專利名稱：基于細(xì)菌粘附素融合序列、hr1序列和hr2序列的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌藥領(lǐng)域，尤其是預(yù)防腦膜炎球菌感染的抗菌藥。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是一種革蘭氏陰性有莢膜菌，它聚集在約10％人群的上呼吸道內(nèi)。每10,000受聚集的人(或每100,000人)中大約會發(fā)生1例細(xì)菌進(jìn)入血流的情況，細(xì)菌在其中增殖并造成敗血癥。通過血流細(xì)菌可通過血腦屏障并造成腦膜炎。這兩種疾病都是破壞性的，盡管可獲得有效抗生素，每年也會殺死5-15％受感染的兒童和青年。存活的人中有高至25％的人留下永久性后遺癥。
人們已經(jīng)進(jìn)行了制造預(yù)防腦膜炎球菌感染的疫苗的廣泛工作{1}，但很少有工作提供不基于免疫的感染抑制劑。本發(fā)明的一個目的是提供這種不基于免疫的腦膜炎球菌感染的抑制劑。
發(fā)明概述有包膜病毒進(jìn)入靶宿主細(xì)胞要求它們各自的脂雙層膜融合。已經(jīng)詳細(xì)描述了HIV的進(jìn)入機(jī)制HIV的包膜糖蛋白gp120結(jié)合人靶細(xì)胞上的CD4+受體導(dǎo)致構(gòu)象變化，從而使得gp120能夠與宿主細(xì)胞上的趨化因子受體相互作用；gp120結(jié)合共同受體造成隨后病毒跨膜糖蛋白gp41的構(gòu)象改變，暴露gp41的“融合肽”，該融合肽插入細(xì)胞膜；稱為HR1的gp41的螺旋區(qū)然后與gp41上類似的螺旋區(qū)HR2相互作用，導(dǎo)致將兩個螺旋“拉緊”在一起并介導(dǎo)細(xì)胞膜和病毒膜的融合。
Enfuvirtide(也稱為“T-20”或“FuzeonTM”{2})是一種原型“融合抑制劑”抗-HIV藥。它是一種線形36-氨基酸合成肽，能通過結(jié)合gp41中的HR1七殘基重復(fù)區(qū)和防止膜融合所需的構(gòu)象變化而抑制HIV/T細(xì)胞相互作用。Enfuvirtide基于HR2序列并被認(rèn)為可作為天然HR1/HR2相互作用的競爭性抑制劑。
這種膜融合機(jī)制在病毒中是典型的，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，腦膜炎奈瑟氏球菌中已知的表面粘附素(NadA){3}含有與融合肽HR1重復(fù)和HR2重復(fù)一致的序列(見

圖1)。NadA中的序列不具有任何與病毒序列類似的明顯序列，而是基于NadA與SARS冠狀病毒刺突蛋白的結(jié)構(gòu)相似性鑒別的。這一驚人的發(fā)現(xiàn)說明，融合抑制劑可用于抑制腦膜炎球菌感染。
NadA HR1和HR2的結(jié)合劑因此，本發(fā)明提供了一種能結(jié)合腦膜炎球菌表面NadA粘附素的七殘基重復(fù)序列HR1和/或HR2，從而抑制腦膜炎球菌感染宿主生物或傳播已存在的感染的能力的化合物。
以MC58菌株序列(SEQ ID NO1)作為基準(zhǔn)，NadA的HR1區(qū)位于殘基117-152之間。同樣以菌株MC58為基準(zhǔn)，HR2區(qū)位于殘基261-299之間。通過與MC58序列簡單比對可以鑒定在其它菌株中的相應(yīng)坐標(biāo)。
因此，本發(fā)明還提供了能結(jié)合腦膜炎球菌表面NadA粘附素的HR1和/或HR2區(qū)域的化合物，按照菌株MC58中NadA序列的編號，其中所述HR1序列位于殘基117-152之間，按照菌株MC58中NadA序列的編號，其中所述HR2序列位于殘基261-299之間。菌株MC58是用于測定血清群B基因組的序列的菌株{4}并且是可廣泛獲得的(例如ATCC BAA-335)。
流感嗜血桿菌埃及生物群同在腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitides)的NadA粘附素中鑒定出HR1和HR2序列一樣，發(fā)明人已在造成巴西紫癜熱(BPF)的流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)埃及(aegyptius)生物群的HadA粘附素{5；文中的SEQ ID NO35}中發(fā)現(xiàn)了HR1和HR2序列。HadA中的序列不具有任何類似于病毒序列的明顯序列，而是基于與NadA的結(jié)構(gòu)類似性鑒別的。與病毒HR序列的驚人類似性說明，融合抑制劑可用于抑制流感嗜血桿菌(H.influenzae)感染。
因此，本發(fā)明提供了能結(jié)合嗜血桿菌(尤其是流感嗜血桿菌，更尤其是埃及生物群)表面HadA粘附素的七殘基重復(fù)序列HR1和/或HR2，從而抑制嗜血桿菌感染宿主生物或傳播已存在的感染的能力的化合物。
以F3031菌株序列(SEQ ID NO35)作為基準(zhǔn)，HadA的HR1區(qū)位于殘基71-91之間。同樣以菌株F3031為基準(zhǔn)，HR2區(qū)位于殘基120-183之間。通過與F3031序列簡單比對可以鑒定在其它菌株中的相應(yīng)坐標(biāo)。
因此，本發(fā)明還提供了能結(jié)合嗜血桿菌表面HadA粘附素的HR1和/或HR2區(qū)的化合物，按照菌株F3031中HadA序列的編號，其中所述HR1序列位于殘基71-91之間，按照菌株F3031中HadA序列的編號，其中所述HR2序列位于殘基120-183之間。菌株F3031是BPF克隆{6}并且是可廣泛獲得的(例如ATCC 49252)。
寡肽本發(fā)明的化合物將通常是寡肽，例如由不多于z個氨基酸構(gòu)成的肽，其中的z是50或更小(例如49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6等)。
本發(fā)明提供了含有選自下組的氨基酸序列的片段的寡肽SEQ ID NO12、SEQ IDNO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO1 5、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO39或SEQ ID NO40，其中所述片段由所述SEQ ID中的n個連續(xù)氨基酸構(gòu)成，且其中的n是5或更大(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45等)。
本發(fā)明還提供了含有選自下組的氨基酸序列的片段的寡肽SEQ ID NO12、SEQID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO39或SEQ ID NO40，其中所述片段由所述SEQ ID中的n個連續(xù)氨基酸構(gòu)成，且其中的n是5或更大(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45等)，前提是，與所述SEQ ID相比所述片段含有m個氨基酸取代，其中的m是1和n/4之間的整數(shù)。
m的值優(yōu)選1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。m個氨基酸通常被A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代。m個取代基各自可以相同或不同。優(yōu)選被G，或者更優(yōu)選被A取代。取代氨基酸可以是L-或D-氨基酸，但當(dāng)其它n-m個氨基酸都具有單一立體構(gòu)型時(即都為D-或都為L-時)，取代取代氨基酸優(yōu)選也具有該立體構(gòu)型(當(dāng)然，盡管G沒有立體異構(gòu)體)。
當(dāng)n個氨基酸的片段包含C時，m的值優(yōu)選至少為1，從而使得C被其它氨基酸(如S)取代。用這種方式除去C能提高對氧化的抗性。
SEQ ID NO12的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO5的片段。SEQ ID NO13的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO6的片段。SEQ ID NO14的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO7的片段。SEQ ID NO15的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO8的片段。SEQ ID NO16的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO10的片段。SEQ ID NO17的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO11的片段。SEQ ID NO39的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO37的片段。SEQ ID NO40的優(yōu)選片段也是SEQ ID NO38的片段。
特別優(yōu)選的寡肽包含以下氨基酸序列之一或由以下氨基酸序列之一構(gòu)成SEQ IDNO4、5、6、7、8、9、10、11、29、30、31、37和38。
多肽本發(fā)明的化合物可以是例如由2-1000個氨基酸構(gòu)成的多肽。所述多肽優(yōu)選由不多于250個氨基酸構(gòu)成(例如不多于225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、80、70、60或不多于50個)。
所述多肽可具有下式NH2-A-(B-C)n-D-COOH，其中n是1-5的整數(shù)，-A-是含有a個氨基酸的任意N-末端序列；(各)-B-是含有SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO39和/或SEQ ID NO40中b個連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；(各)-C-是由c個氨基酸構(gòu)成的任意接頭序列；-D-是由d個氨基酸構(gòu)成的任意C-末端序列。b的值是5或更大(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45等)。優(yōu)選片段如上所述(即SEQ ID NO4-11和29-31)。
在一些多肽中，-B-部分(或一個或多個各-B-部分)的氨基酸序列可含有m個氨基酸取代，其中m是如上文定義的1和n/4之間的整數(shù)。
n個-B-各自可以與另一-B-相同或相互不同。
a的值通常至少為1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)，但也可以是0(即-A-不存在)。典型的-A-部分的例子包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列，或者便于克隆或純化的短肽序列(例如組氨酸標(biāo)簽，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合適的N-末端氨基酸序列也是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯見的。
