專利名稱：：調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程
技術領域：
，具體涉及調控細胞程序性死亡的花生衰老基因AhSAG及編碼序列與應用。
背景技術：
：在植物中，細胞死亡是一種常見的現(xiàn)象，是高度專一的細胞發(fā)育過程中的一部分。在這個過程中，植物細胞受到外在和內在信息(外在環(huán)境、發(fā)育信號、代謝環(huán)境等)的刺激，改變細胞命運，引起細胞死亡。細胞死亡表現(xiàn)為兩種類型細胞壞死(Cellnecrosis)和細胞程序性死亡(PCD)。細胞壞死，通常是由于偶然的外界因素如受熱或藥物等極度刺激引起的溶酶體顆粒的釋放，導致細胞自溶死亡，是一種非正常的死亡。PCD是指受基因編碼指令調控的一系列有序的分子事件，是一種主動的、生理性的細胞死亡過程。迄今為止，已在高等植物中發(fā)現(xiàn)了許多P⑶事件，包括植物發(fā)育過程中的P⑶和環(huán)境誘導P⑶,主要有植物病原物互作引發(fā)的過敏反應(hypersensitiveresponse,HR)、根皮層細胞死亡、珠心細胞退化、糊粉層細胞退化、通氣組織形成、體細胞胚胎發(fā)生、根冠細胞死亡、單性花形成、大孢子消失、花藥壁開裂等。植物PCD與動物細胞凋亡相似細胞膜保持完整性和收縮，類半胱氨酸蛋白酶(Cysteine-containingAspartate-specificproteases,caspasess)參與，DNA分割成核仁小體梯狀等。但由于動植物在細胞形態(tài)及生理功能上存在顯著差別，所以植物PCD與動物細胞凋亡的差異較大。在植物中，液泡在PCD中起重要作用，一般采取自噬的方式，但動物細胞凋亡最為典型的特征是形成凋亡小體，并被其它細胞吞噬。細胞衰老是一種P⑶現(xiàn)象，指細胞對環(huán)境變化的適應力以及維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和合成能力的降低，如在亞細胞結構上葉綠體和其他細胞器的有序衰退；代謝水平上細胞內大分子的降解、動員；基因水平上衰老相關基因SAGs的激活和表達。衰老很大程度上被認為是植物生長發(fā)育的最后調節(jié)因素，衰老的快慢直接影響到植物生長，影響農作物產量，葉片早衰被認為是農作物低產的重要原因。紫外、溫度、干旱、病菌等逆境脅迫可促進植物發(fā)生早衰，從而引起植物體內能源的再分配(KimHJ.2007.Molecularregulationofleafsenescence.InsenescenceProcessesinPlants,231—255.LimP0.2007.Leafsenescence.AnnuRevPlantBiology58:115_136)。因此,推測逆境脅迫與衰老密切相關。與衰老有關基因包括了衰老上調基因和衰老下調基因。衰老上調基因或稱衰老相關基因(senescence-associatedgenes,SAGs)是指一些未曾在功能葉片中表達或低水平表達的基因在衰老期間被激活，mRNA水平隨葉片衰老而提高，即表達上調。衰老下調基因是指衰老過程中，受到抑制而低水平表達，甚至不表達，相應mRNA水平下降的一類基因。采用差異篩選和差減雜交檢測綠葉和衰老葉片的mRNA構建cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)葉片RNA總量下降，而某些基因的表達量反而逐漸升高(劉莉.2008.水稻葉片衰老特異性啟動子的克隆和利用及劍葉早期衰老上升表達基因的鑒定.[學位論文].廣州華南農業(yè)大學)。在模式植物擬南芥的全基因組范圍內鑒定了大量SAG，用包含24，000個基因的Affymetrix芯片雜交擬南芥衰老時期轉錄體，發(fā)現(xiàn)其中約800個基因呈上升、表達(GepsteinS,SabehiG,CarpMJ.2003.Large-scaleidentificationofleafsenescence-associatedgenes.PlantJournal36629~642；AnderssonA,KeskitaloJ,SjodinA..2004.Atranscriptionaltimetableofautumnsenescence.GenomeBiology5R24；LinJF,ffuSH.2004.MoleculareventsinsenescencingArabidopsisleaves.PlantJournal39612-638；Buchanan-ffollastonV,PageT,HarrisonE.2005.Comparativetranscriptomeanalysisrevealssignificantdifferencesingeneexpressionandsignalingpathwaysbetweendevelopmentalanddark/starvation-inducedsenescenceinArabidopsis.PlantJournal42(4):567_85;vanderGraffE,SchwackeR.2006.TranscriptionanalysisofArabidopsismembranetransportersandhormonepathwaysduringdevelopmentalandinducedleafsenescence.PlantPhysiology141:776_792;GuoF,GrawfordNM.2005.Arabidopsisnitricoxidesynthaselistargetedtomotochondriaandprotectsagainstoxidativedamageanddark-inducedsenescence.PlantCell17:3436_3450)。