專利名稱：一種elp融合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種ELP融合蛋白及其應用。
背景技術：
隨著大規(guī)模測序技術發(fā)展和廣泛應用，人類基因組計劃及其他物種包括海 膽、斑馬魚、文昌魚等基因組計劃也相繼完成。對這些物種的基因組測序的直 接結果是產生成千上萬個基因，對這些基因功能的闡明，有助于我們了解物種 在進化過程的位置；對導致疾病的基因的研究有助于了解發(fā)病機理，尋找治療 的乾點，開發(fā)治療相應治療藥物；同時，大量的藥物蛋白基因也有待我們去研 究其生理活性，及作用靶點，為開發(fā)新型的治療藥物提供基礎。基因功能研究 的方法很多，包括基因敲除技術，蛋白組學的研究，RNA干擾等。其中一個最 直接的研究方法是把所研究的基因進行重組表達，獲得相應的蛋白后進行生理 和生化活性的研究和對其進行結構生物學的分析從而闡明其功能。由于物種基 因的差異性，并不是所有的基因都能成功地表達?；虿槐磉_，蛋白表達量低 或表達的蛋白不穩(wěn)定形成不可溶的包涵體，這些現(xiàn)象在異源表達系統(tǒng)中經常出 現(xiàn)，特別在原核表達系統(tǒng)中表達真核生物基因。隨著DNA重組技術的發(fā)展，可 以將目的基因與表達親和標簽的基因進行融合，然后克隆在表達載體中進行融 合表達，這些親和標簽不但可以幫助所融合的目的蛋白折疊，提高目的蛋白的 可溶性和表達量，同時親和標簽能與相應的親和層析的樹脂結合，起到一步純 化融合蛋白的作用。常用的親和純化標簽包括谷胱甘肽-S-轉移酶 (Glutathione-S-Transfemse， GST),麥芽糖結合蛋白(Maltose-binding Protein, MBP)， His標簽等。最后利用蛋白酶對含有相應蛋白酶酶切位點的融合蛋白進 行切割，使目的蛋白與親和標簽蛋白分離開，通過進一步的層析分離除去親和標簽和蛋白酶而獲得目的蛋白。
親和層析是一種非常有效的分離方法，在不需要了解所融合蛋白的物化性 質的情況，就可以實現(xiàn)一步純化融合蛋白,這種純化技術被廣泛應用。但是，應 用親和層析分離技術需要昂貴的親和樹脂，和相應的純化設備，這樣限制了同
時表達多種蛋白用于高通量的結構生物學研究和高通量的藥物蛋白篩選。1999 年，報道了一個熱敏感的純化標簽彈性蛋白樣多肽(Elastin Like Polypeptides, ELP)，這個標簽起源于彈性蛋白的重復的五肽"Val-Pro-Gly-Val-Gly"。 ELP可以 經歷一個可逆相變過程，稱為反溫度相變(Inverse Temperature Transition)。當 溫度低于相變溫度(Transition temperature, Tt)時，ELP在液相表J見出高度可;容， 然而當溫度高于Tt時，親水的ELP則會脫水而發(fā)生凝集，而且ELP融合蛋白 也具有這種特性，但是需要指出的是發(fā)生相變的時候只是ELP發(fā)生凝結而所融 合的外源蛋白并沒有發(fā)生變性或沉淀。利用ELP的這種特性，可以方便和快速 地利用ELP標簽來純化ELP融合蛋白，而且純化過程中不需要層析分離而避免 了昂貴的親和樹脂和純化設備，同時ELP融合蛋白的濃縮和更換緩沖液也變得 非常簡單。通過加熱或提高鹽離子濃度觸發(fā)ELP融合蛋白的凝集，通過離心使 ELP融合蛋白于表達宿主蛋白中分離出來，用低鹽低溫的溶液使沉淀的ELP融 合蛋白重新溶解，再進行離心除去不可溶的蛋白而獲得ELP融合蛋白，通過重 復觸發(fā)沉淀、離心和重溶步驟可以獲得更純的ELP融合蛋白，這種純化過程稱 之為逆相循環(huán)(Inverse Transition Cycling, ITC )。
酶是高效、專一性強的生物催化劑。生物體內的各種化學反應都是在酶催 化下進行的，但是自由酶在水溶液中很不穩(wěn)定，可溶性酶一般只能一次性地起 催化作用，同時，酶是蛋白質對熱、高離子濃度、強酸、強堿及部分有機溶劑 等均不夠穩(wěn)定，容易失活而降低其催化能力，這些不足大大限制了酶促反應的 廣泛應用。上世紀60年4<出現(xiàn)的固定4b酶才支術(Immobilized enzyme technology) 克服了自由酶的上迷不足，并且酶可以回收及重復使用，從而成為生物技術中 最為活躍的研究領域之一。酶(細胞)的固定化方法可大致分為吸附法、共4介偶聯(lián) 法、交聯(lián)法和包埋法等4種。吸附法是指通過載體表面和酶表面間的次級鍵相互作用而達到酶固定化的方法，根據(jù)吸附劑的特點又可分為物理吸附和離子交換吸附。該法具有操作簡便、條件溫和及吸附劑可反復使用等優(yōu)點，但也存在吸附力弱，易在不適pH、高鹽濃度、高底物濃度及高溫條件下解吸脫落的缺點。共價偶聯(lián)法是將酶的活性非必須側鏈基團與載體的功能基通過共價鍵結合，故表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，有利于酶的連續(xù)使用，是目前應用和研究最為活躍的一類酶固定化方法，但共價偶聯(lián)反應容易使酶變性而失活。交聯(lián)法是利用雙功能或多功能基團試劑在酶分子之間交聯(lián)架橋固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括網格包埋、微嚢型包埋和脂質體包埋等，包埋法中因酶本身不參與化學結合反應，故可獲得較高的酶活力回收，其缺點是不適用于高分子量底物的傳質和用于柱反應系統(tǒng)，且常有擴散限制等問題。而且固定化酶費用太高，大分子的底物不易使用。上述各種固定化酶的方法所表現(xiàn)出的不足之處限制了其廣泛應用。

發(fā)明內容
基于上述理論的基礎上，本發(fā)明的一個目的是提供一種無標簽的重組蛋白
的表達純化的方法，包括如下步驟