d的值通常至少為1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)，但也可以是0(即-D-不存在)。典型的-D-部分的例子包括引導(dǎo)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)那皩?dǎo)序列、便于克隆或純化的短肽序列(例如包含組氨酸標(biāo)簽，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)、或者增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列。其它合適的C-末端氨基酸序列也是精通本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯見的。
a+d的值可以是0或更大(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)。優(yōu)選a+d的值最多為1000(例如最多900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2)。
-A-的氨基酸序列通常與NadA(或者可用的話，HadA)序列(例如在SEQ ID NO1或2或35中)中-B-序列N-末端的a個氨基酸有低于x％的序列相同性，-D-的氨基酸序列通常與NadA(或HadA)序列(例如在SEQ ID NO1或2或35中)中-B-序列C-末端的d個氨基酸有低于y％的序列相同性。通常，x和y的值都為60或更小(例如50、40、30、20、10或更小)。x和y的值可以相同或者相互不同。
各c的值通常至少為1(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500等)，但也可以是0(即-C-不存在)。n個c的值可以各自相同或者相互不同。
n個C各自可以與另一C相同或者相互不同。
-Cn-(即第n個-C-部分)的氨基酸序列通常與NadA(或者HadA)序列(例如在SEQ IDNO1或2或35中)中-Bn-序列C-末端的c個氨基酸有低于z％的序列相同性。通常，z的值為60或更小(例如50、40、30、20、10或更小)。當(dāng)n＞1時，各z的值可以相同或者相互不同。
n的值優(yōu)選是1，此時該多肽具有式NH2-A-B-C-D-COOH。
本發(fā)明的肽本發(fā)明的多肽(包括寡肽，統(tǒng)稱為“肽”)可以是線形、分支或環(huán)狀的，但優(yōu)選是直鏈氨基酸。當(dāng)存在半胱氨酸殘基時，本發(fā)明的肽可通過二硫鍵與其它肽相連。本發(fā)明的肽可含有L-氨基酸和/或D-氨基酸。優(yōu)選包含D-氨基酸以賦予對哺乳動物蛋白酶類的抗性。
本發(fā)明的肽的N-末端殘基可被共價修飾。合適的共價基團(tuán)包括，但不限于乙酰基(如FuzeonTM中的)；疏水基團(tuán)；芐氧羰基；丹?；?；叔丁氧羰基；酰氨基；9-芴甲氧羰基(FMOC)；脂質(zhì)；脂肪酸；聚乙烯；糖類；等等。
類似地，肽的C-末端殘基可被共價修飾(例如氨甲酰，如FuzeonTM中的，等等)。合適的共價基團(tuán)包括，但不限于乙酰基(如FuzeonTM中的)；疏水基團(tuán)；酰氨基；芐氧羰基；丹?；?；叔丁氧羰基；9-芴甲氧羰基(FMOC)；脂質(zhì)；脂肪酸；聚乙烯；糖類；等等。
本發(fā)明的肽可用各種方法制造。
優(yōu)選的制造方法包括體外化學(xué)合成法{7，8}。特別優(yōu)選固相肽合成法，如基于t-Boc或Fmoc的化學(xué)方法{9}。也可部分或全部采用酶合成法{9}。
作為化學(xué)合成法的替代，也可采用生物合成法，例如可通過翻譯制造肽。這可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。生物方法通常局限于制造基于L-氨基酸的肽，但可對翻譯機(jī)(例如氨?；?tRNA分子)進(jìn)行處理以引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸、甲基苯丙氨酸、疊氮高丙氨酸(azidohomoalanine)等){11}。然而，當(dāng)本發(fā)明的肽包含D-氨基酸時，優(yōu)選采用化學(xué)合成法。
通過生物方法制造肽得到了具有N-末端甲硫氨酸殘基的肽。當(dāng)本發(fā)明的肽的N-末端不是甲硫氨酸時，則需通過例如蛋白水解消化除去該殘基(以及任何其它無關(guān)殘基)。
為便于肽的生物合成，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的肽的核酸。核酸可以是DNA或RNA(或其雜合)，或者它們的類似物，如含有修飾的主鏈的核酸(如硫代磷酸酯)或肽核酸(PNA)。核酸可以是單鏈的(例如mRNA)或雙鏈的，本發(fā)明包括雙鏈核酸的各條鏈(例如出于反義、引導(dǎo)或探測的目的)。核酸可以是線性或環(huán)狀的。核酸可被標(biāo)記。核酸可附于固體支持物。
當(dāng)然，本發(fā)明的核酸可用多種方法制備，例如，通過全部或部分化學(xué)合成(例如DNA的亞磷酰胺合成)，通過較長分子的核酸酶消化，通過較短分子的連接，來自基因組文庫或cDNA文庫，通過采用聚合酶等。
本發(fā)明提供了含有本發(fā)明核酸的載體(例如質(zhì)粒)(例如表達(dá)載體和克隆載體)以及用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(原核或真核)。
藥物設(shè)計(jì)和肽模擬學(xué)本發(fā)明的肽本身就是有用的抗菌藥。然而，可對它們進(jìn)行精制以改進(jìn)其抗菌活性或改進(jìn)諸如生物利用度、毒理學(xué)、代謝、藥代動力學(xué)等藥理學(xué)重要特征。因此，所述肽可用作其它研究和精制的先導(dǎo)化合物。
本發(fā)明的肽可用于設(shè)計(jì)具有抗-腦膜炎球菌或抗-嗜血桿菌活性的肽模擬分子{例如參考文獻(xiàn)12到18}。這些模擬分子通常與本發(fā)明的肽是等排的(isosteric)，但會缺少一個或多個肽鍵。例如，可用非肽主鏈代替肽主鏈而保留重要的氨基酸側(cè)鏈。
所述肽模擬分子可包含糖氨基酸{19}。可采用類肽。
為輔助肽模擬分子設(shè)計(jì)，可定義對于KM肽的藥效團(tuán)(即代表負(fù)責(zé)活性的特定特征的化學(xué)特征和3D約束的集合)。藥效團(tuán)優(yōu)選包括表面可接近(surface-accessible)特征，更優(yōu)選包括氫鍵供體和受體、帶電荷/可電離(ionisable)基團(tuán)和/或疏水塊區(qū)(patch)?？筛鶕?jù)它們對于活性的相對重要性進(jìn)行加權(quán){20}。
藥效團(tuán)可用諸如CATALYST(包括HypoGen或HipHop){21}、CERIUS2等軟件確定，或者可從本發(fā)明多肽的已知構(gòu)象手工構(gòu)建。采用諸如CATALYST的程序，可用藥效團(tuán)來篩選結(jié)構(gòu)庫。也可采用CLIX程序{22}，該程序檢索結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中候選分子的定向從而和與受體相互作用的化學(xué)基團(tuán)產(chǎn)生最大空間重合。
結(jié)合表面或藥效團(tuán)可用來繪制官能團(tuán)(例如質(zhì)子、羥基、氨基、疏水基團(tuán))或小分子片段的有利相互作用位點(diǎn)。然后可從頭設(shè)計(jì)化合物，在這些化合物中，有關(guān)官能團(tuán)所處的空間關(guān)系與在本發(fā)明多肽基本相同。
可用具有正確大小和幾何結(jié)構(gòu)的橋接片段或用能夠?qū)⒐倌軋F(tuán)支持在有利方向的框架將官能團(tuán)連接入單個化合物，從而提供本發(fā)明的肽模擬化合物。雖然或許在諸如QUANTA或SYBYL等軟件的幫助下，用這種方式連接官能團(tuán)雖然可手工完成，，但也可獲得自動或半自動從頭設(shè)計(jì)方法，如-MCSS/HOOK{23、24、21}，將多個官能團(tuán)與取自數(shù)據(jù)庫的分子模板相連；-LUDI{25，21}，能計(jì)算被配體完美執(zhí)行的相互作用位點(diǎn)，根據(jù)片段與受體相互作用的能力將片段放在結(jié)合位點(diǎn)，然后將它們相連以制造配體；-MCDLNG{26}，用通用原子(generic atom)緊密壓縮陣列填充受體結(jié)合位點(diǎn)，并采用Monte Carlo程序隨機(jī)改變原子的類型、位置、鍵排列和其它特征；-GROW{27}，從最初的“種子”片段(手工或自動放置的)開始，并使配體向外生長；-SPROUT{28}，該程序組包括以下模塊鑒定結(jié)合口袋內(nèi)有利氫鍵和疏水區(qū)的模塊(HIPPO模塊)；選擇官能團(tuán)并將它們放置在靶位點(diǎn)以形成用于結(jié)構(gòu)生成的起始片段的模塊(EleFAnT)；通過使間隔片段生長到起始片段上然后連接所得分開的骨架而生成滿足結(jié)合口袋的空間約束的骨架的模塊(SPIDeR)；將雜原子替代入骨架以產(chǎn)生靜電特征與受體位點(diǎn)的靜電特征互補(bǔ)的分子的模塊(MARABOU)。解決方案可用ALLigaTOR模塊聚集和儲存；
-CAVEAT{29}，設(shè)計(jì)約束無環(huán)分子的連接單元；-LEAPFROG{30}，通過作出小的逐步結(jié)構(gòu)變化并迅速評價新化合物的結(jié)合能來評價配體。基于改變的結(jié)合能來保留或放棄變化，結(jié)構(gòu)趨于提高與受體的相互作用能；-GROUPBUILD{31}，采用通用有機(jī)模板庫和配體和受體間非鍵相互作用的完全經(jīng)驗(yàn)力場描述來構(gòu)建在化學(xué)上具有合理結(jié)構(gòu)并具有與受體結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的空間和靜電特征的配體。
-RASSE{32}這些方法鑒定了抗菌化合物。這些化合物可從頭設(shè)計(jì)、可以是已知化合物、或者可基于已知化合物。化合物本身可以是有用的抗菌藥，或者它們可以是用于進(jìn)一步精制藥物以提高結(jié)合親和力或其它藥理學(xué)重要特征(例如生物利用度、毒理學(xué)、代謝、藥代動力學(xué)等)的原型(即先導(dǎo)化合物)。
因此，本發(fā)明提供了(i)用這些藥物設(shè)計(jì)方法鑒定的化合物；(ii)用這些藥物設(shè)計(jì)方法鑒定的用作藥物的化合物；(iii)用這些藥物設(shè)計(jì)方法鑒定的化合物在制造例如用于預(yù)防腦膜炎球菌或嗜血桿菌感染的抗菌藥中的應(yīng)用；(iv)治療患者的方法，包括給予有效量的用這些藥物設(shè)計(jì)方法鑒定的化合物。
通過基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)技術(shù)在計(jì)算機(jī)上鑒定的配體除了本身是有用的化合物，也可作為“傳統(tǒng)”體外或體內(nèi)篩選方法的化合物庫。可在化合物庫(例如組合庫)中鑒定和模擬配體的重要藥物基序(motif)以篩選殺微生物和/或抗病毒活性。
減毒腦膜炎球菌NadA粘附素在腦膜炎球菌上形成了暴露于表面的寡聚體并參與粘附上皮細(xì)胞{41}。粘附是腦膜炎球菌致病循環(huán)的一部分，將其抑制能使細(xì)菌減毒從而不能侵襲細(xì)胞和造成疾病，但不會損失細(xì)菌的全部免疫原性。根據(jù)本發(fā)明，抑制粘附的一個方法是從NadA中除去HR1、HR2或融合肽序列中的一個或多個。
