專(zhuān)利名稱(chēng)：融合蛋白及其制備方法、編碼該蛋白的dna序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、含有該蛋白的藥物 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種含有促胰島素分泌素的融合蛋 白及其制備方法、編碼該融合蛋白的DNA序列、含有該DNA序列的表達(dá)載體、含有該表達(dá)載 體的宿主細(xì)胞、和含有該融合蛋白的藥物組合物。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見(jiàn)的代謝內(nèi)分泌病，其基本病理為胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足和 胰升糖素活性增高所引起的代謝紊亂。糖尿病主要分為胰島素依賴(lài)型(I型)糖尿病、非 胰島素依賴(lài)型(II型)糖尿病、與營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的糖尿病和繼發(fā)性糖尿病四種，其中II型 糖尿病占90%以上。II型糖尿病的發(fā)病機(jī)理為基因缺陷基礎(chǔ)上存在胰島素抵抗為主并伴 有胰島素分泌缺陷或胰島素分泌缺陷為主并伴有胰島素抵抗和肝臟葡萄糖產(chǎn)生增加，病理 上表現(xiàn)為胰島素分泌相對(duì)不足。目前主要的非胰島素治療產(chǎn)品是在飲食和運(yùn)動(dòng)治療不足以控制血糖的基礎(chǔ)上 應(yīng)用的降糖產(chǎn)品。II型糖尿病的治療以口服降糖藥為主，包括磺脲素藥物、雙胍類(lèi)藥物、 α -葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮衍生物類(lèi)、胰島素及其他一些藥物。在實(shí)際的臨床應(yīng)用 中，單一的治療很難達(dá)到長(zhǎng)期滿(mǎn)意地控制血糖，一般情況下多為多種藥物聯(lián)合應(yīng)用。但是隨著病程的延長(zhǎng)，口服降糖藥失效的問(wèn)題越來(lái)越引起臨床醫(yī)生的重視。每年 有5% 10%最初對(duì)口服降糖藥物治療有效者回變?yōu)槔^發(fā)失效，尤以磺脲類(lèi)藥物多見(jiàn)，其 發(fā)生頻率一般隨病程延長(zhǎng)而增多，因而在老年糖尿病患者中多見(jiàn)。對(duì)于這種病人，可以采用 胰島素補(bǔ)充治療，或停用口服藥而完全改用胰島素治療。促胰島素分泌素(EXendin-4，EX-4)是從大毒蜥口腔分泌物中分離出來(lái)的一種39 個(gè)氨基酸的多肽(Eng 等，J. Biol. Chem.，265 :20259-62,1990 ；Eng 等，J. Biol. Chem.，267 7402-05，1992)，其氨基酸序列與類(lèi)胰高血糖素肽(glucagon-like peptide, GLP-1)有 53%的同源性，并在多種動(dòng)物模型中表現(xiàn)出了與GLP-I類(lèi)似的抗糖尿病藥的作用(Goke等， J. Biol. Chem.，268 19650-55，1993)。這些作用包括刺激機(jī)體生成胰島素以降低血糖，抑 制進(jìn)食后胰高血糖素的釋放，減緩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收入血流的速率。臨床試驗(yàn)顯示Exendin-4 表現(xiàn)出良好的抗糖尿病和降血糖的作用，因此目前被認(rèn)為是腸促胰島素類(lèi)似物的第一類(lèi)治 療新藥。與現(xiàn)有的降糖藥相比，Exendin-4最大的優(yōu)勢(shì)在于其獨(dú)特的作用機(jī)制，它可以在高 血糖時(shí)刺激胰島素的分泌，而低血糖時(shí)不刺激胰島素的分泌，這樣就有效防止了低血糖的 發(fā)生，大大提高了用藥的安全性，減少了胰島素的用量，有效改善了患者的生活質(zhì)量及用藥 危險(xiǎn)性。肽類(lèi)藥物由于受體內(nèi)蛋白酶降解和腎臟快速清除作用，體內(nèi)半衰期較短，用藥周 期短。Exendin-4在臨床上需要每天注射兩針，給病患帶來(lái)極大的不便和痛苦。因此，開(kāi)發(fā) 長(zhǎng)效的制劑就具有十分重要的意義。
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IgG類(lèi)免疫球蛋白是人體血液中最豐富的蛋白，其半衰期可達(dá)21天。已有報(bào)道 顯示將IgG的Fc片段與其他蛋白融合，可顯著增加其他蛋白在體內(nèi)的生物活性和半衰期 (Capon等，Nature，337 :525-531,1989 ；Chamow等，Trends Biotechnol.，14 :52_60，1996)。 這種方法已經(jīng)應(yīng)用于一些臨床上很重要的細(xì)胞因子和可溶性受體，如sTNF-aR、LFA3、 CTLA-4、IL-2、IFN-a 等，并獲得了成功。人IgG各亞類(lèi)(G1、G2、G3、G4)具有不同的生物活性(稱(chēng)作效應(yīng)子功能)。這些效 應(yīng)子功能通常由與Fcy受體(FCYR)的相互作用或通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體1 (Clq)亞成分來(lái)介導(dǎo)， 其中所述的補(bǔ)體1亞成分識(shí)別并結(jié)合免疫球蛋白G或免疫球蛋白M的重鏈，啟動(dòng)經(jīng)典補(bǔ)體 途徑。