(1 )連接目標蛋白基因與含有ELP的融合伴侶的基因成為融合蛋白基因，并表達得到融合蛋白A，其中所述融合蛋白A在所述ELP與所述含有ELP的融合伴侶的連接處至少有 一個蛋白酶酶切位點；
(2 )將步驟(1 )得到的融合蛋白A與一種含有ELP的融合蛋白酶B混合，所述的融合蛋白酶B能作用于融合蛋白A的酶切位點，但不作用于自身；
(3) 讓步驟(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶B將融合蛋白A降解成為含ELP的融合伴侶和目標蛋白；
(4) 改變步驟(3)的混合溶液的溫度、鹽離子濃度或pH中的至少一個條件，待出現(xiàn)聚集體后，離心，取上清溶液即為純化的目標蛋白。
上述的ELP的單體的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。
上述的ELP為ELP單體的四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九聚體。
上述的融合蛋白酶B包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-relatedmodifier)蛋白酶
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種無標簽的重組蛋白，其是通過以下方法得到的
(1 )連接目標蛋白基因與含有ELP的融合伴侶的基因成為融合蛋白基因，并表達得到融合蛋白C，其中所述融合蛋白C在所述ELP與所述含有ELP的融合伴侶的連接處至少有一個蛋白酶酶切位點；
(2 )將步驟(1 )得到的融合蛋白C與 一種含有ELP的融合蛋白酶D混合，所述的融合蛋白酶D能作用于融合蛋白C的酶切位點，但不作用于自身；
(3) 讓步驟(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶D將融合蛋白C降解成為含ELP的融合伴侶和目標蛋白；
(4) 改變步驟(3)的混合溶液的溫度、鹽離子濃度或pH中的至少一個條件，待出現(xiàn)聚集體后，離心，取上清溶液即為純化的目標蛋白。
ELP的融合伴侶是指在融合蛋白中，除了目標蛋白之外，含ELP的蛋白。上述的ELP的單體的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。上述的ELP為ELP單體的四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九聚體。
上述融合蛋白酶D包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-relatedmodifier)蛋白酶。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種含ELP的融合蛋白，所述融合蛋白包括彈性蛋白樣多肽(ELP)和至少一種目的蛋白或多肽，所迷目的蛋白或多肽能以與ELP形成的融合蛋白的形式進行表達，所述融合蛋白能在不同的溫度、不同的鹽離子濃度或不同的pH值中的至少一個不同的條件下處于溶解或沉淀狀態(tài)，并且所述融合蛋白能通過調節(jié)溫度、鹽離子濃度或pH值得以純化。上述的彈性蛋白樣多肽的單體的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。上述的彈性蛋白樣多肽包括單體的四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九聚體。
本發(fā)明的第四個目的在于提供一種表達純化含ELP的融合蛋白的方法，包括如下步驟
(1 )連接目標蛋白基因與含有ELP的融合伴侶的基因成為融合蛋白基因，并表達得到融合蛋白E;
(2 )改變步驟(1 )得到的融合蛋白E所處的溫度、鹽離子濃度或pH值中的至少一個條件，待出現(xiàn)聚集體后，離心，所得聚體體即為含ELP的融合蛋白。所述的ELP的單體的核苷酸序列如SEQ IDNO.l所示。所述的ELP為ELP單體的四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九聚體。
所述融合蛋白酶E包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-relatedmodifier)蛋白酶。
本發(fā)明的第五個目的在于提供一種用于蛋白表達純化的試劑盒，所述試劑盒包括含ELP的質粒，所述含ELP的質粒用于制備融合蛋白F和融合蛋白G,所述融合蛋白G含有目標蛋白或多肽，所述融合蛋白F能將所述融合蛋白G通過酶切，得到目標蛋白或多肽。
所述融合蛋白F包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-related modifier)蛋白酶。
所述融合蛋白F能將所述融合蛋白G酶切為ELP和目標蛋白。本發(fā)明的第六個目的在于，提供一種具有固定化酶特性的可循環(huán)利用的酶，
所述酶為包含ELP的融合蛋白酶，所述ELP能根據(jù)溫度或鹽離子濃度處于溶解
或沉淀狀態(tài)。
所述的ELP的單體的核苷酸序列如SEQ IDNO.l所示。所述的ELP為ELP單體的四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九聚體。
所述融合蛋白酶包括ELP-3C或ELP-SUMO (small ubiquitin-related modifier)
蛋白酶。本發(fā)明的第七個目的在于提供一種利用包含ELP的蛋白酶進行循環(huán)酶切純
化的方法，包括如下步驟
(1)將融合蛋白與底物混合，進行酶切反應；
