專(zhuān)利名稱(chēng)：海洋原索動(dòng)物文昌魚(yú)抗衰老相關(guān)的鐵蛋白新基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋動(dòng)物抗衰老相關(guān)基因領(lǐng)域，特別是關(guān)于海洋原索動(dòng)物文昌魚(yú)的鐵蛋白基因序列及功能蛋白質(zhì)。
衰老是人類(lèi)一直所關(guān)注的重大問(wèn)題，延緩衰老、延長(zhǎng)壽命是人類(lèi)的共同愿望，尋找抗衰老藥物也是科學(xué)工作者的不斷追求。海洋生物是本世紀(jì)人們研究開(kāi)發(fā)的重要藥物資源。海洋蘊(yùn)藏著地球上80％以上的生物物種，為了適應(yīng)其變化多端的生存環(huán)境(如高壓、高滲、低溫等)，優(yōu)勝劣汰的競(jìng)爭(zhēng)使海洋生物形成了特殊的身體結(jié)構(gòu)和奇妙的生理功能，為人類(lèi)提供了許多具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的生理功能的活性物質(zhì)及其基因。這些活性物質(zhì)可以廣泛地應(yīng)用于包括抗腫瘤與抗病毒藥物、心血管藥物以及抗衰老藥物等。我國(guó)近年來(lái)雖然在海洋藥物的開(kāi)發(fā)方面取得了一定的成果，但主要還是停留在用化學(xué)方法提取活性物質(zhì)上。生化提取的方法難以得到可以藥用的單體，對(duì)于藥用的單體也因?yàn)椴荒艿玫桨被岬娜蛄卸鵁o(wú)法成為新藥進(jìn)行報(bào)批。另外，生化提取需要消耗大量的海洋資源，而有些資源不能重復(fù)收集，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；同時(shí)，也不利于實(shí)施海洋生物資源可持續(xù)性開(kāi)發(fā)利用的發(fā)展戰(zhàn)略。而利用基因工程技術(shù)，直接從基因入手，開(kāi)展生物基因組研究，將有效解決這一制約因素。同時(shí)，還可以保存珍稀海洋生物的基因資源。
在新技術(shù)的推動(dòng)下，國(guó)際上對(duì)功能基因組的研究已全面展開(kāi)，通過(guò)“定位克隆”和“定位候選克隆”等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一大批重要人類(lèi)疾病的致病基因和相關(guān)基因。相比之下，對(duì)于占地球生物80％以上種類(lèi)的海洋生物的基因組研究尤其是功能基因組研究卻還沒(méi)有系統(tǒng)展開(kāi)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)。目前在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上已登記的核酸序列中，海洋生物占的比例不足5％。
原索動(dòng)物僅存在于海洋中，是海洋中特有的動(dòng)物，它包括頭索動(dòng)物(文昌魚(yú))和尾索動(dòng)物(海鞘)兩個(gè)亞門(mén)。其中，頭索動(dòng)物文昌魚(yú)雖然在世界各大海區(qū)都有分布，但分布范圍僅限于極少數(shù)很小地區(qū)。相比之下，我國(guó)青島和廈門(mén)等地文昌魚(yú)不但數(shù)量較多，而且世界著名。文昌魚(yú)富含碘、不飽和脂肪酸和氨基酸，美味可口，曾經(jīng)是我國(guó)福建沿海居民非常喜歡的佳肴。但是，近年來(lái)，由于環(huán)境污染和變遷，文昌魚(yú)種群正在減少，已被我國(guó)列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。
據(jù)認(rèn)為文昌魚(yú)是動(dòng)物界唯一不生長(zhǎng)寄生蟲(chóng)的動(dòng)物。因此我們推測(cè)文昌魚(yú)體內(nèi)可能含有特有的有價(jià)值的基因資源，通過(guò)尋找這些基因可為獲得有應(yīng)用前景的基因工程產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。新近，我們從文昌魚(yú)中克隆到了鐵蛋白(ferritin)基因。人體內(nèi)的鐵和鐵蛋白有機(jī)結(jié)合在一起，能被人體直接吸收和利用，不僅大大提高了人體對(duì)鐵的吸收和利用，還避免了不被人體吸收的鐵對(duì)人體的毒副作用。更重要的是，鐵蛋白能促進(jìn)胎兒智力、體力、免疫力、神經(jīng)系統(tǒng)和整體器官的生長(zhǎng)發(fā)育，還能自然地調(diào)節(jié)血液營(yíng)養(yǎng)成份，增強(qiáng)血液攜氧能力，提高人體運(yùn)動(dòng)機(jī)能和耐久力，消除疲勞、減少乳酸的形成、減少抽筋，增強(qiáng)競(jìng)技能力；同時(shí)，它還能消除血液中的毒素，提高血液質(zhì)量，增強(qiáng)體質(zhì)和抗病能力，提高智力和記憶力、抗衰老、美化肌膚。
為此，本發(fā)明目的是克隆文昌魚(yú)鐵蛋白基因，測(cè)定其基因序列，為獲得基因工程產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明從海洋特有原索動(dòng)物文昌魚(yú)腸提取總RNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，大規(guī)?？寺y(cè)序后運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定文昌魚(yú)鐵蛋白EST片段，進(jìn)而獲取其全長(zhǎng)，分析測(cè)定基因的全序列，研究其特性。