與Fc γ R的結(jié)合可以導(dǎo)致抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，即抗體依賴(lài)細(xì)胞的細(xì)胞毒 作用(Antibody-d印endent cellularcytotoxicity, ADCC)；而與補(bǔ)體因子的結(jié)合可以導(dǎo) 致補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，即補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用(Complement-dependentcytotoxicity ，⑶C)。不同IgG亞類(lèi)的上述活性是不一樣的，IgGU IgG3、IgG4與Fc γ R受體結(jié)合活性較 強(qiáng)，其中IgGl最強(qiáng)，而IgG2幾乎沒(méi)有結(jié)合；IgGl、IgG3能有效結(jié)合Clq，并激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反 應(yīng)，IgG2對(duì)補(bǔ)體的固定作用很弱，而IgG4似乎在激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的能力方面相當(dāng)有缺陷 (Jefferis et al，Immunol. Rev.，163 :59-76,1998)。在僅利用Fc部分延長(zhǎng)半衰期的能力的異源融合蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)中，將Fc的效應(yīng)子 功能最小化是重要的，此時(shí)，IgG2 Fc是優(yōu)選的。同時(shí)，為了進(jìn)一步降低融合蛋白中Fc的功 能效應(yīng)，可對(duì)Fc 的功能區(qū)域進(jìn)行突變(Jefferis et al, Immunol. Rev.，163 =59-76,1998)。然而，目前并未見(jiàn)到有關(guān)IgG類(lèi)免疫球蛋白用于Exendin-4以改善其體內(nèi)半衰期 的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種活性得以保持、并且體內(nèi)半衰期得到改善的融合蛋 白。本發(fā)明的目的還在于提供編碼該融合蛋白的DNA序列。本發(fā)明的目的還在于提供含有該DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明的目的還在于提供含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的目的還在于提供含有該融合蛋白的藥物組合物。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包含1)促胰島素分泌素；2)連接肽；以及3)人 IgG2 Fc 突變體(mFc)；其中所述融合蛋白從N端到C端依次為促胰島素分泌素、連接肽和人IgG2 Fc突變體。優(yōu)選地，所述促胰島素分泌素為重組促胰島素分泌素，由其形成含有重組促胰島 素分泌素的融合蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)rEx-4-mFc)。優(yōu)選地，所述連接肽具有如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。所述人IgG2Fc突變體為人IgG2Fc的突變體，其包含322位的點(diǎn)突變-MG — GCG, 相應(yīng)的氨基酸突變?yōu)長(zhǎng)ys —Ala。此處Fc中氨基酸序列標(biāo)記322是按EU編號(hào)方式(Kabat， Ε. Α.等人，1991,《Sequences of proteins of Immunological Interest》，第五版，U. S. Dept. of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH 出版 91-3242)編排的。優(yōu) 選地，所述人IgG2 Fc突變體具有如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種分離的用于編碼所述融合蛋白的DNA序列，該DNA序列包含自 5’到3’端的用于依次編碼促胰島素分泌素、連接肽和人IgG2 Fc突變體的DNA。優(yōu)選地所 述DNA序列具有如SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種用于在CHO細(xì)胞中分泌表達(dá)SEQ ID NO :1所述的融合蛋白的氨 基酸序列(即在SEQ ID NO 1序列前插入人11-2信號(hào)肽序列)，其具有如SEQ ID NO 3所 示的序列。本發(fā)明還提供一種用于編碼SEQ ID NO 3所示的蛋白的DNA序列，該DNA序列為 如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種含有所述DNA序列的表達(dá)載體；優(yōu)選地所述表達(dá)載體為真核表 達(dá)載體；更優(yōu)選地所述真核表達(dá)載體為將所述DNA序列插入pAAV2-ne0的Kpn I/EcoR I位 點(diǎn)而形成的。