(2 )調整酶切反應后的溶液的溫度或鹽離子濃度，待出現(xiàn)聚集體后離心； (3)將離心后得到的聚集體加入酶解液，待其溶解后，加入底物，進行 酶切反應，重復步驟(2)。
所述步驟(1)中的底物是含目標蛋白的ELP融合蛋白。
人工合成的ELP的單體是五肽"Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，， ( Xaa是除了 pro氨基酸 的任意氨基酸)，在本發(fā)明中，ELP包含了ELP單體的四聚體、五聚體、六聚體、 七聚體、八聚體、九聚體等各種類型，改變ELP或含ELP的融合蛋白所處的條件， 包括溫度、鹽離子濃度、pH值中的至少任一種條件，ELP或含ELP的融合蛋白能 出現(xiàn)沉淀或溶解的不同狀態(tài)，且回復原來的條件時，ELP或含ELP的融合蛋白又 能回復到原來的狀態(tài)。
在本發(fā)明中，具體是在本發(fā)明中所述的表達純化的目的蛋白的方法、無標 簽的重組蛋白、利用包含ELP的蛋白酶進行循環(huán)酶切純化中所涉及的目的蛋白 包括了較為廣泛的蛋白，具體包括病毒蛋白、細菌蛋白、酵母的表達蛋白，哺 乳動物的蛋白等等。
本發(fā)明中ELP-3C和ELP-SUMO只是兩個特例，當然不限制于這兩種，只 要具有酶切活性的酶蛋白都包含在本發(fā)明的范圍之內。這些具有酶切活性的蛋 白酶能作用于含相應酶切位點的含ELP的融合蛋白上，從而將其底物切割為目的 蛋白和ELP融合伴侶；并且這些酶切融合蛋白不能作用于自身。所述ELP融合伴 侶是指含ELP的除了目標蛋白之外的蛋白，ELP融合伴侶與目標蛋白之間有酶切 位點，能被酶切為目標蛋白和ELP融合伴侶。
本發(fā)明中所涉及到的表達載體具有一般意義，即是指含有啟動子順序，能 有效地促使插入的目基因進行轉錄，進而翻譯出該插入基因編碼的蛋白產物的 載體。表達載體的啟動子通常與其受體同源，如以大腸桿菌為受體的表達載體, 其啟動子來源于大腸桿菌系統(tǒng)，在痘苗病毒中表達的啟動子則來源于痘苗病毒。載體主要是質粒也可以是病毒，包括植物病毒、動物病毒、噬菌體，常用
的有以大腸桿菌為宿主的質粒載體，如pQE、 pMAL、 pUC等以及入噬菌體和 大腸桿菌人工染色體(BAC),以酵母菌為宿主的酵母菌人工染色體(YAC)和 pRS系列酵母質粒載體，以哺乳動物細胞(動物/大腸桿菌穿4炎質粒)為宿主的 pcDNA系列質粒和pEGFP系列質粒。
原核表達載體通常為質粒，典型的表達載體具有以下幾種元件選擇標志 的編碼序列、可控轉錄的啟動子、轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)、 一個多限制酶切位點接頭和宿主體內自主復制的序列。pET系統(tǒng)是在E.coli中克 隆表達重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到pET質粒載體上，受噬 菌體T7強轉錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7 RNA聚合酶 誘導。該系統(tǒng)的在非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄。 用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，可避免因目的蛋白對宿主細胞的 可能毒性造成的質粒不穩(wěn)定。如果用非表達型宿主細胞克隆，可以通過兩種方 法啟動目的蛋白的表達用帶有受入pL和pl啟動子控制的T7RNA聚合酶的 入CE6噬菌體侵染宿主細胞，或者將質粒轉入帶有受lacUV5控制的T7 RNA聚合 酶基因的表達型細胞。在第二種情形下，可以通過在細菌培養(yǎng)基中加入IPTG來 啟動表達。兩種T7啟動子以及多種擁有不同抑制本底表達水平的宿主細胞共同 構成了一個極為靈活而有效的系統(tǒng)，使各種目的蛋白得以最優(yōu)化表達。
病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作 用使外源基因進入到細胞內。本發(fā)明中所用到的載體包括常用的病毒載體，包 括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體等。另外，桿 狀病毒載體應用于哺乳動物細胞的表達在近幾年頗受重視，這是因為它與其它 病毒載體相比有特有優(yōu)勢，如可通過昆蟲細胞大量制備病毒顆粒；可感染多種 哺乳動物細胞，但在細胞內無復制能力，生物安全度高；可插入高達38kb的外 源基因等。
其中最常用的是苜蓿銀蚊夜蛾(autogra—phacalifomica)多核型多角體病毒 (multiple nuclear polyhedro-sis virus, MNPV), 筒稱AcMNPV或AcNPV。該病毒是桿狀病毒科Baculoviridae的原型，是一種大的、帶外殼的雙鏈DNA病毒，能 感染30多種鱗翅目昆蟲，被廣泛用作基因表達系統(tǒng)載體。AcNPV病毒用作外源 基因的表達載體，通常是通過體內同源重組的方法，用外源基因替代多角體蛋 白基因而構建重組病毒。由于多角體基因啟動子在感染后18 24h開始轉錄和翻 譯， 一直持續(xù)到70h。外源基因置換掉多角體基因后，并不影響后代病毒的感染 與復制，意味著重組病毒不需要輔助病毒的功能。其它作為表達載體的桿狀病 毒，主要是來自家蠶的NP (bombyxmoil， BmNP )。由于家蠶幼蟲體內系統(tǒng)適 合大規(guī)模地制備生產外源蛋白，且成本低，具有良好的應用前景。