Buchanan-Wollaston等用基因芯片大規(guī)模比較了擬南芥葉片自然衰老和饑餓誘發(fā)懸浮細胞PCD的表達情況，發(fā)現(xiàn)827個自然衰老上升的基因中僅有326個同時是在懸浮細胞中的PCD增強表達(Buchanan-WollastonV,PageT,HarrisonE.2005.Comparativetranscriptomeanalysisrevealssignificantdifferencesingeneexpressionandsignalingpathwaysbetweendevelopmentalanddark/starvation-inducedsenescenceinArabidopsis.PlantJournal42(4):567_85)。推測衰老細胞中細胞死亡包含的PCD過程與植物生長發(fā)育過程中的其他類型PCD交錯相連。目前未見花生衰老基因AhSAG公布過。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的為了調控植物細胞對環(huán)境變化的適應力以及維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和合成能力，提供一種調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列與應用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列，從花生根尖提取RNA得到衰老基因AhSAG，其ORF的堿基序列為474bp，編碼157aa的cDNA序列，其堿基序列如SEQIDNO.I所示。SEQIDN0.I為^tgIataggaagagccgacatcgaaggatcaaamgcaacgtcgctatgaacgcttggctg60CCACAAGCCAGTTATCCCTGTGGTAACTTTTCTGACACCTCTAGCTTCAAATTCCGAAGG120TCTAAAGGATCGTTAGGCCACGCTTTCACGGTTCGTATTCGTACTGGAAATCAGAATCAA180ACGAGCTTTTACCCTTCTGTTCCACACGAGATTTCTGTTCTCGTTGAGCTCATCTTAGGA240CACCTGCGTTATCTTTTAACAGATGTGCCGCCCCAGCCAAACTCCCCACCTGACAATGTC300TTCCGCCCGGATCGACCGGCCGAAGCCAGCCTTGGGTCCAAAAAGAGGGGCAATGCCCCG360CCTCCGATTCACGGAATAAGTAAAATAACGTTAAAAGTAGTGGTATTTCACTTTCGCCGT420TTCCGGCTCCCACTTATCCTACACCTCTCAAGTCATTTCACAAAGTCGGAC474所述的AhSAG來源于鋁誘導花生根尖發(fā)生細胞程序性死亡的花生根尖分生組織，AhSAG的編碼氨基酸列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2為MIGRADIEGSKSNVAMNAffLPQASYPCGNFSDTSSFKFRRSKGSLGHAFTVRIRTGNQNQ60TSFYPSVPHEISVLVELILGHLRYLLTDVPPQPNSPPDNVFRPDRPAEASLGSKKRGNAP120PPIHGISKITLKVVVFHFRRFRLPLILHLSSHFTKSD157所述的AhSAG是衰老誘導增強型基因，在濃度小于20iimol/LAl處理時，AhSAG基因在花生耐鋁性品種和鋁敏感品種中的表達很低；濃度在20lOOiimol/LAl處理時，AhSAG基因表達量顯著升高，鋁敏感品種表達量高于耐鋁性品種表達量；在濃度100400umol/LAl處理時，AhSAG超表達，耐鋁性品種和鋁敏感品種均出現(xiàn)細胞程序性死亡現(xiàn)象，促進植物早衰。本發(fā)明試驗中的花生耐鋁品種99-1507和鋁敏感品種中花2號，是根據發(fā)明人在2008年3月在《中國油料作物學報》發(fā)表的《鋁對花生根尖細胞形態(tài)結構的影響》中的試驗方案獲得。一種包含調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼蛋白序列的重組表達載體，是通過將AhSAG基因導入載體pBI121-GFP得到重組表達載體。所述重組表達載體為正義表達載體或反義表達載體，是利用正義引物或反義引物通過PCR擴增基因AhSAG，然后克隆到載體pTG19-T上，經過酶切，然后導入載體PB1121-GFP中而得到，其作用于植物而得到的正義植物表達載體PB1121-GFP-AhSAG，反義植物表達載體pBI121-GFP-anti-AhSAG，經驗證序列為正確，用于植物遺傳轉化，進行AhSAG基因功能鑒定。