本發(fā)明還提供一種含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地所述宿主細(xì)胞為CHO-Kl 細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種治療糖尿病的藥物組合物，其包含所述融合蛋白；以及藥學(xué) 上可接受的載體。優(yōu)選地，所述糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病、與營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的糖 尿病和繼發(fā)性糖尿病。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明所述的藥物組合物適用于多種給藥方式，例如 口服給藥、經(jīng)皮給藥、靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給藥 方式，可將本發(fā)明所述的藥物組合物制成各種合適的劑型，其中包含有效量的本發(fā)明所述 的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。合適劑型的實(shí)例為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服劑、用于皮膚表面的貼劑、氣霧齊U、
鼻噴劑、以及注射劑等。含有本發(fā)明所述的融合蛋白的藥物組合物可以制成溶液或者凍干粉末以用于胃 腸外給藥。凍干粉末在使用前可加入適當(dāng)溶劑或其他藥學(xué)上可接受的載體將粉末重新配 制。溶劑一般是緩沖液、等滲溶液和水溶液。劑型中還可含有其他常規(guī)組分，如防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、緩沖液、滲透壓調(diào) 節(jié)劑、乳化劑、增甜劑、著色劑、調(diào)味劑等。本發(fā)明所述的藥物組合物中使用的穩(wěn)定劑優(yōu)選 檸檬酸鈉、甘氨酸、甘露醇、神經(jīng)節(jié)糖苷等。一種示例性的藥物組合物注射液的配方包括 rEx-4-mFc 0. 01-5mg ；NaCl 8mg ；檸檬酸鈉!Bmg或磷酸鹽2. 15mg ；神經(jīng)節(jié)糖苷25_50mg或甘 氨酸15-30mg或甘露醇15-20mg ；注射用水1ml。若有特殊治療要求，本發(fā)明所述的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種 聯(lián)合使用有利于治療。本發(fā)明所述的藥物組合物中的融合蛋白的量可以在一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以根據(jù)一些已知的因素(諸如根據(jù)疾病的種類(lèi)、病情嚴(yán)重程度、病人體重、劑 型、給藥途徑等)很容易地加以確定。本發(fā)明還提供了所述融合蛋白的制備方法，該方法包括
提供用包含編碼所述融合蛋白的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 后的宿主細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心，然后將離心后的上清液依次用親和層析法、離子交換層 析法和分子篩層析法進(jìn)行純化，從而獲得所述融合蛋白。優(yōu)選地，所述親和層析法優(yōu)選使用rProtein A Sepharose FF親和層析柱，所述離 子交換層析法優(yōu)選使用Q Sepharose FF層析柱，所述分子篩層析法優(yōu)選使用Superdex 200 柱。本發(fā)明人選擇裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段，同時(shí)為了減低其補(bǔ)體依賴(lài)性 細(xì)胞毒性(CDC)，將第322位氨基酸Lys突變?yōu)锳la (Duncan等，Nature, 332 738-740， 1988)。經(jīng)過(guò)突變后的人IgG2Fc片段(mFc)通過(guò)一段連接肽接至Exendin-4的C-末端，構(gòu) 建Ex-4-mFc融合蛋白。融合蛋白通過(guò)人IgG Fc鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基連接，形成同源二 聚體。該同源二聚體類(lèi)似于人IgG分子但無(wú)CHl區(qū)域和輕鏈，其在體內(nèi)表現(xiàn)出來(lái)的藥代動(dòng) 力學(xué)性質(zhì)與相似種型的人源化單克隆抗體相似。因此，本發(fā)明所述的融合蛋白在體內(nèi)的半 衰期大大高于Exendin-4肽。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO中的高效表達(dá)， 且純化工藝簡(jiǎn)單，利于進(jìn)一步的大規(guī)模制備?？傊景l(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明所述的融合蛋白在動(dòng)物的藥代實(shí)驗(yàn)中顯示出顯著延長(zhǎng)的半衰期。