在酵母表達系統(tǒng)中，畢赤酵母表達系統(tǒng)被認為是最有效的表達系統(tǒng)之一。 畢赤酵母表達系統(tǒng)有多種分泌型表達質粒，有許多蛋白在畢赤酵母得到了高效 分泌表達。胞外表達需要在外源蛋白的N末端加上一段信號肽序列，引導重組蛋 白進入分泌途徑。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明利用ELP所具有的反溫度相變的特性，提供了 一系列的ELP融合蛋 白，該類融合蛋白可以應用在蛋白表達及其純化中以及具有固定化酶特性的可 循環(huán)利用的酶，解決了蛋白表達量低或形成不可溶包含體的問題，而且在蛋白 純化中不需要利用復雜的純化操作。將ELP融合蛋白具有固相酶的特性，便于生 產連續(xù)化、自動化，以實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)^莫生產。


圖1為ELP-3C蛋白酶的誘導表達與純化及其應用于純化GST蛋白的 SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白質分子量標準；1: ELP-3C蛋白酶誘導表達的總菌 蛋白；2: ELP-3C蛋白酶誘導表達的裂解上清；3:加鹽沉淀ELP-3C蛋白酶后 的離心上清；4:純化后的ELP-3C蛋白酶；5:純化后的GST-ELP; 6: ELP-3C 蛋白酶酶切GST-ELP; 7:沉淀酶切產物；8:純化的GST。
圖2為ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP融合蛋白的最佳酶切濃度摸索的 SDS-PAGE電泳圖。1: GST-ELP; 2: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 10(w/w);3: ELP-3C蛋白酶GST-ELP= 1 : 50 (w/w); 4: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 100 (w/w); 5: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 500 (w/w); 6: ELP-3C蛋 白酶GST-ELP = 1 : 1000 ( w/w ); 7: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 5000 (w/w); 8: ELP-3C蛋白酶GST-ELP = 1 : 10000 (w/w)。
圖3為利用ELP-3C蛋白酶純化GFP蛋白的SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白 質分子量標準；1: ELP-GFP誘導表達的總菌蛋白；2: ELP-GFP誘導表達的裂 解上清；3:加鹽沉淀ELP-GFP后的離心上清；4:純化后的ELP-GFP; 5: ELP-3C 蛋白酶酶切ELP-GFP; 6:沉淀酶切產物；7:純化的GFP。
圖4為熒光顯微鏡下檢測所純化的GFP蛋白。
圖5為利用ELP-3C蛋白酶純化MBP蛋白的SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白 質分子量標準；1: ELP-MBP誘導表達的總菌蛋白；2: ELP-MBP誘導表達的 裂解上清；3:加鹽沉淀ELP-MBP后的離心上清；4:純化后的ELP-MBP; 5: ELP-3C蛋白酶酶切ELP-MBP; 6:沉淀酶切產物；7:純化的MBP。
圖6為利用ELP-3C蛋白酶純化TRX蛋白的SDS-PAGE電泳圖。M:蛋白 質分子量標準；1: ELP-TRX誘導表達的總菌蛋白；2: ELP-TRX誘導表達的裂 解上清；3:加鹽沉淀ELP-TRX后的離心上清；4:純化后的ELP-TRX; 5: ELP-3C 蛋白酶酶切ELP-TRX; 6:沉淀酶切產物；7:純化的TRX。
圖7為連續(xù)酶切純化的GFP蛋白的SDS-PAGE電泳圖。1:第一次ELP-3C 蛋白酶酶切ELP-GFP后純化的GFP; 2:第二次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP 后純化的GFP; 3:第三次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后純化的GFP; 4:第 四次ELP-3C蛋白酶酶切ELP-GFP后純化的GFP; 5:第五次ELP-3C蛋白酶酶 切ELP-GFP后純化的GFP; 6:第六次ELP-3 C蛋白酶酶切ELP-GFP后純化的 GFP。
具體實施方式
下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如
Sambrook等分子克隆實施室手冊中所述的條件。 實施例1:
用于蛋白表達純化的試劑盒中的pET23a-ELP質粒的制備 用于蛋白表達純化的試劑盒中的ELP-3C蛋白酶的制備 ELP-3C蛋白酶表達載體的構建及轉換宿主菌
根據(jù)1999年Meyer和Chilkoti等人報道的方法合成ELP基因(Meyer, D.E., and Chilkoti, A. 1999. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol 17: 1112-1115.), 其斗亥苦酉^f^歹l！ 如SEQ ID NO.l所示。通過ELP基因N端的Ecorl和C端的HindIII酶切后， 克隆于商業(yè)化原核表達載體pET23a中的相應酶切位點而形成pET23a-ELP載 體。將pET23a-ELP質粒轉化入大腸桿菌DH5a菌林，經培養(yǎng)表達后提取 pET23a-ELP質粒。同時，根據(jù)在NCBI中的genbank上公布的人鼻病毒3C蛋 白酶的基因序列(登錄號M12168)合成3C蛋白酶基因，其核苷S踏列如SEQ ID N0.2所示，并克隆于pbluscript載體中而形成pbluscript-3C載體。將 pbluscript-3C質粒轉化入大腸桿菌DH5a菌抹，經培養(yǎng)表達后提取pbluscript-3C 質粒。應用3C蛋白酶基因N端的HindIII和C端的Notl兩種內切酶對 pbluscript-3C進行酶切，將純化獲得3C基因片段克隆于pET23a-ELP載體相應 酶切位點中，使3C蛋白酶基因位于ELP基因的C端，而獲得ELP-3C蛋白酶表 達載體pET23a-ELP-3C。