所述的正義引物是上游GCTCTAGAATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGXbaI位點下游TGCGGATCCCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACBamHI位點所述的反義引物是上游TTGCGGATCCATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGBamHI位點下游GGCGTCTAGACTAGTCCGACTTTGTGAAATGACXbaI位點。一種包含調控細胞程序性死亡的花生衰老基因編碼序列的重組表達載體的重組菌，所述的重組菌是通過正義植物表達載體和反義植物表達載體導入根癌農桿菌菌株EHA105得到，在異源真核系統(tǒng)中實現(xiàn)功能性表達。一種重組菌的轉基因植株的應用，所述轉基因植株是將重組的含GFP(綠色熒光蛋白)的正義和反義花生衰老基因AhSAG導入煙草中而得到煙草轉基因植株。煙草轉基因植株的測定，是通過熒光顯微鏡觀察轉化煙草的綠色熒光蛋白基因的表達，確定AhSAG在煙草中的表達和定位，在幼嫩的根尖、根的中柱和莖的形成層組織里表達的比較多，而且只在細胞壁和細胞膜中表達。所述煙草轉基因植株鋁處理下GFP(綠色熒光蛋白)表達，是鋁處理誘導了花生衰老基因AhSAG的表達，鋁濃度越高，衰老基因表達越強烈，且在相同的鋁濃度下轉正義基因的煙草比轉反義基因煙草的表達要多，說明鋁脅迫下，煙草根尖正義衰老基因表達增強，而衰老基因的表達加快根尖衰老，產生細胞程序性死亡。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的調控細胞程序性死亡的花生衰老基因AhSAG，提供一種有助于調控植物細胞對環(huán)境變化的適應力以及維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和合成能力的方法，為植物增產增收創(chuàng)造條件。圖I:為AhSAG基因ORF的堿基序列圖；圖2:為AhSAG基因ORF的蛋白氨基酸序列圖；圖3:為PCR擴增AhSAG基因中間片斷電泳圖譜；M為033Imaker，I為陰性對照，2為AhSAG中間片段；圖4:為PCR擴增AhSAG基因3’race電泳圖譜；MS0331maker，I為AhSAG3’race，2為陰性對照；圖5:為PCR擴增AhSAG基因5’race電泳圖譜；M為0331maker，I為其它的實驗圖片，2為AhSAG5，race；圖6:為PCR擴增AhSAG基因全長cDNA電泳圖譜；M為033Imaker，I為陰性對照，2為陰性對照，3為AhSAG全長基因；圖7:為AhSAG在NCBI上氨基酸序列同源性分析；圖8:為正義植物表達載體pBI121-GFP-AhSAG和反義植物表達載體pBI121-GFP-anti-AhSAG的酶切驗證；M為Maker，I為pBI121-GFP_AhSAG/BamHI和XbaI,2為pBI121-GFP-anti-AhSAG/BamHI和XbaII;圖9:為AhSAG基因在不同鋁處理條件下的表達差異圖；圖10:為轉AhSAG基因煙草形態(tài)，另提供其彩圖為實質審查參考資料；A為未轉基因的煙草，B為轉反義AhSAG煙草，C為轉正義AhSAG煙草；圖11:為轉AhSAG正反義基因煙草植株的PCR檢測電泳圖譜；M為MakerDL-2000，I為陰性對照，2-3為EHA105/pBI121-GFP_AhSAG，4-5為EHA105/pBI121-GFP-anti-AhSAG.；圖12:為轉基因煙草中AhSAG基因的熒光定位圖譜;A為未轉基因煙草的根尖，B為轉正義AhSAG基因煙草的根尖，C為轉反義AhSAG基因煙草的根尖，D為未轉基因煙草嫩葉葉表皮細胞熒光圖，E為轉正義AhSAG基因煙草嫩葉表皮細胞熒光圖，F(xiàn)為轉反義AhSAG基因煙草嫩葉表皮細胞熒光圖；圖13:為轉基因煙草根尖細胞在鋁處理下GFP表達；A、E為未轉基因煙草的根尖熒光圖，B-D為轉正義AhSAG基因煙草根尖細胞在不同的鋁濃度下GFP表達，F(xiàn)-H轉反義AhSAG基因煙草根尖細胞在不同的鋁濃度下GFP表達，B、F為30iimol/LAlCl3，C、G為90umol/LAlCl3，D、H為150umol/LAlCl3(均為pH4.24.3處理24h)。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實施方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施準備I、所用花生品種耐招花生品種99-1507和招敏感品種中花2號。2、將供試花生種子置于粗沙中26°C催芽4d，催好芽的花生去掉種皮，Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2d更換一次營養(yǎng)液。花生幼苗抽出第二片真葉后，在含有0.5mmol/L的CaCl2(pH4.24.3)的溶液中預處理24h。