因此，本發(fā)明提供了一種突變型NadA蛋白，其中的突變蛋白缺少HR1、HR2或融合序列中的一個或多個。
本發(fā)明還提供了突變型NadA蛋白，其中所述突變體不含有以下氨基酸序列中的一個或多個(i)與SEQ ID NO3至少p％相同的序列；(ii)與SEQ ID NO5至少q％相同的序列；(iii)與SEQ ID NO7至少r％相同的序列；(iv)與SEQ ID NO10至少s％相同的序列。
p的值為50或更大。q的值為50或更大。r的值為50或更大。s的值為50或更大。p、q、r和s的值相互獨(dú)立，通常為60、70、80、90、95、96、97、98、99或100。
氨基酸序列(i)、(ii)、(iii)和(iv)優(yōu)選至少10個氨基酸長，更優(yōu)選至少15個氨基酸長。
本發(fā)明還提供了突變型NadA蛋白，其包含氨基酸序列-A-B-C-D-E-F-G-H-I-，其中-A-是與SEQ ID NO1的氨基酸26-116有至少a％序列相同性的的氨基酸序列；-B-是與SEQ IDNO1的氨基酸117-152有至少b％序列相同性的的氨基酸序列；-C-是與SEQ ID NO1的氨基酸153-180有至少c％序列相同性的的氨基酸序列；-D-是與SEQ ID NO1的氨基酸181-199有至少d％序列相同性的的氨基酸序列；-E-是與SEQ ID NO1的氨基酸200-260有至少e％序列相同性的的氨基酸序列；-F-是與SEQ ID NO1的氨基酸261-275有至少f％序列相同性的的氨基酸序列；-G-是與SEQID NO1的氨基酸276-277有至少g％序列相同性的的氨基酸序列；-H-是與SEQ IDNO1的氨基酸278-299有至少h％序列相同性的的氨基酸序列；-I-是與SEQ ID NO1的氨基酸300-364有至少i％序列相同性的的氨基酸序列，條件是-B-、-D-、-F-或-H-中的至少一種在所述蛋白質(zhì)中不存在。
a的值為50或更大。b的值為50或更大。c的值為50或更大。d的值為50或更大。e的值為50或更大。f的值為50或更大。g的值為50或更大。h的值為50或更大。i的值為50或更大。a、b、c、d、e、f、g、h和i的值相互獨(dú)立，通常為60、70、80、90、95、96、97、98、99或100。
本發(fā)明還提供了編碼這些突變型NadA蛋白的核酸。本發(fā)明還提供了表達(dá)所述核酸(a)的腦膜炎球菌，該菌在其表面呈遞所述突變型NadA蛋白且不能結(jié)合和/或進(jìn)入人上皮細(xì)胞。
可通過同源重組(例如用等基因刪除技術(shù))將這種突變體引入靶腦膜炎球菌以除去天然nadA序列。
減毒嗜血桿菌根據(jù)本發(fā)明，抑制嗜血桿菌粘附的一種方法是從HadA中除去HR1、HR2或融合肽序列中的一個或多個。因此，本發(fā)明提供了一種突變型HadA蛋白，其中的突變蛋白缺少HR1、HR2或融合序列中的一個或多個。
本發(fā)明還提供了突變型HadA蛋白，其中所述突變體不含與SEQ ID NO35有至少p％相同的氨基酸序列，其中，p的值為50或更大(例如60、70、80、90、95、96、97、98、99或100)。該氨基酸序列優(yōu)選有至少10個氨基酸長，更優(yōu)選至少15個氨基酸長。
本發(fā)明還提供了突變型HadA蛋白，其包含氨基酸序列-A-B-C-D-E-F-G-，其中-A-是與SEQ ID NO35的氨基酸27-50有至少a％序列相同性的的氨基酸序列；-B-是與SEQ ID NO35的氨基酸51-67有至少b％序列相同性的的氨基酸序列；-C-是與SEQ ID NO35的氨基酸68-70有至少c％序列相同性的的氨基酸序列；-D-是與SEQ ID NO35的氨基酸71-91有至少d％序列相同性的的氨基酸序列；-E-是與SEQID NO35的氨基酸92-119有至少e％序列相同性的的氨基酸序列；-F-是與SEQ IDNO35的氨基酸120-183有至少f％序列相同性的的氨基酸序列；-G-是與SEQ ID NO35的氨基酸184-256有至少g％序列相同性的的氨基酸序列，條件是-B-、-D-或-F-中的至少一種在所述蛋白質(zhì)中不存在。
a的值為50或更大。b的值為50或更大。c的值為50或更大。d的值為50或更大。e的值為50或更大。f的值為50或更大。g的值為50或更大。a、b、c、d、e、f和g的值相互獨(dú)立，通常為60、70、80、90、95、96、97、98、99或100。
本發(fā)明還提供了編碼這些突變型HadA蛋白的核酸。本發(fā)明還提供了表達(dá)所述核酸(a)的嗜血桿菌，該菌在其表面呈遞所述突變型HadA蛋白且不能結(jié)合和/或進(jìn)入人上皮細(xì)胞。
可通過同源重組(例如用等基因刪除技術(shù))將這種突變體引入靶嗜血桿菌以除去天然hadA序列。
藥物組合物本發(fā)明提供了含有(a)本發(fā)明的肽和(b)藥用載體的藥物組合物。
組分(a)是組合物的活性組分，并以治療有效量(例如足以抑制腦膜炎球菌或嗜血桿菌感染的量)存在。特定患者的精確有效量取決于他們的體形大小和健康狀況、感染的本質(zhì)和程度、以及所選用于給藥的組合物或組合物的組合。有效量可通過常規(guī)試驗(yàn)確定，并在臨床醫(yī)生的判斷范圍之中。出于本發(fā)明的目的，有效劑量通常約為0.01mg/kg到5mg/kg，或約0.01mg/kg到50mg/kg，或約0.05mg/kg到10mg/kg?；陔牡乃幬锝M合物是本領(lǐng)域熟知的(例如FUZEONTM)。組合物中可含有鹽和/或酯形式的肽。
載體(b)可以是本身不誘導(dǎo)對接受組合物的個體有害的抗體產(chǎn)生且給予后不會產(chǎn)生過度毒性的任何物質(zhì)。合適的載體一般是大的、緩慢代謝的大分子，例如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和無活性病毒粒子。這種載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。藥學(xué)上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等也可存在于這種載體中。脂質(zhì)體是合適的載體。藥學(xué)上可接受的載體的詳盡討論見參考文獻(xiàn)33。
腦膜炎球菌和嗜血桿菌感染影響身體的不同區(qū)域，因此本發(fā)明的組合物可制成各種形式。例如，可將組合物制成可注射形式，可以是液體溶液或懸液。也可制成適合在注射之前溶于或懸浮于液體載體的固體形式。組合物可被制成局部給藥形式，如制成軟膏劑、霜劑或粉劑。組合物可被制成口服給藥形式，如制成片劑、膠囊或糖漿劑(任選經(jīng)調(diào)味)。組合物可被制成肺部給藥形式，如制成使用細(xì)粉或噴霧的吸入器。組合物可被制成栓劑或陰道栓。組合物可被制成鼻、耳或眼部給藥形式，如制成滴劑、噴霧或粉劑{例如34}。組合物可含在漱口藥中。組合物可被凍干。
藥物組合物優(yōu)選是無菌的。優(yōu)選是無熱原的。優(yōu)選是經(jīng)過緩沖的，例如pH在6和8之間，通常約為7。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明藥物組合物的遞藥裝置。所述裝置可以是，例如，注射器或吸入器。
本發(fā)明的肽可與一種或多種抗生素共同給予，優(yōu)選與具有抗腦膜炎球菌和/或嗜血桿菌活性的抗生素共同給予。因此本發(fā)明的組合物可含有一種或多種抗生素。
醫(yī)學(xué)治療和應(yīng)用本發(fā)明提供了用作藥物的本發(fā)明的化合物。本發(fā)明還提供了治療被腦膜炎球菌和/或嗜血桿菌感染的患者的方法，該方法包括給予所述患者本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的化合物在制造用于治療患者的藥物中的應(yīng)用。
患者優(yōu)選是人。人可以是成人或優(yōu)選兒童。用于兒童的組合物也可給予成人，例如來評估安全性、劑量、免疫原性等。
本發(fā)明組合物一般直接給予患者。可通過胃腸外注射(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或注射到組織的胞間隙中)，或通過直腸、口服(例如片劑、噴霧)、陰道、局部、透皮{例如見參考文獻(xiàn)35}或經(jīng)皮{例如見參考文獻(xiàn)36和37}、鼻內(nèi){例如見參考文獻(xiàn)38}、眼部、耳部、肺部或其它粘膜給藥來實(shí)現(xiàn)直接遞送。
劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。
本發(fā)明的應(yīng)用和方法可以是治療性應(yīng)用(例如用于治療已有的細(xì)菌性和腦膜炎球菌性腦膜炎或BPF)或預(yù)防性應(yīng)用(例如用于可能接觸微生物以及要預(yù)防感染的情況)。優(yōu)選治療性應(yīng)用，并且可通過在給予本發(fā)明的藥物組合物之后監(jiān)測細(xì)菌滴度或通過監(jiān)測癥狀來測試治療功效。
方法本發(fā)明還提供了制造本發(fā)明的肽的方法，包括在誘導(dǎo)所述肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明提供了制造本發(fā)明的肽的方法，包括通過化學(xué)方法合成所述肽的步驟。所述肽可完全或部分通過這種化學(xué)方法合成。
概述術(shù)語“含有”包括“包含”以及“由……構(gòu)成”，例如“含有”X的組合物可僅由X構(gòu)成或可包含其它的物質(zhì)，例如X+Y。
與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語“約”表示，例如x±10％。
“基本上”不排除“完全”，例如“基本上無”Y的組合物可完全無Y。“基本上”可視需要從本發(fā)明定義中省去。
提及兩個氨基酸序列之間的序列相同性百分比時是指，當(dāng)比對時，比較兩個序列時相同的氨基酸的百分比。這種比對和同源性百分比或序列相同性可用本領(lǐng)域已知的軟件程序來確定，例如參考文獻(xiàn)39的7.7.18節(jié)所描述的那些。優(yōu)選的比對可用仿射(affine)缺口檢索通過Smith-Waterman同源性檢索算法確定，缺口開放罰分為12，缺口延伸罰分為2，BLOSUM矩陣為62。Smith-Waterman同源性檢索算法描述于參考文獻(xiàn)40。
在肽序列中使用“NH2”和“COOH”僅表示肽鏈從N-末端到C-末端的方向，而不表示N-末端殘基必需是游離-NH2基團(tuán)，或者C-末端必需是游離-COOH基團(tuán)(盡管不排除這種情況)。相反，N-和C-末端可被共價修飾。
本發(fā)明的化合物優(yōu)選可抑制(a)NadA HR1和NadA HR2的相互作用，或(b)HadAHR1和HadAHR2的相互作用。
本發(fā)明化合物和NadA/HadA之間的結(jié)合相互作用是特異的。特異性在文中不表示該化合物不結(jié)合NadA/HadA之外的分子(例如它可結(jié)合其它粘附素或表面蛋白)，而是指該化合物在背景(即非特異性)水平之上結(jié)合NadA/HadA。例如，該化合物與NadA/HadA的結(jié)合較之與白蛋白、球蛋白等蛋白質(zhì)的結(jié)合更加緊密。
附圖簡述圖1顯示了來自菌株MC58的NadA，感興趣的區(qū)域高亮顯示。
圖2顯示了SARS E2(圖2A)和NadA(圖2B)的螺旋輪分析(helical wheel analysis)。