將構建的表達載體pET23a-ELP-3C,參照Sambrook ( Sambrook, etal.1989， Molecular doing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA )方法，用CaCl2的 方法將質粒轉化入E.co".BL21 (DE3)菌抹，用含氨千青霉素(100jig/mL)的 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)轉化菌林。
實施例2:重組ELP-3C蛋白酶的表達與純化
將含有重組質粒pET23a-ELP-3C的表達宿主菌BL21 ( DE3 )單菌落接種于 Amp+的LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C 225rpm培養(yǎng)12小時，作為種子菌。取種子菌按l : 100體積比接種于新鮮的Amp+TB培養(yǎng)基中，37"C劇烈振蕩放大培 養(yǎng)至O.D. 600約為1.0時，將溫度調到18。C培養(yǎng)24小時。將100ml諸導后的菌 液進行離心收菌，5000rpm 5分鐘。用8ml水冷的PBS重懸菌體，然后進行超 聲裂解菌體，功率為200W，超聲15分鐘。將裂解菌液在4。C 12000g離心10 分鐘，去除不溶的菌體蛋白。將固體NaCl加入離心上清液中，并使之溶解，溶 液濃度為2M，裂解上清液在室溫條件下由澄清變?yōu)闇啙帷⒆儨啙岬牧呀馍锨?液室溫高速離心5分鐘后，去除上清液。加入預冷的PBS重懸沉淀，將沉淀吹 打散，并置于冰上直至所有沉淀均溶解為止。將此蛋白溶液在4。C 12000g離心 5分鐘，去除不溶的沉淀。將離心所得的上清液重復加鹽使蛋白凝集，離心，溶 解蛋白沉淀，離心去除不溶沉淀的步驟，直至去除所有的雜蛋白獲得較純的目 的蛋白為止(見圖1)。
實施例3:利用ELP-3C蛋白酶純化GST蛋白
將含有重組質粒的pGEX-ELP表達宿主菌BL21( DE3 )單菌落4妻種于Amp+ 的LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C 225rpm培養(yǎng)12小時，作為種子菌。取種子菌 按l : 100體積比接種于新鮮的Amp+LB加富培養(yǎng)基中，37。C劇烈振蕩放大培 養(yǎng)至O.D. 600約為1.0時，加入0.5mM IPTG, 37。C誘導表達4小時。收菌后進 行裂解，通過加入固體NaCl使溶液濃度為2M,觸發(fā)GST-ELP凝集并離心使其 沉淀，使用3C酶切緩沖液(50mMTris ,150mMNaCl， lmM EDTA， pH8.0 ， lmMDTT)進行溶解。按l : 100加入ELP-3C蛋白酶，5。C酶切16小時。酶切 后加入固體NaCl使溶液濃度為2M,觸發(fā)ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并離心除 去。收集上清液為純化的GST蛋白(見圖l)。
實施例4: ELP-3C蛋白酶酶切GST-ELP融合蛋白的最適酶切濃度
酶切100jigGST-ELP蛋白底物，按ELP-3C : GST-ELP質量比1 : 10,1 : 50,
i : ioo, i : :500, i : iooo, i : 5000, i : 10000加入ELP-3c蛋白酶，混勻后
于5。C酶切16小時。酶切反應結束后進4亍SDS-PAGE電泳4企測(見圖2 )。 實施例5:利用ELP-3C蛋白酶純化GFP蛋白
將含有重組質粒pET23a-ELP-GFP的表達宿主菌BL21 ( DE3 )單菌落接種于Amp+的LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C 225rpm培養(yǎng)12小時，作為種子菌。 取種子菌按l : 100體積比接種于新鮮的Amp+TB培養(yǎng)基中，37。C劇烈振蕩放 大培養(yǎng)至O.D. 600約為1.0時，將溫度調到18。C培養(yǎng)24小時。收菌后進行裂解， 通過加入固體NaCH吏溶液濃度為2M，觸發(fā)ELP-GFP凝集并離心使其沉淀，使 用3C酶切緩沖液(50mMTris,150mMNaCl， lmMEDTA， pH8.0 ， lmMDTT) 進行溶解。按l : 100加入ELP-3C蛋白酶，5"C酶切16小時。酶切后加入固體 NaCl使溶液濃度為2M，觸發(fā)ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并離心除去。收集上 清液為純化的GFP蛋白(見圖3)。將純化的GFP蛋白置熒光顯微鏡下觀察，可 以檢測到明顯的熒光(見圖4)。
實施例6:利用ELP-3C蛋白酶純化MBP蛋白
將含有重組質粒pET23a-ELP-MBP的表達宿主菌BL21 ( DE3 )單菌落接種 于Amp+的LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C 225rpm培養(yǎng)12小時，作為種子菌。 取種子菌按1 : 100體積比接種于新鮮的Amp+ TB培養(yǎng)基中，37。C劇烈振蕩放 大培養(yǎng)至O.D. 600約為1.0時，將溫度調到18。C培養(yǎng)24小時。收菌后進行裂解， 通過加入固體NaCl使溶液濃度為2M,觸發(fā)ELP-MBP凝集并離心使其沉淀， 使用3C酶切緩沖液(50mM Tris , 150mM NaCl, lmM EDTA, pH8. 0 ， 1mM DTT ) 進行溶解。按1 : 100加入ELP-3C蛋白酶，5。C酶切16小時。酶切后加入固體 NaCl使溶液濃度為2M,觸發(fā)ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并離心除去。收集上 清液為純化的MBP蛋白(見圖5 )。
