一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002]MicroRNA是由內(nèi)源基因編碼、長(zhǎng)度約21~25nt的一類非編碼單鏈RNA分子，其主 要功能是參與動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)與調(diào)控。大多數(shù)miRNA基因存在于基因組中的形式 包括3種：?jiǎn)慰截悺⒍嗫截惡突虼?。雖然植物miRNA的發(fā)現(xiàn)和識(shí)別相比動(dòng)物的時(shí)間要短， 但對(duì)植物miRNA的研究已成為中外科研工作者解析基因表達(dá)調(diào)控過程的重要研究?jī)?nèi)容。
[0003]MicroRNA是一種古老的基因調(diào)控機(jī)制，在進(jìn)化過程中表現(xiàn)出非常高的結(jié)構(gòu)保守 性。植物MicroRNA具有和動(dòng)物MicroRNA共同的一些特征。如：長(zhǎng)度一般是21-25nt的RNA; 前體均是具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA;成熟后不具有編碼蛋白質(zhì)的能力；成熟的MicroRNA3' 端為羥基，5'端是磷酸基團(tuán)等。與動(dòng)物MicroRNA相比，植物MicroRNA還具有以下幾點(diǎn)特 征：①植物MicroRNA前體相比動(dòng)物MicroRNA前體長(zhǎng)度變異明顯；②植物MicroRNA成熟的 時(shí)候才體現(xiàn)進(jìn)化上的保守性，動(dòng)物MicroRNA不論是前體還是成熟的MicroRNA保守性均較 高；③植物MicroRNA5'端更傾向于與尿嘧啶結(jié)合；④植物MicroRNA與靶mRNA基本上完 全互補(bǔ)對(duì)，并可與任何蛋白編碼區(qū)作用；⑤植物MicroRNA進(jìn)化保守性較高，其靶標(biāo)主要是 控制植物生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等植物中MicroRNA作用及其作用機(jī)制是植物生物學(xué)研 究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。近年來，雖然在MicroRNA研究方面已取得了突破性進(jìn)展，但對(duì)其功 能及具體機(jī)理的研究還有待深入研究。然而對(duì)植物MicroRNA的相關(guān)研究的前提都是提取 植物MicroRNA，常規(guī)的植物MicroRNA采用PAGE膠回收法，其流程較為繁瑣，且操作難度較 大。因此，提供一種快速、簡(jiǎn)便地提取植物MicroRNA顯得非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明提供一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，利用該方法能夠節(jié)省大量操 作時(shí)間，便于更快速地提取到植物MicroRNA。
[0005] -種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，包括植物組織的破碎、MicroRNA的吸 附以及雜質(zhì)的去除。其具體步驟如下： 植物組織的破碎：稱取0. 2-lg植物樣品加入液氮研磨成粉狀，將其迅速轉(zhuǎn)入1. 5ml離 心管，加入〇? 5-lmlTrizol裂解液，振蕩器震蕩30-60s后，加入100-300ul的BufferA，振 蕩器震蕩30-60s。
[0006]MicroRNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：將樣品10000-13000rpm/min離心10min，離 心后將上清吸到1.5ml離心管。加入等體積的BufferB，混勾后將樣品加到RNase-free 吸附柱RA，10000-13000rpm/min離心lmin，收集液體到新的1. 5ml離心管，加入等體積的 BufferC混勾后將樣品加到RNase-free吸附柱RB。倒掉液體，加入200-600ul去蛋白液， 10000-13000rpm/min離心l_5min，倒掉液體，加入 200_600ul漂洗液，2000-12000rpm/min 離心l_5min，倒掉液體，加入200_600ul漂洗液，10000-13000rpm/min離心l_5min，倒掉液 體，吹干后加入30-60ulDEPC水，10000-13000rpm/min離心l-5min，收集液體。