圖3顯示了(3A)流感HA和(3B)HadA的構(gòu)象變化模型。
序列表簡述

執(zhí)行本發(fā)明的模式腦膜炎球菌NadA參考文獻(xiàn)3公開了奈瑟氏菌屬粘附素A-腦膜炎奈瑟氏球菌的一種表面蛋白一的細(xì)節(jié)。給出了來自26種不同腦膜炎球菌菌株的NadA序列，其中包括血清群A、B和C的菌株。可將序列分成三種不同等位基因。
在腦膜炎奈瑟氏球菌超毒譜系III、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、乳糖奈瑟氏球菌(N,lactamica)或灰色奈瑟氏球菌(N.cinerea)中未發(fā)現(xiàn)NadA。公開的腦膜炎球菌菌株Z2491血清群A的序列也不存在NadA。不同的序列已存儲在GenBank，也可見于參考文獻(xiàn)41的SEQ ID NO1-14。
基于公開的序列和特征，技術(shù)人員能夠鑒定腦膜炎球菌任何給定菌株的NadA序列(或其不存在)。
文中，SEQ ID NO1是菌株MC58的NadA序列，它具有等位基因“1”。SEQ IDNO2是菌株2996的NadA序列，它具有等位基因“3”。這兩個序列的比對如下102030405060等位基因-3MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDI|||||||||||||||||||||||||:||||||||||||:|||||||||||||||||||||等位基因-1MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDI102030405060708090 100 110 120等位基因-3DEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTT||||||||:|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||等位基因-1GEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTT708090 100 110 120130 140 150 160 170 180等位基因-3KLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||等位基因-1KLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240等位基因-3AFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||等位基因-1AFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANT190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300等位基因-3AADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDT||||||||||||||||||||||| :||| ||| :
等位基因-1AADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAK--NSARI-------------------------250 260 270310 320 330 340 350 360等位基因-3RLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGG::|||:|::|||||||||||||||||||||||||||||||||||等位基因-1----------------DSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGG280 290 300 310370 380 390 400等位基因-3YKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||等位基因-1YKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW320 330 340 350 360
參考文獻(xiàn)3顯示NadA具有膜錨，蛋白質(zhì)在腦膜炎球菌的膜中裝配以形成通過卷曲螺旋域相連的寡聚體。
SARS冠狀病毒刺突蛋白已經(jīng)報(bào)道了SARS冠狀病毒的E2刺突蛋白。該蛋白的氨基酸序列在文中示于SEQID NO18。SEQ ID NO1和18(即NadA和E2)的CLUSTALW比對顯示少于6％相同708090 100 110 120| | | | | |NadA-----------------------------------------------------MSMKHFPSARSPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNS130 140 150 160 170 180| | | | | |NadASKVLTTAILATFCSGALAATSD--------------------------------------SARSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFK190 200 210 220 230 240| | | | | |NadA-----------------------DDVKKAAT--------------------VAIVAAYNNSARSHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSP250 260 270 280 290 300| | | | | |NadAGQEING----------FKAGETIYDIGEDGTIT--------------------------- ...
SARSAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIY ...
370 380 390 400 410 420| | | | | |NadA--------------QKDATAADVEADDFKGLG--LKKVVTNLTKTVNE------------SARSFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCV430 440 450 460 470 480| | | | | |NadA---NKQNVDA-----------------KVKAAESEIEKLTT-------------------SARSLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLND490 500 510 520530 540| | | | ||NadA---------------------KLADTDAALADTDAALDETTN------------------SARSYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTP550 560 570 580 590 600| | | | | |NadA------ALNKLGENITTFAEETK----TNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDESARSSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQD610 620 630 640 650 660| | | | | |NadATN--------------------TKADEAVKTAN------EAKQTAEETKQNVDAKVKAAESARSVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASY
670 680 690 700 710 720| | | | | |NadATAAGKAEAAAG----------TANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSSARSHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDC730 740 750 760 770 780| | | | | |NadA------------------------LDKNVANLRKET-RQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNSARSNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFG790 800 810 820 830 840| | | | | |NadA---------------------------VTAAVGGYKSESAVAIG----TGFRFTENF---SARSGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGL850 860 870 880 890 900| | | | | |NadA----------------------AAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW------------ ...
SARSTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYE ...
因此，單純基于一級序列(是判斷進(jìn)化關(guān)系的有用標(biāo)準(zhǔn))，1255聚病毒SARS蛋白和364聚細(xì)菌NadA蛋白似乎不相關(guān)。
下面給出了SARS E2蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，其中C表示卷曲，H表示螺旋，E表示延伸序列10203040506070| | | | | | |MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHCeEEEEEEccCCCccceeeeCCCCCCCCCCCCCceEEEEEeCCcEEEEEEEEceEEEEEEeceEEcCeEeTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVceeeeCCCceeeEeCCccecCCCCCCceEEEEEEEEccCCCcEEEEEeCCCEEEEEEEEEeccCCCCCCCSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPCCCCCCeEEEEEEEcCCCCcEEEEEeeeEEEcCCCCCChhHHheEEEEeCCCEEEEEEcCCCCCCcCCCCSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQCCCccccccceEEEeeeeceeeeEEEeccCcCCCcCCccchHHhhhccceEEEEEcCCCCEEEEeccCCCNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVACCCceEEeCceEeeeCCcEEEeCCeEEEeCCEEEEEeCCCCCCCccceecCCCCCCccHHHhHHHhhcchDYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVhHHHHHHhhceEEeeeeceeececcccceeeEeEeeEEEcCCCeeecccCCCceEeecccceCCccceEELAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGEEEeCCCCCCcCCCCCCCCceccccCccCCccCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCceeccCCccYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDeeEEEEEEEEEeCCCCCcccCCCCcCCceEEeeeeEEEEeeccceeeeHHHHHHHhhHHHhheccCCCccSVRDPKTSEILDISPCSFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQcccccCCCcEEEEEEccCceEEEEEeCCCCCCCceEEeeecceEEEeCCCCcccCCCCccccCCCCcHHHTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFhhccceeeccCCCCCCCCCccCCCcceeEEeecceeeeeecCeEEEEEecCCCCCcccCCCCeEEeeCccSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMEcccceEEEEEeCCceeecccccccCChHHHHHHHHHHhHHHHHHHHHHHHHHHHhhchHHHHHHHHHhC
YKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLCeeeEEecCCceecccCCCCCCCcCChHHHHHHHhccceeeeccceccccccCCCcccccEEEEEEcCCcTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNEeccCCCCcHHHHHHHHHHHhhhcCCCchhHhhHHHhccceeEeEhhhcCCcchhhHHHHHHHHHHHHHHKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITHHHHHHHHhhHhHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHhcchHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVHHHHHHHHHHHHHHhHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHhcccceccccchhHhheeeccCCCcEEEEEEEEEPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYECceeeeeccCCeeeeeeeecccCcEEEecCCEEEEcCCCccCCCcccCCCEEEEEEEEEEEeCCceecCDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDFGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQcCCCCCCcHHHHHHHHHHHhCCCCCCCCCcCcceeEeeeccHHHHHHHHHHHHHHhcchhhHHhCCcEEEYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTEecchHHHHHHHHHHHHhheeEEEEEEEeCCCCcceecCCCCCCCcccCCCCCCeEEcccEEEcC二級結(jié)構(gòu)顯示，SARS E2蛋白(以及實(shí)際上許多其它有包膜病毒的融合蛋白)類似于NadA中所存在的MSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQCCCCCCCcHHHHHHHHHHHHhHhhhccCCHHHHHHHHHhhhhhhcCcceeecccCCeEeeccCCCCceecKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDEchhhHHhhhHHhhhhCCCeeeehHHHHHHHhhhchHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHhcccccchHhcccTTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQcHHHHHHhcccHhHHHHhhccCccccchhHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHhhchHHHHHHHHhccHHHTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHhhecCCCchHHHHhcccceEEEEehHHHHhcCCCccccCCcchHHHHHNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHhcCCCCcceeEEEEEeCCCchhheeecCCccchhHHHHHhCCcEEEcCCGSSAAYHVGVNYEWCCcceeeeCeeecC二級結(jié)構(gòu)水平的這種類似性提示發(fā)明人，NadA可能具有病毒刺突蛋白的一些功能特征。具體地說，最近已顯示HR2序列能抑制冠狀病毒的進(jìn)入以及膜融合{42}，正如從FUZEONTM在HIV中的作用可以看出，因此發(fā)明人關(guān)注NadA以了解融合、HR1和HR2序列的可能位置。
NadA融合序列和七殘基重復(fù)序列下面顯示了各種病毒刺突蛋白的融合肽序列，其后是共有序列MHV刺突(971)KMIASAFNNALGAIQDGFD SEQ ID NO19BCV刺突 (1015)KLIANAFNNALDAIQEGFD SEQ ID NO20FIPV刺突 (1079)KILANAFNNAIGNITLALG SEQ ID NO21TGEV刺突 (1060)QILASAFNQAIGNITQSFG SEQ ID NO22Avian IBV刺突 (795)EKIAASFNKAIGHMQEGFR SEQ ID NO23HCoV 229E刺突 (792)KILAASFNKAMTNIVDAFT SEQ ID NO24HCoV OC43刺突 (1005)KLIANAFNNALYAIQEGFD SEQ ID NO25SARS 手性子刺突(903)KQIANQFNKAISQIQESLT SEQ ID NO26共有序列 (1123)KIIANAFNNAIGNIQEGF SEQ ID NO27該共有序列被用來鑒定NadA(SEQ ID NO1和2)中的融合序列
179 KH-AEAFNDIADSLDETNT 196SEQ ID NO28| | |||::: : | |2 KIIANAFNNAIGNIQEGLT 19 SEQ ID NO34考慮到與SARS融合序列的類似性以及肽序列螺旋序列的兩親性，可將序列SEQID NO28和SEQ ID NO3鑒定為融合序列。將這兩個序列組合得到了SEQ ID NO33.
圖2顯示了E2(殘基903-921)和NadA(殘基181-199)的螺旋輪投影。疏水面清晰可見(框出的殘基)。
如圖1所示，在NadA(SEQ ID NO1)中鑒定了七殘基重復(fù)序列。
HR1序列對應(yīng)于SEQ ID NO1的殘基117-152，顯示為在a和d位置上有合適殘基的規(guī)則abcdefg七殘基重復(fù)。SEQ ID NO2的HR1序列略有不同，具有Ala/Glu取代(比較SEQ ID NO5和6；SEQ ID NO4)。
觀察到兩個可能的HR2序列，第一個(HR2a)短于第二個(HR2b)。HR2a序列對應(yīng)于SEQ ID NO1的殘基261-275，HR2b對應(yīng)于殘基278-299。HR2a序列所存在的區(qū)域與NadA等位基因1和3比對顯示有明顯的缺口，這反應(yīng)在HR2a序列的C-末端(比較SEQ ID NO7和8)。HR2b序列位于插入下游且更加密切相關(guān)(比較SEQ IDNO10和11；SEQ ID NO9)。
NadA HR1和HR2肽基于腦膜炎球菌NadA和SARS冠狀病毒刺突蛋白(見上文)之間的驚人關(guān)系、最近鑒定的HR2肽對防止冠狀病毒進(jìn)入的功效{42}、以及已知的HR2肽對阻止HIV活性的功效(即FUZEONTM)，化學(xué)合成了作為寡肽的NadA的HR1和HR2序列以測試抗腦膜炎球菌的功效。
序列取自NadA(來自SEQ ID NO2)的等位基因“3”。HR1寡肽為SEQ ID NO29。HR2a寡肽為SEQ ID NO30。HR2b寡肽為SEQ ID NO31。這些序列各自基于在N-和C-末端方向上延伸3個氨基酸的“核心”序列(SEQ ID NO6，8和11)。
還制備了基于融合肽的寡肽(SEQ ID NO32)。
HadA HR1和HR2肽來自BPF克隆F3031的全長HadA序列示于SEQ ID NO35。對該序列進(jìn)行分析顯示有前導(dǎo)序列(氨基酸1-26)、可能的融合序列(51-67；SEQ ID NO36)、HR1序列(71-21；SEQ ID NO37)、HR2序列(120-183；SEQ ID NO38)和膜錨(186-256)。這些特征如下所示，下劃線表示(i)融合序列中的疏水殘基或(ii)HR1和HR2中的七重復(fù)殘基1MKRNLLKQSVIAVLIGGTTVSNYALAQAQAQAQVKKDELSELKKQVKEMD51AAIDGILDDNIAYEAEVDAKLDQHSAALGRHTNRLNNTKTIAEKAKGDSS101 EALDKIEALEEQNDEFLADITALEEGVDGLDDDITGIQDNISDIEDDINQ151 NSADIATNTAAIATHTQRLDNLDNRVNNLNKDLKRGLAAQAALNGLFQPY201 NVGKLNLTAAVGGYKSQTAVAVGTGYRYNENIAAKAGVAFTHGGSATYNV251 GVNFEW*流感病毒血球凝集素的pH依賴性構(gòu)象改變模型示于圖3A，圖3B顯示了HadA中的等價構(gòu)象改變(以及通過模擬NadA)是如何涉及粘附的。
制備合成序列SEQ ID NO39和SEQ ID NO40用于融合研究。
應(yīng)理解，僅通過舉例的方式描述了本發(fā)明，可對其作出修飾而仍在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)。