實施例7:利用ELP-3C蛋白酶純化TRX蛋白
將含有重組質粒pET23a-ELP-TRX的表達宿主菌BL21 ( DE3 )單菌落接種 于Amp+的LB液體加富培養(yǎng)基中，37°C 225rpm培養(yǎng)12小時，作為種子菌。 取種子菌按l : 100體積比接種于新鮮的Amp+TB培養(yǎng)基中，37。C劇烈振蕩放 大培養(yǎng)至O.D. 600約為1.0時，將溫度調到18。C培養(yǎng)24小時。收菌后進行裂解， 通過加入固體NaCl使溶液濃度為2M,觸發(fā)使GST-GFP凝集并離心使其沉淀， 使用3C酶切緩沖液(50mM Tris ， 150mM NaCl, lmM EDTA， pH8. 0 ， lmM DTT ) 進行溶解。按1 : 100加入ELP-3C蛋白酶，5。C酶切16小時。酶切后加入固體NaCl使溶液濃度為2M,觸發(fā)ELP和ELP-3C蛋白酶凝集并離心除去。收集上 清液為純化的TRX蛋白(見圖6)。
實施例8: ELP-3C蛋白酶重復利用活性的檢測
酶切l(wèi)mgELP-GFP蛋白，按ELP-3C : ELP-GFP質量比1 : 100加入ELP-3C 蛋白酶。2(TC酶切4小時后，加入固體NaCl使酶切溶液濃度為2M，室溫高速 離心5分鐘，保留上清樣品。沉淀用含有l(wèi)mg的ELP-GFP蛋白的酶切緩沖溶液 (50mM Tris , 150mM NaCl, lmM EDTA， pH8. 0 , lraM DTT )重懸，并不斷地吹 吸使沉淀溶解為止，后繼續(xù)進行20。C酶切4小時。如此重復上面的步驟6次。 將每次純化的GFP蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳4全測(見圖7 )。
最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā) 明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普 通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不 脫離本發(fā)明技術方案的實質和范圍。序 列 表
<110〉中山大學
<120> —種ELP融合蛋白酶及其應用 <160> 3
<210> 1
<211> 150
〈212〉駆
<213〉人工序列
<220〉
<221〉
<222〉 (l).. (150)
<223> ELP基因 <400〉 1
gtgggtgt tccgggcgtg ggtgttccgg gtggcggtgt gccgggcgcs 5 0 ggtgttcctg gtgtsggtgt gccgggtgtt ggtgtgccgg gtgttggtgt 100 accaggtggc ggtgttccgg gtgcsggcgt tccgggtggc ggtgtgccgg gc 150
<210> 2
<211> 549 <212〉腿
<213>人鼻病毒(Human Rhinovirus)
<400> 2
ggacctaaca
tdtC3CC3Ct
tttgtgttst
gtgacatccg ctggttgtac
ctgagtttgc 3gt3a3ggcg tcctsctcst ttcgtgttsa gssctgsccg tggttttstt
tctgtctctg 3gttc3ctgg gctcsgccgg
tsctg3ctct
Cttt3Ct33C
18
tctgggtatt gtgacgstgt 33sctggttg ggatcgtaat tgg33ggtgt 3ct3ttctgg
3C3tc3tgsc 50
cscgstcgtg 1〇〇
tctggtasac 150
acccggaaaa 200
g3a33gttcc 25 0
cgscgcsscc 300
aggttggtcc 350ggtaactstg tgsttcgtta tgcgcssccg gggtttctct
gctggtctga tc33cctgtc t3gcsctccg
cgactacgcs sctssssctg gtcagtgtgg
gtaagatctt tggcatccat gtaggcggta
gc3C3actgs sgaagcssts ctttgtsgsg
3CC3sccgca 400
tggtgttctg 450
acggtcgtca 500
3sgcsgt33 549
<210> <211> <212> <213〉 <220> <221> <222〉 <223> <400>
3
648 PRT
人工序列
(l)..,
ELP-3C蛋白酶 3
Met Gly 1
Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val Gly Val
His Pro Pro Pro Pro Pro P:co Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
Gly Val 5
Gly Ala
20 Gly Val
35
Gly Gly
50 Gly Gly
65
Gly Val 80
Gly Ala 95
Gly Val
110 Gly Val
125 Gly Gly