1.總RNA的獲取成體青島文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)采集于青島沙子口附近的海域。將文昌魚(yú)飼養(yǎng)于滅菌的過(guò)濾海水中，三天之內(nèi)不投喂任何餌料，使之排空消化道內(nèi)的食物。在解剖鏡下小心地分離出文昌魚(yú)的消化道，用含有100mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH 7.0)漂洗三次，然后用液氮速凍，保存于液氮內(nèi)。用TRIZOL試劑(GIBCO-BRL)一步法提取文昌魚(yú)消化道總RNA。
2.cDNA的合成運(yùn)用SMARTTMcDNA合成技術(shù)合成文昌魚(yú)腸cDNA。該技術(shù)利用真核生物mRNA 5’端的甲基化G(m7G)和5’-5’三磷酸鍵連接的特殊帽子結(jié)構(gòu)以及3’端的PolyA尾的特點(diǎn)設(shè)計(jì)錨定引物，進(jìn)行第一鏈的合成，可起到富集全長(zhǎng)cDNA的作用。然后用LD PCR法擴(kuò)增第二鏈cDNA。蛋白酶K消化后，再用Sfi I酶消化，然后用SMARTTM文庫(kù)構(gòu)建試劑盒提供的CHROMA SPIN-400分離不同大小的dscDNA。
3.載體質(zhì)粒pcDNA3-SfiI的構(gòu)建
pcDNA3-Sfi I載體由哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3載體改造而來(lái)，在EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入了Sfi I的酶切位點(diǎn)(見(jiàn)附圖2)。具體方法為PEG純化法提取pcDNA3.0質(zhì)粒，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和NotI作用后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收上述酶切載體DNA。為引入SfiI酶切位點(diǎn)，以λTripIEx2為模板，用SMARTTMKit中測(cè)序引物擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI酶切，T4 DNA Ligase連接經(jīng)EcoRI和NotI酶切的pcDNA3.0載體DNA和PCR產(chǎn)物構(gòu)建成pcDNA3-SfiI質(zhì)粒。提取pcDNA3-SfiI用SfiI酶切后，膠回收；重復(fù)SfiI酶切和回收操作各一次，載體DNA以50ng/nl的濃度保存?zhèn)溆谩?br> 4.dscDNA與載體的連接5.大腸桿菌超級(jí)感受態(tài)的制備將大腸桿菌E.coli DH5α涂布于不含抗生素的LB培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜。挑取2-3個(gè)E.coli DH5α大菌落接種于50ml SOC培養(yǎng)基中，在250ml三角瓶中18℃搖至A600＝0.6，搖速200-250rpm，約需36-48小時(shí)；將三角瓶置于冰浴10min，將菌液移至50ml離心管中，2500g，10min，4℃；菌體用16ml冰預(yù)冷的TB溶液重懸，置于冰浴10min；2500g，10min，4℃離心；菌體用4ml冰預(yù)冷TB重懸，加280μl DMSO；菌液于冰裕10min后，分裝到凍存管，每管200μl，液氮冷卻，約半小時(shí)后，保存于-40℃。48hr內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率不變，用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。
6.用制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后篩選文昌魚(yú)腸cDNA文庫(kù)陽(yáng)性克隆并用PCR進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)的引物為測(cè)序通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGGA-3′)和SP6(5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′)。
7.克隆的序列測(cè)定與分析我們應(yīng)用SMARTTMcDNA Library Construction技術(shù)構(gòu)建的海洋生物文昌魚(yú)的cDNA文庫(kù)，與其它c(diǎn)DNA文庫(kù)構(gòu)建方法比較，本研究方法具有只需微量的RNA樣品，可直接從總RNA出發(fā)合成cDNA及通過(guò)LD PCR方法富集全長(zhǎng)cDNA片段等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，還可通過(guò)常規(guī)電泳對(duì)每一步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。因此特別適合于珍貴稀少的海洋生物組織材料的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。另外，在cDNA過(guò)柱時(shí)，收集分子量較大的前幾管用來(lái)連接；雖然文庫(kù)重組子總數(shù)有所下降，但可提高全長(zhǎng)cDNA克隆比例，減少篩選的工作量，不失為一個(gè)文庫(kù)構(gòu)建的質(zhì)量?jī)?yōu)化方法。