2、本發(fā)明選擇突變的IgG2的Fc片段作為融合片段，從而避免副作用的產(chǎn)生。3、本發(fā)明所述的方法表達(dá)量高，穩(wěn)定性好，易于放大生產(chǎn)，成本低廉。4、本發(fā)明所述的工程細(xì)胞連續(xù)傳代100代后，仍能穩(wěn)定地分泌表達(dá)rEx-4-mFc融 合蛋白。通過(guò)滾瓶培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)30余 次的數(shù)據(jù)，表達(dá)量均在60 100mg/L/7d之間。每次細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模都在30 40L左右。 滾瓶培養(yǎng)方式的一個(gè)特點(diǎn)，就是便于在一定規(guī)模下放大生產(chǎn)，通?？煞奖愕胤糯蟮?50 400L。5、對(duì)于純化而言，由于本發(fā)明所述的融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清中含量高，而純化 工藝中的rProtein A Sepharose FF親和層析步驟具有很高的純化效率，每毫升凝膠可結(jié) 合50mg左右的融合蛋白，因此更易于放大生產(chǎn)。6、本發(fā)明所述的融合蛋白的臨床使用劑量很小，為微克級(jí)。因此，其成本更為低 廉
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圖1是重組質(zhì)粒pEx-4-mFc的構(gòu)建流程圖。圖2示出人IgG2 Fc的RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖(1 %的瓊脂糖凝膠電泳)，其中泳道 M 為分子量標(biāo)準(zhǔn)(IOObp DNA ladder (Invitrogen))，泳道 1 為 IgG2 Fc 的 RT-PCR 產(chǎn)物。
圖3示出真核表達(dá)載體pAAV2_neo。圖4示出重組質(zhì)粒pCR2. l-Ex-4-Fc的酶解產(chǎn)物的電泳圖(1 %的瓊脂糖凝膠電 泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(11Λ DNAladder (Invitrogen))，泳道1和3分別代表 陽(yáng)性克隆的Kpn I/EcoR I雙酶解產(chǎn)物，泳道2和4分別代表陽(yáng)性克隆的BamH I/EcoR I雙 酶解產(chǎn)物。圖5示出重組質(zhì)粒pEx-4-mFc的酶解產(chǎn)物的電泳圖(1 %的瓊脂糖凝膠電泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(11Λ DNAladder (Invitrogen))，泳道1和2分別代表陽(yáng)性克隆 的Kpn I/EcoR I雙酶解產(chǎn)物。圖6示出細(xì)胞基因組DNA的Εχ-4-mFc片段的PCR產(chǎn)物的電泳圖(1 %的瓊脂糖凝 膠電泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(llibplus DNA ladder (Invitrogen))，泳道Cl代 表CHO-Kl，泳道C2代表空載質(zhì)粒pAAV2-neo轉(zhuǎn)染CHO-Kl，泳道1_11代表2-E11的11個(gè)克 隆，C3代表Ex-4-mFc片段(陽(yáng)性對(duì)照)。圖7示出細(xì)胞總RNA的Εχ-4-mFc片段RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖(1 %的瓊脂糖凝膠 電泳)，其中泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(11Λ ρIusDNA ladder (Invitrogen))，泳道Cl代表 CHO-Kl，泳道C2代表空載質(zhì)粒pAAV2-neo轉(zhuǎn)染CHO-Kl，泳道1_11代表2-E11的11個(gè)克隆， C3代表Ex-4-mFc片段(陽(yáng)性對(duì)照)。圖8示出純化后蛋白的電泳圖(1%的瓊脂糖凝膠電泳)，其中泳道M為蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)(BenchMark Protein Ladder (Invitrogen))，泳道 1 代表上樣 1 μ g 的情況，泳道 2 代表上樣5yg的情況。圖9示出純化后蛋白的高效液相色譜圖。圖10示出rEx-4-mFc的免疫印跡分析結(jié)果，其中泳道M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) (SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard, Invitrogen),泳道 1 為 rEx-4-mFc。圖11示出rEx-4和rEx-4_mFc對(duì)刺激胰島瘤細(xì)胞cAMP產(chǎn)生的作用。圖12示出rEx-4和rEx-4-mFc對(duì)刺激胰島瘤細(xì)胞胰島素產(chǎn)生的作用。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式