140 Gly Val
155 Gly Ala170 Gly Val
185 Gly Gly
200 Gly Gly
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val Val
Pro Gly
10 Pro Gly
25 Pro Gly
40
Pro Gly
55 Pro Gly
70 Pro Gly
85
Pro Gly
100 Pro Gly
115 Pro Gly
130 Pro Gly
145 Pro Gly
160 Pro Gly
175 Pro Gly
190 Pro Gly
205 Pro Gly
Val
Val
Gly
Val
Ala
Val
Gly
Gly
Val
Ala
Val
Val
Gly
Val
Ala
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
Val Pro 15
Val Pro 30
Val Pro 45
Val Pro 60
Val Pro 75
Val Pro 90
Val Pro
105 Val Pro
120 Val Pro
135 Val Pro
150 Val Pro
165 Val Pro
180 Val Pro
195 Val Pro
210 Val Pro
Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Val Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Ala Gly Val Gly Val215 220 225
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
230 235 240
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val
245 250 255
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
260 265 270
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
275 280 285
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly
290 295 300
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
305 310 315
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
320 325 330
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
335 340 345
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
350 355 360
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
365 370 375
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly
380 385 390
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly G工y Gly Val Pro Gly Val
395 400 405
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
410 415 420
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
425 430 435
Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly
440 445 450
Gly Val Pro Gly Gly Leu Lys Leu Leu Gin Val Asp Ser Arg Gly
455 460 465
Ser Gly Pro Asn Thr Glu Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Lys Asn
470 475 480
lie Met Thr工le Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Leu Gly
485 490 495
工le His Asp Arg Val Cys Val lie Pro Thr His Ala Gin Pro Gly
500 505 510
Asp Asp Val Leu Val Asn Gly Gin Lys lie Arg Val Lys Asp Lys
515 520 525
Tyr Lys Leu Val Asp Pro Glu Asn lie Asn Leu Glu Leu Thr Val
530 535 540
Leu Thr Leu Asp Arg Asn Glu Lys Phe Arg Asp lie Arg Gly Phe
545 550 555
lie Ser Glu Asp Leu Glu Gly Val Asp Ala Thr Leu Val Val His
560 565 570
Ser Asn Asn Phe Thr Asn Thr lie Leu Glu Val Gly Pro Val Thr
575 580 585
Met Ala Gly Leu lie Asn Leu Ser Ser Thr Pro Thr Asn Arg Met
590 595 600