[0007] 所述的Trizol提取液[150-200mlsolutionD、17-18ml0? 2M氯化鈉（PH= 4. 2-4. 5)、170_180ml水飽和酸、34_35ml氯仿、l_2ml2-Mercaptoethaol(b_ 硫基乙醇），其 中solutionD的配方如下：280-290g異硫氰酸胍、2-3g月桂酸、50-100ml200-500mM檸檬 酸鈉（PH= 7. 0-8. 0)，加DEPC處理水至 500ml] 所述的BufferA溶液：氯仿 所述的BufferB溶液：70-80%乙醇 所述的BufferC溶液：無水乙醇 所述的去蛋白液溶液：3-8M鹽酸胍，10-30mM三羥甲基氨基甲烷，pH6-7,30-40%乙醇 所述的漂洗液溶液：10_30mM氯化鈉，l_5mM三羥甲基氨基甲烷，pH7-8，70-90 %乙醇 所述的RNase-free吸附柱RA為硅基質(zhì)膜吸附柱。購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司 所述的RNase-free吸附柱RB為玻璃纖維濾膜吸附柱。購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公 司 本發(fā)明通過Trizol溶液裂解植物細(xì)胞，利用硅基質(zhì)膜吸附柱去除掉mRNA后用玻璃纖 維濾膜吸附柱特異性吸附MicroRNA。同時(shí)利用去蛋白液和漂洗液洗去雜質(zhì)。常規(guī)的植物 MicroRNA提取方法主要是通過從凝膠中切下MicroRNA片段，對(duì)其進(jìn)行提取與純化，耗時(shí) 需要20h以上，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的操作容易造成MicroRNA的降解，與常規(guī)的植物MicroRNA提 取方法相比，本方法僅需要lh左右即可以提取到植物microRNA，可以節(jié)省大量的提取時(shí) 間。
【附圖說明】
[0008] 圖1為利用本方法提取的植物MicroRNA電泳結(jié)果圖。 具體實(shí)施例： 圖1中，泳道1，2, 3分別是水稻、花生、甘蔗的MicroRNA電泳結(jié)果圖，泳道4為DNA marker〇
[0010] 本發(fā)明的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，具體步驟如下 植物組織的破碎：分別稱取0. 5g的水稻、花生、甘蔗樣品加入液氮研磨成粉狀，將其迅 速轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管，加入lmlTrizol裂解液，振蕩器震蕩30s后，加入200ul的Buffer A，振蕩器震蕩30s。
[0011] MicroRNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：將樣品12000rpm/min離心10min，離心后將上 清吸到1. 5ml離心管。加入等體積的BufferB，混勻后將樣品加到RNase-free吸附柱RA， 12000rpm/min離心lmin，收集液體到新的1. 5ml離心管，加入等體積的BufferC混勾后 將樣品加到RNase-free吸附柱RB。倒掉液體，加入500ul去蛋白液，12000rpm/min離心 lmin，倒掉液體，加入500ul漂洗液，2000rpm/min離心lmin，倒掉液體，加入500ul漂洗液， 12000rpm/min離心lmin，倒掉液體，吹干后加入 50ulDEPC水，12000rpm/min離心 2min， 收集液體。
[0012] 下表為植物MicroRNA的 0D(260:280)值。
[0013] Trizol提取液[174mlsolutionD、17. 4ml0? 2M氯化鈉（PH= 4. 2-4. 5)、174ml水 飽和酸、34. 8ml氯仿、1. 2ml2-Mercaptoethaol(b_硫基乙醇），其中solutionD的配方如 下：283. 5g異硫氰酸胍、2. 5g月桂酸、50ml250mM檸檬酸鈉（PH= 7. 0)，加DEPC處理水至 500ml]〇
[0014] BufferA溶液：氯仿。
[0015] BufferB溶液：70% 乙醇。
[0016] BufferC溶液：無水乙醇。
[0017] 去蛋白液溶液：51鹽酸胍，20禮三羥甲基氨基甲烷4冊(cè).6,38%乙醇。
[0018] 漂洗液溶液：20禮氯化鈉，21111三羥甲基氨基甲烷4117.5,80%乙醇。
[0019] RNase-free吸附柱RA為硅基質(zhì)膜吸附柱。購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。
[0020] RNase-free吸附柱RB為玻璃纖維濾膜吸附柱。購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。