本發(fā)明對(duì)陽(yáng)性克隆用ABI PRISM 377XL DNA測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。正向引物為T(mén)7引物，反向引物為SP6引物。序列用DNATOOL軟件進(jìn)行初步的編碼可能性分析，然后經(jīng)NCBI BLAST程序與已知的核酸序列進(jìn)行初步的比較，尋找同源基因的存在。我們得到了兩個(gè)編碼鐵蛋白(ferritin)的全長(zhǎng)cDNA，我們認(rèn)為其中一個(gè)是另一個(gè)的突變體，分別以F1(附圖3)和F2(附圖4)表示。F1基因長(zhǎng)為1038bp，它的3’非翻譯區(qū)長(zhǎng)達(dá)403bp，在poly A序列上游有1個(gè)加尾信號(hào)序列AATAAA；F1 cDNA閱讀編碼框編碼172個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列分析表明，F(xiàn)1蛋白與哺乳動(dòng)物牛鐵蛋白以及螨蟲(chóng)鐵蛋白高度同源(76％)。同時(shí)，通過(guò)PIRPattern Match(http//www-nbrf.georgetown.edu/pirwww/search/patmatch.html)對(duì)PROSITE database的搜索結(jié)果表明，文昌魚(yú)F1蛋白的氨基酸序列中存在ferritin iron-binding regions signature 1，位置為59-77(EEREHAEKLMKYQNMRGGR)，這說(shuō)明了F1 cDNA編碼一個(gè)新的鐵蛋白基因。F1和F2的顯著差別在于F2的C末端少了38個(gè)氨基酸殘基，故F2 cDNA長(zhǎng)為970bp，閱讀編碼框只編碼134個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)文昌魚(yú)是海洋中的珍稀原索動(dòng)物，據(jù)認(rèn)為是動(dòng)物界唯一不生長(zhǎng)寄生蟲(chóng)的動(dòng)物，因此從文昌魚(yú)中可望開(kāi)發(fā)具有抗菌、抗氧化的基因工程新產(chǎn)品。本發(fā)明克隆得到文昌魚(yú)鐵蛋白基因并測(cè)定其序列，為今后開(kāi)發(fā)研制基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了良好的條件。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述


圖1總RNA變性膠電泳2載體pcDNA3-SfiI的構(gòu)建圖3F1基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；圖4F2基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；圖5F1與F2蛋白的氨基酸序列Alignment比較結(jié)果。
實(shí)施例1文昌魚(yú)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1.總RNA的提取用TRIZOL試劑(GIBCO-BRL)提取文昌魚(yú)消化道總RNA。提取總RNA過(guò)程中的所有器皿均用DEPC處理并經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理。
(1)按50-100mg文昌魚(yú)組織/每毫升TRIZOL試劑的比例，將腸組織加入TRIZOL試劑，在低溫下用勻漿器進(jìn)行勻漿。
(2)于4℃12000g離心10分鐘，取上清，棄去不溶解的組織碎片。
(3)于室溫下靜置溫育5分鐘，以促進(jìn)核蛋白復(fù)合體的解離。按每毫升TRIZOL試劑加入0.2毫升氯仿的比例加入氯仿，室溫下劇烈搖動(dòng)15秒，室溫溫育3分鐘。于4℃12000g離心15分鐘。離心后，混合物分為三相下層紅色的氯仿相，上層無(wú)色的水相以及中間相。
(4)小心將上層無(wú)色的水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中，按每毫升TRIZOL試劑加入0.5ml異丙醇的比例，加入異丙醇。于室溫溫育10分鐘。于4℃12000g離心10分鐘。
(5)棄上清，加入1ml 75％乙醇，用渦旋振蕩器振蕩混勻。于4℃7500g離心5分鐘，棄上清。
(6)室溫風(fēng)干RNA沉淀，用不含RNA酶的滅菌水(DEPC處理的)溶解RNA，55-60℃溫育10分鐘。電泳檢測(cè)(見(jiàn)圖1)。
2.pcDNA3-SfiI載體的構(gòu)建pcDNA3-Sfi I載體由哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3載體改造而來(lái)。在EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入了Sfi I的酶切位點(diǎn)。具體為PEG純化法提取pcDNA3.0質(zhì)粒，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和NotI作用后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。按OMAGA BIOTEK公司的GEL EXTRACTION KIT說(shuō)明書(shū)操作，膠回收上述酶切載體DNA。為引入SfiI酶切位點(diǎn)，以λTripIEx2為模板，用SMARTTMKit中測(cè)序引物擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI酶切，T4 DNA Ligase連接經(jīng)EcoRI和NotI酶切的pcDNA3.0載體DNA和PCR產(chǎn)物構(gòu)建成pcDNA3-SfiI質(zhì)粒。提取pcDNA3-SfiI用SfiI酶切后，膠回收同上；重復(fù)SfiI酶切和回收操作各一次，載體DNA以50ng/nl的濃度保存?zhèn)溆谩?見(jiàn)圖2)。
