉(zhuǎn)化和篩選：（1）取一定量的市售栽培番茄品種‘a(chǎn)ilsacraig(ac)’的種子，用75%的乙醇浸泡消毒30s，迅速倒掉。再用4%的次氯酸鈉浸泡消毒15min，消毒后用無菌水洗滌7-8次，每次需充分洗滌，徹底去掉殘留的消毒劑。種子洗滌干凈后，將種子播在種子萌發(fā)培養(yǎng)基（1/2ms）。黑暗培養(yǎng)3-4天待種子發(fā)芽，發(fā)芽后移至25℃，光周期為16h/8h（光照/黑暗）的條件下培養(yǎng)。待長出子葉，子葉剛剛打開、未長出真葉之前的小苗用于轉(zhuǎn)化。（2）將保存于-80℃的含35s啟動子質(zhì)粒的eha105農(nóng)桿菌菌株在yeb液體培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)和擴大培養(yǎng)。其中培養(yǎng)農(nóng)桿菌所用的yeb液體培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，蔗糖5g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，ph7.0。分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷卻至室溫后加入50mg/l過濾滅菌的卡那霉素和利福平。（3）取步驟(1)未出真葉的無菌子葉，剪去葉尖及葉柄部，將剩余子葉剪成3mm×3mm的大小的方塊，置于無抗生素的ms固體培養(yǎng)基上，28℃預(yù)培養(yǎng)2天。（4）將步驟(2)擴搖后的菌液在5000r/min離心10min，沉淀用無菌水稀釋至od600=0.5-0.6作為侵染液。將預(yù)培養(yǎng)2天后的外植體在侵染液中侵染5min。置于無抗生素的ms固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，在28℃暗室共培養(yǎng)2天。共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。（5）將共培養(yǎng)2天后的外植體從暗室取出，全部置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在光下培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。第一次繼代培養(yǎng)后，一般每隔2周進行下一次繼代培養(yǎng)，直至外植體發(fā)芽完全。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa。（6）經(jīng)過芽誘導(dǎo)期后，待外植體發(fā)芽芽長約為2-3cm時轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-4周。芽伸長培養(yǎng)基成分是ms+0.5mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。（7）當芽伸長至4-5cm時，剪掉愈傷組織后將芽轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-4周。其中生根培養(yǎng)基成分是1/2ms+10mg/l潮霉素+2mg/liba。（8）將生根旺盛，生長到一定高度的小苗即時轉(zhuǎn)入土盆里。2、vvwrky13轉(zhuǎn)基因番茄的篩選和純合（1）提取土培階段正常生長的番茄葉片dna，用基因的特異引物進行pcr鑒定。結(jié)果如圖15所示。將檢測得到的陽性植株進行正常培養(yǎng)，并標記為t1代。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列為：vvwrky13-fp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’；vvwrky13-rp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’。（2）為得到純合的轉(zhuǎn)基因株系，單株收獲t1代種子并播種，得到t2代轉(zhuǎn)基因番茄幼苗。（3）提取t2代轉(zhuǎn)基因番茄葉片dna，去除產(chǎn)生基因分離植株，收獲t2代種子。種植收獲的種子，得到t3代的轉(zhuǎn)基因番茄幼苗。（4）pcr檢測t3代轉(zhuǎn)基因番茄群體的分離情況。在t3代中不出現(xiàn)基因分離的株系即為純合的轉(zhuǎn)基因株系。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列與(1)中的一致。（5）采用qrt-pcr技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因株系中vvwrky13基因的相對表達量。檢測結(jié)果如圖16所示。檢測vvwrky13基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：vvwrky13-fp：5’-ggttgccaacaatccct-3’；vvwrky13-rp：5’-gtcatctccaccgatacttc-3’；（6）收集純合的轉(zhuǎn)基因番茄株系的種子，用于后續(xù)實驗。3、vvwrky13過表達番茄株系乙烯生成量、三重反應(yīng)和乙烯合成基因表達量的檢測（1）以野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，分別選取大小均勻的果實3-4個，測定花后7天、轉(zhuǎn)色期和完熟期果實的乙烯釋放速率。