[0021] 利用本方法提取的植物MicroRNA結(jié)果見圖1，泳道1，2, 3分別是水稻、花生、甘蔗 的MicroRNA電泳結(jié)果圖，泳道4為DNAmarker。從圖1可看出本方法可以提取到完整性較 好的植物MicroRNA。純度的檢測(cè)結(jié)果見表1，植物MicroRNA樣品的0D(260:280)比值均在 1. 91-1. 93之間，說明本方法提取的植物MicroRNA具有較高的純度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，包括植物組織的破碎、MicroRNA的吸附 以及雜質(zhì)的去除，其特征是： 植物組織的破碎：稱取0. 2-lg植物樣品加入液氮研磨成粉狀，將其迅速轉(zhuǎn)入I. 5ml離 心管，加入〇? 5-lml Trizol裂解液，振蕩器震蕩30-60s后，加入100-300ul的Buffer A，振 蕩器震蕩30-60s ; MicroRNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：將樣品10000-13000rpm/min離心10min，離心后 將上清吸到I. 5ml離心管，加入等體積的Buffer B，混勾后將樣品加到RNase-free吸附 柱RA，10000 -13000rpm/min離心lmin，收集液體到新的I. 5ml離心管，加入等體積的 Buffer C混勾后將樣品加到RNase-free吸附柱RB ;倒掉液體，加入200-600ul去蛋白液， 10000-13000rpm/min 離心 l_5min ;倒掉液體，加入 200_600ul 漂洗液，2000-12000rpm/min 離心l_5min ;倒掉液體，加入200_600ul漂洗液，10000-13000rpm/min離心l_5min ;倒掉 液體，吹干后加入30-60ul DEPC水，10000-13000 rpm/min離心l-5min，收集液體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所 述的 Trizol提取液為 150-200ml solutionD、PH=4. 2-4. 5 的 17-18 ml 的 0? 2M 氯化鈉、 170_180ml 水飽和酸、34-35 ml 氯仿、1-2 ml 2-Mercaptoethaol，其中 solutionD 的配方 如下：280-290g異硫氰酸胍、2-3g月桂酸、PH=7. 0-8. 0的50-100ml 200-500mM檸檬酸鈉， 加DEPC處理水至500ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 Buffer A溶液：氯仿。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 Buffer B 溶液：70-80% 乙醇。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 Buffer C:無水乙醇。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 去蛋白液溶液：3-8M鹽酸胍，10-30mM三羥甲基氨基甲烷，pH6-7,30-40%乙醇。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 漂洗液溶液：10-30mM氯化鈉，l_5mM三羥甲基氨基甲烷，pH7-8,70-90%乙醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 RNase-free吸附柱RA為硅基質(zhì)膜吸附柱。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，其特征是所述的 RNase-free吸附柱RB為玻璃纖維濾膜吸附柱。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用吸附柱提取植物MicroRNA的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過Trizol溶液裂解植物細(xì)胞，利用硅基質(zhì)膜吸附柱去除掉mRNA后用玻璃纖維濾膜吸附柱特異性吸附Micro？RNA。同時(shí)利用去蛋白液和漂洗液洗去雜質(zhì)。常規(guī)的植物MicroRNA提取方法主要是通過從凝膠中切下Micro？RNA片段，對(duì)其進(jìn)行提取與純化，耗時(shí)需要20h以上，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的操作容易造成Micro？RNA的降解，與常規(guī)的植物MicroRNA提取方法相比，本方法僅需要1h左右即可以提取到植物micro？RNA，可以節(jié)省大量的提取時(shí)間。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號(hào)】CN105063014
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510449530
【發(fā)明人】王清水, 余彥
【申請(qǐng)人】福建師范大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日