3.文昌魚(yú)腸cDNA文庫(kù)陽(yáng)性克隆的篩選挑取單克隆，接種于兩只含有0.5ml LB(Amp+)培養(yǎng)基的Eppendorf管中，37℃，225rpm培養(yǎng)過(guò)夜。在其中一管菌液中加入等體積滅菌的50％甘油，于-20℃保存；另一管用于PCR檢測(cè)。具體為PCR反應(yīng)的引物為測(cè)序通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTAT AGGGA-3′)和SP6(5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′)。
PCR反應(yīng)體系滅菌去離子水 20.4μlTaq酶Buffer(10×) 2.5μldNTP(10mM each)0.25μlBSA(購(gòu)自Promega公司，100×)0.25μl引物T7(40μM) 0.25μl引物SP6(40μM) 0.25μl模板(文昌魚(yú)胚胎mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物) 1.0μlTaqDNA聚合酶(Promega公司產(chǎn)品，2.5U/μl)0.5μl總反應(yīng)體積 25μlPCR反應(yīng)條件預(yù)變性95℃，2分鐘，循環(huán)1次。
變性94℃，40秒；退火58℃，30秒；延伸72℃，2分鐘；保溫72℃，10分鐘。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢查PCR產(chǎn)物的大小。
實(shí)施例2文昌魚(yú)鐵蛋白基因鑒定本發(fā)明通過(guò)對(duì)海洋原索動(dòng)物文昌魚(yú)腸cDNA文庫(kù)的克隆測(cè)序，得到了兩個(gè)編碼鐵蛋白(ferritin)的全長(zhǎng)cDNA(分別以F1和F2表示)，我們認(rèn)為其中一個(gè)是另一個(gè)的突變體。F1基因長(zhǎng)為1038bp，它的3’非翻譯區(qū)長(zhǎng)達(dá)403bp，在poly A序列上游有1個(gè)加尾信號(hào)序列AATAAA；F1 cDNA閱讀編碼框編碼172個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列分析表明，F(xiàn)1蛋白與牛鐵蛋白以及螨蟲(chóng)鐵蛋白高度同源(76％)。同時(shí)，通過(guò)PIR Pattern Match(http//www-nbrf.georgetown.edu/pirwww/search/patmatch.html)對(duì)PROSITE database的搜索結(jié)果表明，文昌魚(yú)F1蛋白的氨基酸序列中存在ferritin iron-binding regions signature 1，位置為59-77(EEREHAEKLMKYQNMRGGR)，這說(shuō)明了Fl cDNA編碼一個(gè)新的鐵蛋白基因。F1和F2的顯著差別在于F2的C末端少了38個(gè)氨基酸殘基，故F2 cDNA長(zhǎng)為970bp，閱讀編碼框只編碼134個(gè)氨基酸殘基；不過(guò)，它們之間除了其C末端幾個(gè)氨基酸殘基有差異外，其它的序列則完全一致。F1基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)圖3；F2基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)圖4；圖5示F1與F2蛋白的氨基酸序列Alignment比較結(jié)果。
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權(quán)利要求
1.一種編碼海洋原索動(dòng)物文昌魚(yú)鐵蛋白的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸具有如SEQ ID No.1所示的序列。
2.由權(quán)利要求1所述的核苷酸所編碼的文昌魚(yú)鐵蛋白。
3.權(quán)利要求2所述的文昌魚(yú)鐵蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的文昌魚(yú)鐵蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸具有如SEQ IDNo.3所示天然基因突變體的DNA核苷酸序列。
5.由權(quán)利要求4所述的天然基因突變體核苷酸所編碼的文昌魚(yú)鐵蛋白。
6.權(quán)利要求5所述的文昌魚(yú)鐵蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
7.以pcDNA3載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的pcDNA3-SfiI表達(dá)載體，其特征在于在多克隆位點(diǎn)區(qū)插入了一段序列，該序列具有SfiI酶切位點(diǎn)。
全文摘要
從海洋特有原索動(dòng)物文昌魚(yú)中克隆得到抗衰老相關(guān)的鐵蛋白新基因。本發(fā)明描述了該新基因的全長(zhǎng)cDNA序列及功能蛋白質(zhì)。從文昌魚(yú)成體腸中抽提總RNA，應(yīng)用SMART
文檔編號(hào)C12N15/63GK1818062SQ20051000726
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月7日
發(fā)明者梁惠, 張士璀, 劉振輝, 李紅巖, 郭華榮 申請(qǐng)人:梁惠, 張士璀, 劉振輝