結(jié)果顯示，在花后7天和轉(zhuǎn)色期乙烯在vvwrky13異源過表達株系中的釋放速率顯著高于野生型，而在完熟期差別不明顯，表明vvwrky13影響了番茄果實幼果的乙烯生成量。在乙烯合成途徑中，acc合成酶與acc氧化酶為該途徑的限速酶和關(guān)鍵酶。關(guān)鍵酶基因的表達決定著乙烯的生成量，以同時期的野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，選取大小均勻的野生型和過表達植株的番茄果實3-4個，測定花后7d、轉(zhuǎn)色期和完熟期果實的乙烯合成途徑相關(guān)基因表達量。結(jié)果顯示，slacs1b、slaco1和slaco4在轉(zhuǎn)基因果實中比野生型的相對表達量高；其余則無較大差異。綜合分析表明，vvwrky13主要影響了番茄幼果發(fā)育過程中乙烯合成關(guān)鍵酶基因的表達，進而影響番茄乙烯的生成。檢測slacs1b、slaco1和slaco4基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：slacs1b-fp：5’-tgttctgaacctggttggt-3’；slacs1b-rp：5’-taaaatcatccaatcttcga-3’；slaco1-fp：5’-gtacccgatcttgacga-3’；slaco1-rp：5’-gaagtatgatgcctcctg-3’；slaco4-fp：5’-ctgtcatatttccagcacc-3’；slaco4-rp：5’-aagttgacagtagtctccacag-3’。（2）植物對乙烯的三重反應(yīng)是植物所特有的反應(yīng)，可以用于乙烯的生物鑒定。被乙烯處理后的植物幼苗呈現(xiàn)出上下胚軸伸長生長的抑制，上胚軸的橫向加粗，和頂點鉤的擴大。將野生型和vvwkry13過表達番茄種子，無菌處理之后，點種在含有10μmacc和10μmol/laoa的ms培養(yǎng)基上，28℃正常培養(yǎng)12h后，進行黑暗照培養(yǎng)7d，觀測其生長情況。結(jié)果如圖17-20所示：相對于野生型番茄，vvwrky13過表達番茄植株在沒有外源乙烯處理下，上下胚軸生長受抑制，表現(xiàn)出對乙烯的組成型三重反應(yīng)。在含有10μm乙烯合成抑制劑aoa的培養(yǎng)基上，vvwkry13過表達番茄株系和野生型番茄的三重反應(yīng)差異變小。以上結(jié)果在表型上證明了vvwkry13過表達促進了乙烯的過量生成。4、vvwrky13過表達番茄株系果實各生長期長短的檢測（1）觀察同時播種的野生型番茄和vvwrky13過表達的番茄株系果實的發(fā)育情況。結(jié)果顯示，vvwrky13過表達株系番茄果實從開花到轉(zhuǎn)色的時間大約提前2-3天，而轉(zhuǎn)色到完熟時間均為10天。表明vvwrky13縮短了番茄果實幼果的發(fā)育時間。（2）多聚半乳糖醛酸酶屬于果膠酶類，能降解細胞壁中的果膠使細胞壁分解，參與果實的軟化，其合成酶基因為slpg。檢測其合成基因slpg1和slpg3的表達量。結(jié)果如圖21和圖22所示，其在野生型和vvwrky13過表達番茄株系中的相對表達量并無差異。檢測slpg1和slpg3基因表達量所用的引物序列為：slpg1-fp：5’-tgaggaccaaatcggaatc-3’；slpg1-rp：5’-tgtcggactaagaaagaataacc-3’；slpg3-fp：5’-atacaacagttttcagcagttcaagt-3’；slpg3-rp：5’-ggttttccactttcccctactaa-3’。5、vvwrky13過表達番茄株系完熟果實品質(zhì)的檢測（1）番茄紅素屬于類胡蘿卜素，是一種天然的食用色素，主要集中在各種果菜和水果的紅色果肉或組織當中，因其缺乏維生素原活性，對氧自由基具有粹滅作用，因此有預(yù)防癌癥、養(yǎng)顏美容、預(yù)防心腦血管疾病，也是衡量番茄果實品質(zhì)的關(guān)鍵指標之一。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系果實為材料，測定完熟期果實中番茄紅素的含量。結(jié)果如圖23所示，番茄紅素在野生型和vvwrky13過表達番茄植株果實中的含量沒有發(fā)生明顯變化。由此可知vvwrky13的過量表達并沒有對番茄果實中的番茄紅素含量產(chǎn)生影響。（2）番茄甜度是番茄品質(zhì)性狀的重要組成部分，它主要取決于番茄果實中可溶性糖含量，因此可以用可溶性糖含量來評價番茄的品質(zhì)。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料，測定可溶性糖含量。結(jié)果如圖24所示vvwrky13轉(zhuǎn)基因株系果實與野生型果實的糖含量沒有發(fā)生明顯改變，表明vvwrky13的過表達沒有影響番茄果實中可溶性糖含量。（3）果實中的酸主要是指總有效有機酸根的陰離子，在番茄中主要可滴定酸為檸檬酸，在番茄的風味中發(fā)揮著重要作用。我們以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料檢測可滴定酸的含量。結(jié)果如圖25所示，二者并無明顯差異，說明vvwrky13不影響番茄中可滴定酸含量。綜上表明葡萄vvwrky13通過促進幼果膨大期內(nèi)源乙烯的生成，縮短幼果膨大期，從而達到縮短果實發(fā)育期，促進果實早熟的效果，但對果實品質(zhì)沒有負面影響。以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。當前第1頁12