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275 280 285Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe Gln290 295 300Pro Tyr Asn Val Gly Arg Phe Asn Val Thr Ala Ala Val Gly Gly Tyr305 310 315 320Lys Ser Glu Ser Ala Val Ala Ile Gly Thr Gly Phe Arg Phe Thr Glu325 330 335Asn Phe Ala Ala Lys Ala Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser340 345 350Ser Ala Ala Tyr His Val Gly Val Asn Tyr Glu Trp355 360<210>2<211>405<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>2Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Thr1 5 10 15Phe Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lys Lys20 25 30Ala Ala Thr Val Ala Ile Ala Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gln Glu Ile35 40 45Asn Gly Phe Lys Ala Gly Glu Thr Ile Tyr Asp Ile Asp Glu Asp Gly50 55 60Thr Ile Thr Lys Lys Asp Ala Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp65 70 75 80Phe Lys Gly Leu Gly Leu Lys Lys Val Val Thr Asn Leu Thr Lys Thr85 90 95Val Asn Glu Asn Lys Gln Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala Glu100 105 110Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala115 120 125Leu Ale Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu Asn130 135 140Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lys Thr Asn145 150 155 160Ile Val Lys Ile Asp Glu Lys Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr Val Asp165 170 175Lys His Ala Glu Ala Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr180 185 190Asn Thr Lys Ala Asp Glu Ala Val Lys Thr Ala Asn Glu Ala Lys Gln195 200 205Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gln Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala210 215 220Glu Thr Ala Ala Gly Lys Ala Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala Asn Thr225 230 235 240Ala Ala Asp Lys Ala Glu Ala Val Ale Ala Lys Val Thr Asp Ile Lys245 250 255Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ser260 265 270
Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu Glu Ser Asp Ser Lys Phe Val Arg Ile275 280 285Asp Gly Leu Asn Ala Thr Thr Glu Lys Leu Asp Thr Arg Leu Ala Ser290 295 300Ala Glu Lys Ser Ile Ala Asp His Asp Thr Arg Leu Asn Gly Leu Asp305 310 315 320Lys Thr Val Ser Asp Leu Arg Lys Glu Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu325 330 335Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe Gln Pro Tyr Asn Val Gly Arg Phe340 345 350Asn Val Thr Ala Ala Val Gly Gly Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Val Ala355 360 365Ile Gly Thr Gly Phe Arg Phe Thr Glu Asn Phe Ala Ala Lys Ala Gly370 375 380Val Ala Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ala Tyr His Val Gly385 390 395 400Val Asn Tyr Glu Trp405<210>3<211>19<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>3Ala Glu Ala Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr Asn Thr1 5 10 15Lys Ala Asp<210>4<211>36<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>4Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Xaa Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lys Leu20 25 30Gly Glu Asn Ile35<210>5<211>36<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>5Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Glu Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lys Leu20 25 30Gly Glu Asn Ile35<210>6<211>36<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>6Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala1 5 10 15Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lys Leu20 25 30Gly Glu Asn Ile35<210>7<211>15<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>7Ile Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Ser Ala Arg Ile1 5 10 15<210>8<211>17<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>8Ile Ala Thr Asn Lys Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ser Ala Asp1 5 10 15Val<210>9<211>22<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>9Leu Asp Lys Xaa Val Xaa Xaa Leu Arg Lys Glu Thr Arg Gln Gly Leu1 5 10 15Ala Glu Gln Ala Ala Leu20<210>10<211>22<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>10Leu Asp Lys Asn Val Ala Asn Leu Arg Lys Glu Thr Arg Gln Gly Leu1 5 10 15Ala Glu Gln Ala Ala Leu20<210>11<211>22<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>11Leu Asp Lys Thr Val Ser Asp Leu Arg Lys Glu Thr Arg Gln Gly Leu1 5 10 15Ala Glu Gln Ala Ala Leu20<210>12<211>46<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>12Ala Ala Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr
1 5 10 15Asp Ale Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Glu Thr Thr Asn20 25 30Ala Leu Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr Thr Phe Ala Glu35 40 45<210>13<211>46<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>13Ala Ala Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr1 5 10 15Asp Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Ala Thr Thr Asn20 25 30Ala Leu Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr Thr Phe Ala Glu35 40 45<210>14<211>25<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>14Asp Ile Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn1 5 10 15Ser Ala Arg Ile Asp Ser Leu Asp Lys20 25<210>15<211>27<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>15Asp Ile Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys Asp Asn Ile Ala Lys Lys1 5 10 15Ala Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu Glu20 25<210>16<211>32<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>16Ala Arg Ile Asp Ser Leu Asp Lys Asn Val Ala Asn Leu Arg Lys Glu1 5 10 15Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe Gln20 25 30<210>17<211>32<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>17Thr Arg Leu Asn Gly Leu Asp Lys Thr Val Ser Asp Leu Arg Lys Glu1 5 10 15Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe Gln20 25 30<210>18