lie Arg Tyr Asp Tyr Ala Thr Lys Thr Gly Gin Cys Gly Gly Val
605 610 615Leu Cys Ala Thr Gly Lys lie Phe Gly lie His Val Gly Gly Asn 620625 630
Gly Arg Gin Gly Phe Ser Ala Gin Leu Lys Lys Gin Tyr Phe Val 635640 645
Glu Lys Gin
權利要求
1、一種無標簽的重組蛋白的表達純化的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)連接目標蛋白基因與含有ELP的融合伴侶的基因成為融合蛋白基因，并表達得到融合蛋白A，其中所述融合蛋白A在所述ELP與所述含有ELP的融合伴侶的連接處至少有一個蛋白酶酶切位點；(2)將步驟(1)得到的融合蛋白A與一種含有ELP的融合蛋白酶B混合，所述的融合蛋白酶B能作用于融合蛋白A的酶切位點，但不作用于自身；(3)讓步驟(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶B將融合蛋白A降解成為含ELP的融合伴侶和目標蛋白；(4)改變步驟(3)的混合溶液的溫度、鹽離子濃度或pH中的至少一個條件，待出現(xiàn)聚集體后，離心，取上清溶液即為純化的目標蛋白。
2、 根據(jù)權利要求1所述的無標簽的重組蛋白的表達純化的方法，其特征在 于，所述的ELP的單體的核香酸序列如SEQ TDNO.l所示。
3、 根據(jù)權利要求1所述的無標簽的重組蛋白的表達純化的方法，其特征在 于，所述的ELP為ELP單體的四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九 聚
4、 根據(jù)權利要求1所述的無標簽的重組蛋白的表達純化的方法，其特征在 于，所述融合蛋白酶B包括ELP-3C或ELP-SUMO蛋白酶。
5、 一種無標簽的重組蛋白，其特征在于，其是通過以下方法得到的 (1 )連接目標蛋白基因與含有ELP的融合伴侶的基因成為融合蛋白基因， 并表達得到融合蛋白C，其中所述融合蛋白C在所述ELP與所述含有ELP的融合伴倡的連接處至少有一個蛋白酶酶切酶切位點；(2 )將步驟(1 )得到的融合蛋白C與一種含有ELP的融合蛋白酶D混合， 所述的融合蛋白酶D能作用于融合蛋白C的酶切位點，但不作用于自身；(3) 讓步驟(2)的混合物相互作用，其中融合蛋白酶D將融合蛋白C降 解成為含ELP的融合伴侶和目標蛋白；(4) 改變步驟(3)的混合溶液的溫度、鹽離子濃度或pH中的至少一個條 件，待出現(xiàn)聚集體后，離心，取上清溶液即為純化的目標蛋白。
6、 一種含ELP的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括彈性蛋白樣多 肽(ELP)和至少一種目的蛋白或多肽，所述目的蛋白或多肽能以與ELP形成 的融合蛋白的形式進行表達，所述融合蛋白能在不同的溫度、不同的鹽離子濃 度或不同的pH值中的至少一個不同的條件下處于溶解或沉淀狀態(tài)，并且所述融 合蛋白能通過調節(jié)溫度、鹽離子濃度或pH值得以純化。
7、 一種表達純化含ELP的融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1 )連接目標蛋白基因與含有ELP的融合伴侶的基因成為融合蛋白基因，并表達得到融合蛋白E;(2 )改變步驟(1 )得到的融合蛋白E所處的溫度、鹽離子濃度或pH值中 的至少一個條件，待出現(xiàn)聚集體后，離心，所得聚集體即為含ELP的融合蛋白。
8、 一種用于蛋白表達純化的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含ELP 的質粒，所述含ELP的質粒用于制備融合蛋白F和融合蛋白G,所述融合蛋白 G含有目標蛋白或多肽，所述融合蛋白F能將所述融合蛋白G通過酶切，得到 目標蛋白或多肽。
9、 一種具有固定化酶特性的可循環(huán)利用的酶，其特征在于，所述酶為包含 ELP的融合蛋白酶，所述ELP能根據(jù)溫度、鹽離子濃度或pH值處于溶解或沉淀狀態(tài)。
10、 一種利用包含ELP的蛋白酶進行循環(huán)酶切純化的方法，其特征在于，包括如下步驟(1 )將融合蛋白酶與底物混合，進行酶切反應；(2) 調整酶切反應后的溶液的溫度、鹽離子濃度或pH值，待出現(xiàn)聚集 體后離心；(3) 將離心后得到的聚集體加入酶解液，待其溶解后，加入底物，進行 酶切反應，重復步驟(2)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含ELP的融合蛋白以及相關的一系列應用，包括一種無標簽的重組蛋白的表達純化的方法、一種無標簽的重組蛋白、一種表達純化含ELP的融合蛋白的方法、一種用于蛋白表達純化的試劑盒、一種具有固定化酶特性的可循環(huán)利用的酶以及一種利用包含ELP的蛋白酶進行循環(huán)酶切純化的方法，本發(fā)明利用ELP所具有的反溫度相變的特性，解決了蛋白表達量低或形成不可溶包含體的問題，而且在蛋白純化中不需要利用復雜的純化操作。另外，將含ELP的融合蛋白作為固相酶來用，避免了固相酶的劣勢，且能便于生產連續(xù)化、自動化，以實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產。
文檔編號C12P21/06GK101633946SQ200910141889
公開日2010年1月27日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權日2008年12月2日
發(fā)明者徐安龍, 磊 王, 藍東明, 陳尚武, 黃光瑞 申請人:中山大學