3、選擇0(陰性對照)、20(低濃度處理，兩者均不發(fā)生PCD)、100(只有中花2號發(fā)生PCD),400umoI/L鋁處理(兩者均發(fā)生PCD)處理4d，用DNALadder和TUNEL來檢驗PCD發(fā)生情況。4、研究中使用到的菌株、質粒見表I。表I:本工作中使用的質粒和菌株權利要求1.一種調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列，其特征在于從花生根尖提取RNA得到衰老基因其ORF編碼序列為474bp，編碼157aa的cDNA序列，其堿基序列如SEQIDNO.I所示。2.根據權利要求I所述的調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列，其特征在于所述來源于鋁誘導花生根尖發(fā)生細胞程序性死亡的花生根尖分生組織。3.根據權利要求I所述的調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列，其特征在于所述的編碼氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根據權利要求I或3所述的調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列，其特征在于所述是衰老誘導增強型基因，在濃度小于20μmol/LAl處理時基因在花生耐鋁性品種和鋁敏感品種中的表達很低；濃度在2(Γ100μmol/LAl處理時，AhSAG基因表達量顯著升高，鋁敏感品種表達量高于耐鋁性品種表達量；在濃度lOOlOOymol/LAl處理時，AhSAG超表達，耐鋁性品種和鋁敏感品種均出現(xiàn)細胞程序性死亡現(xiàn)象，促進植物早衰。5.一種包含權利要求I或3所述的調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼蛋白序列的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是通過將基因導入載體PBI121-GFP得到。6.根據權利要求5所述的包含調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為正義載體或反義載體，是利用正義引物或反義引物通過PCR擴增基因然后克隆到載體PTG19-T上，經過酶切后導入載體PBI121-GFP中而得到，用于植物的正義植物表達載體pBI121-GFPjAS^，反義植物表達載體pBI121-GFP-a/ii經驗證序列正確，用于植物遺傳轉化，進行基因功能鑒定;所述的正義引物是上游GCTCTAGAATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGXbaI位點下游TGCGGATCCCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACBam^I位點所述的反義引物是上游TTGCGGATCCATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGBamHI位點下游GGCGTCTAGACTAGTCCGACTTTGTGAAATGACXbaI位點。7.一種包含權利要求5或6所述的調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列的重組表達載體的重組菌，其特征在于所述重組菌是通過正義植物表達載體和反義植物表達載體導入根癌農桿菌菌株EHA105得到，在異源真核系統(tǒng)中實現(xiàn)功能性表達。8.一種包含權利要求7所述的重組菌的轉基因植株的應用，其特征在于所述轉基因植株是將重組的含GFP的正義和反義花生衰老基因導入煙草中而得到煙草轉基因植株。9.根據權利要求8所述的轉基因植株的應用，其特征在于所述煙草轉基因植株的測定是通過熒光顯微鏡觀察轉化煙草的綠色熒光蛋白基因的表達，確定在煙草中的表達和定位，在幼嫩的根尖、根的中柱和莖的形成層組織里表達的比較多，而且只在細胞壁和細胞膜中表達。10.根據權利要求8所述的轉基因植株的應用，其特征在于所述煙草轉基因植株鋁處理下GFP表達，是鋁處理誘導花生衰老基因AASAG的表達，鋁濃度越高表達越強烈，且在相同的鋁濃度下，轉正義基因的煙草比轉反義基因煙草的表達要多，說明鋁脅迫下，煙草根尖正義衰老基因表達增強，而衰老基因的表達加快根尖衰老，產生細胞程序性死亡。全文摘要本發(fā)明公開了一種調控細胞程序性死亡的花生衰老基因及編碼序列與應用，從花生根尖提取RNA，克隆到花生衰老基因AhSAG，其ORF為編碼序列474bp，編碼157aa的cDNA序列；AhSAG來源于鋁誘導花生根尖發(fā)生細胞程序性死亡的花生根尖分生組織，它是衰老誘導增強型基因，誘導激活促進植物早衰。本發(fā)明提供的花生衰老基因可以在煙草中表達，可用于調控植物細胞對環(huán)境變化的適應力以及維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和合成能力。文檔編號C07K14/415GK102660555SQ20121013454公開日2012年9月12日申請日期2012年5月3日優(yōu)先權日2012年5月3日發(fā)明者何虎翼,何龍飛,王天菊,詹潔申請人:廣西大學