<211>1255<212>PRT<213>SRAS冠狀病毒<400>18Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Vel Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Vel Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Vel Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 655 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930 935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980 985 990Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala995 10001005Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe101010151020Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His1025103010351040Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn104510501055Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro106010651070Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln107510801085Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val109010951100Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr1105111011151120Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys112511301135Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Phe Gly Asp Ile Ser114011451150Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu
115511601165Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu117011751180Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu1185119011951200Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu120512101215Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys122012251230Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys123512401245Gly Val Lys Leu His Tyr Thr12501255<210>19<211>19<212>PRT<213>小鼠肝炎病毒<400>19Lys Met Ile Ala Ser Ala Phe Asn Asn Ala Leu Gly Ala Ile Gln Asp1 5 10 15Gly Phe Asp<210>20<211>19<212>PRT<213>牛冠狀病毒<400>20Lys Leu Ile Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ala Leu Asp Ala Ile Gln Glu1 5 10 15Gly Phe Asp<210>21<211>19<212>PRT<213>貓傳染性腹膜炎病毒<400>21Lys Ile Leu Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ala Ile Gly Asn Ile Thr Leu1 5 10 15Ala Leu Gly<210>22<211>19<212>PRT<213>傳染性胃腸炎冠狀病毒<400>22Gln Ile Leu Ala Ser Ala Phe Asn Gln Ala Ile Gly Asn Ile Thr Gln1 5 10 15Ser Phe Gly<210>23<211>19<212>PRT<213>鳥傳染性支氣管炎病毒<400>23
Glu Lys Ile Ala Ala Ser Phe Asn Lys Ala Ile Gly His Met Gln Glu1 5 10 15Gly Phe Arg<210>24<211>19<212>PRT<213>人冠狀病毒229E<400>24Lys Ile Leu Ala Ala Ser Phe Asn Lys Ala Met Thr Asn Ile Val Asp1 5 10 15Ala Phe Thr<210>25<211>19<212>PRT<213>人冠狀病毒OC43<400>25Lys Leu Ile Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ala Leu Tyr Ala Ile Gln Glu1 5 10 15Gly Phe Asp<210>26<211>19<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>26Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu1 5 10 15Ser Leu Thr<210>27<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>冠狀病毒共有序列<400>27Lys Ile Ile Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ala Ile Gly Asn Ile Gln Glu1 5 10 15Gly Phe<210>28<211>18<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>28Lys His Ala Glu Ala Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr1 5 10 15Asn Thr<210>29<211>42<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>29Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala1 5 10 15Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu20 25 30Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr Thr Phe35 40<210>30<211>23<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>30Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn1 5 10 15Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg20<210>31<211>28<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>31Leu Asn Gly Leu Asp Lys Thr Val Ser Asp Leu Arg Lys Glu Thr Arg1 5 10 15Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu20 25<210>32<211>24<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>32Thr Val Asp Lys His Ala Glu Ala Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu1 5 10 15Asp Glu Thr Asn Thr Lys Ala Asp20<210>33<211>21<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>33Lys His Ala Glu Ala Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr1 5 10 15Asn Thr Lys Ala Asp20<210>34<211>19<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>34Lys Ile Ile Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ala Ile Gly Asn Ile Gln Glu1 5 10 15Gly Leu Thr<210>35<211>256<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)埃及生物群
<400>35Met Lys Arg Asn Leu Leu Lys Gln Ser Val Ile Ala Val Leu Ile Gly1 5 10 15Gly Thr Thr Val Ser Asn Tyr Ala Leu Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala20 25 30Gln Val Lys Lys Asp Glu Leu Ser Glu Leu Lys Lys Gln Val Lys Glu35 40 45Met Asp Ala Ala Ile Asp Gly Ils Leu Asp Asp Asn Ile Ala Tyr Glu50 55 60Ala Glu Val Asp Ala Lys Leu Asp Gln His Ser Ala Ala Leu Gly Arg65 70 75 80His Thr Asn Arg Leu Asn Asn Leu Lys Thr Ile Ala Glu Lys Ala Lys85 90 95Gly Asp Ser Ser Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Ala Leu Glu Glu Gln100 105 110Asn Asp Glu Phe Leu Ala Asp Ile Thr Ala Leu Glu Glu Gly Val Asp115 120 125Gly Leu Asp Asp Asp Ile Thr Gly Ile Gln Asp Asn Ile Ser Asp Ile130 135 140Glu Asp Asp Ile Asn Gln Asn Ser Ala Asp Ile Ala Thr Asn Thr Ala145 150 155 160Ala Ile Ala Thr His Thr Gln Arg Leu Asp Asn Leu Asp Asn Arg Val165 170 175Asn Asn Leu Asn Lys Asp Leu Lys Arg Gly Leu Ala Ala Gln Ala Ala180 185 190Leu Asn Gly Leu Phe Gln Pro Tyr Asn Val Gly Lys Leu Asn Leu Thr195 200 205Ala Ala Val Gly Gly Tyr Lys Ser Gln Thr Ala Val Ala Val Gly Thr210 215 220Gly Tyr Arg Tyr Asn Glu Asn Ile Ala Ala Lys Ala Gly Val Ala Phe225 230 235 240Thr His Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Asn Val Gly Val Asn Phe Glu Trp245 250 255<210>36<211>17<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)埃及生物群<400>36Ala Ala Ile Asp Gly Ile Leu Asp Asp Asn Ile Ala Tyr Glu Ala Glu1 5 10 15Val<210>37<211>21<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)埃及生物群<400>37Leu Asp Gln His Ser Ala Ala Leu Gly Arg His Thr Asn Arg Leu Asn1 5 10 15Asn Leu Lys Thr Ile20
<210>38<211>64<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)埃及生物群<400>38Ile Thr Ala Leu Glu Glu Gly Val Asp Gly Leu Asp Asp Asp Ile Thr1 5 10 15Gly Ile Gln Asp Asn Ile Ser Asp Ile Glu Asp Asp Ile Asn Gln Asn20 25 30Ser Ala Asp Tle Ala Thr Asn Thr Ala Ala Ile Ala Thr His Thr Gln35 40 45Arg Leu Asp Asn Leu Asp Asn Arg Val Asn Asn Leu Asn Lys Asp Leu50 55 60<210>39<211>40<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)埃及生物群<400>39Val Asp Ala Lys Leu Asp Gln His Ser Ala Ala Leu Gly Arg His Thr1 5 10 15Asn Arg Leu Asn Asn Leu Lys Thr Ile Ala Glu Lys Ala Lys Gly Asp20 25 30Ser Ser Glu Ala Leu Asp Lys Ile35 40<210>40<211>69<212>PRT<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)埃及生物群<400>40Phe Leu Ala Asp Ile Thr Ala Leu Glu Glu Gly Val Asp Gly Leu Asp1 5 10 15Asp Asp Ile Thr Gly Ile Gln Asp Asn Ile Ser Asp Ile Glu Asp Asp20 25 30Ile Asn Gln Asn Ser Ala Asp Ile Ala Thr Asn Thr Ala Ala Ile Ala35 40 45Thr His Thr Gln Arg Leu Asp Asn Leu Asp Asn Arg Val Asn Asn Leu50 55 60Asn Lys Asp Leu Lys6權(quán)利要求
1.一種化合物，其能結(jié)合腦膜炎球菌表面NadA粘附素的七殘基重復(fù)序列HR1和/或HR2，從而抑制腦膜炎球菌感染宿主生物或傳播已存在的感染的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，按照SEQ ID NO1的編號，HR1序列是殘基117-152，HR2序列是殘基261-299。
3.一種化合物，其能結(jié)合嗜血桿菌表面HadA粘附素的七殘基重復(fù)序列HR1和/或HR2，從而抑制嗜血桿菌感染宿主生物或傳播已存在的感染的能力。
4.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，按照SEQ ID NO35的編號，HR1序列是殘基71-91，HR2序列是殘基120-183。
5.如上述任一權(quán)利要求所述的化合物，其特征在于，所述化合物是寡肽。
6.如權(quán)利要求5所述的寡肽，其特征在于，所述寡肽由不多于50個氨基酸構(gòu)成。
7.如權(quán)利要求5或6所述的寡肽，其包含選自下組的氨基酸序列的5個或更多連續(xù)氨基酸構(gòu)成的片段SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO39或SEQ ID NO40。
8.如權(quán)利要求7所述的寡肽，前提是，與所述SEQ ID相比所述片段含有m個氨基酸取代，其中的m是1或更大。
9.如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的寡肽，其包含一個或多個以下氨基酸序列SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ IDNO31、SEQ ID NO37或SEQ ID NO38。
10.式NH2-A-(B-C)n-D-COOH的多肽，其中n是1-5的整數(shù)，-A-是由1個或多個氨基酸構(gòu)成的任意N-末端序列；(各)-B-是含有SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16和/或SEQ ID NO17的5個或更多連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列；(各)-C-是由1個或多個氨基酸構(gòu)成的任意接頭序列；-D-是由1個或多個氨基酸構(gòu)成的任意C-末端序列。
11.如權(quán)利要求3-9中任一項(xiàng)所述寡肽的肽模擬化合物，其特征在于，所述肽模擬化合物具有抗-腦膜炎球菌和/或抗-嗜血桿菌活性。
12.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有(a)如上述任一權(quán)利要求所述的化合物和(b)藥用載體。
13.一種治療被腦膜炎球菌或嗜血桿菌感染的患者的方法，所述方法包括給予所述患者如權(quán)利要求12所述的藥物組合物。
14.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的化合物，所述化合物用作藥物。
15.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的化合物在制造用于治療患者的藥物中的用途。
16.一種突變型NadA蛋白，其特征在于，所述突變型蛋白缺少HR1、HR2或融合序列中的一個或多個。
17.如權(quán)利要求16所述的突變型NadA蛋白，其特征在于，所述蛋白不含以下氨基酸序列中的一個或多個(i)與SEQ ID NO3至少50％相同的序列；(ii)與SEQID NO5至少50％相同的序列；(iii)與SEQ ID NO7至少50％相同的序列；(iv)與SEQ ID NO10至少50％相同的序列。
18.如權(quán)利要求17所述的突變體，其特征在于，所述氨基酸序列(i)、(ii)、(iii)和(iv)各自至少有10個氨基酸長。
19.如權(quán)利要求16所述的突變型NadA蛋白，其包含氨基酸序列-A-B-C-D-E-F-G-H-I-，其中-A-是與SEQ ID NO1的氨基酸26-116有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-B-是與SEQ ID NO1的氨基酸117-152有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-C-是與SEQ ID NO1的氨基酸153-180有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-D-是與SEQ ID NO1的氨基酸181-199有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-E-是與SEQ ID NO1的氨基酸200-260有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-F-是與SEQ ID NO1的氨基酸261-275有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-G-是與SEQ ID NO1的氨基酸276-277有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-H-是與SEQ ID NO1的氨基酸278-299有至少50％序列相同性的的氨基酸序列；-I-是與SEQ ID NO1的氨基酸300-364有至少50％序列相同性的的氨基酸序列，條件是-B-、-D-、-F-或-H-中的至少一種在所述蛋白質(zhì)中不存在。
20.一種突變型HadA蛋白，其特征在于，所述突變蛋白缺少HR1、HR2或融合序列中的一個或多個。
21.一種編碼如權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)所述突變蛋白的核酸。
22.一種表達(dá)權(quán)利要求21所述核酸的細(xì)菌。
全文摘要
腦膜炎奈瑟氏球菌中的已知表面粘附素(NadA)，其含有存在于病毒包膜蛋白中的融合肽、HR1重復(fù)和HR2重復(fù)所對應(yīng)的序列。因此可用融合抑制劑來抑制腦膜炎球菌感染，本發(fā)明提供了一種能結(jié)合腦膜炎球菌表面NadA粘附素的七殘基重復(fù)序列HR1和/或HR2，從而抑制腦膜炎球菌感染宿主生物或傳播已存在的感染的化合物。
文檔編號A61P31/00GK1997662SQ200580022686
公開日2007年7月11日 申請日期2005年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月6日
發(fā)明者V·馬斯格阿尼, R.拉普奧里, B.卡普奇, S.薩維諾, M.B.阿科 申請人:啟龍有限公司