的描述并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì) 本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只 要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。以下分子克隆技術(shù)操作方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均參照下列文獻(xiàn)進(jìn)行《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》(黃培堂等譯，[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社，2002)。DNA操作中所用的DNA 提取試劑盒(UNIQ-10)、DNA膠回收試劑盒(UNIQ-IO)及連接試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工 程技術(shù)服務(wù)有限公司。限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自i^ermentas Life Science公司，克隆載體pCR2. 1、 總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、克隆用大腸桿菌宿主JM109等均購(gòu)自hvitrogen公司。 LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨，0.5%酵母膏，NaCl ；LB瓊脂糖平板配方為蛋白胨， ；^酵母膏，丨^妝口二^瓊脂糖。其中蛋白胨和酵母膏購(gòu)自英國(guó)Oxid公司。實(shí)施例1連接有連接肽的Exendin-4目的基因及人IgG2 Fc片段基因的制備采用全基因合成的方法得到含信號(hào)肽、Exendin-4及G5S連接肽的目的蛋白的基 因(由上海生工公司合成)，其核苷酸序列如SEQ IDNO :7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 8 所示。其中，在核苷酸序列的5’端包含人11-2信號(hào)肽序列，并在3’端包含用于與人IgG2 Fc片段連接的G5S連接肽序列。為了便于插入克隆載體pCR2. I(Invitrogen)中，在5’端 設(shè)計(jì)Kpn I酶切位點(diǎn)，3’端設(shè)計(jì)BamH I酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)如下引物來(lái)擴(kuò)增人IgG2 Fc片段cDNA 5’ 引物5’ CGG GAT CCG AGC GCA AAT GTT GTG TCGAGT GC 3’3，引物5，GGA ATT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAGAGG 3，
為了能將PCR產(chǎn)物插入克隆載體pCR2. 1中，在5’引物中設(shè)計(jì)入BamH I酶切位點(diǎn)， 在3’引物中設(shè)計(jì)入EcoR I酶切位點(diǎn)。利用總RNA提取試劑盒(Invitrogen)，按照試劑盒的說(shuō)明從正常人血液提取人淋 巴細(xì)胞總RNA，以人淋巴細(xì)胞總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增人IgG2Fc片段。將RT-PCR反應(yīng)混 合物在50°C變性30分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94°C變性30秒；55°C退火30秒；68°C延伸1分鐘。反應(yīng)10個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)94°C變性30秒；60°C退火30秒；68°C延伸1分鐘。反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。然 后68 °C再延伸12分鐘。反應(yīng)完成后，使用的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物。如圖2所示，得到 預(yù)計(jì)大小(約700bp)的DNA片段。經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增的人IgG2 Fc cDNA片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO :9所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示。實(shí)施例2重組質(zhì)粒的構(gòu)建如上所述，在目標(biāo)基因的5’端設(shè)計(jì)Kpn I酶切位點(diǎn)，3’端設(shè)計(jì)BamH I酶切位點(diǎn)， 從而可將目標(biāo)基因片段直接插入克隆載體PCR2.1的多克隆位點(diǎn)Kpn I/BamH I中，然后再 將人IgG2 Fc片段插入到多克隆位點(diǎn)BamH I/EcoR I中，即可得到Εχ-4-Fc融合片段。在 該重組克隆中進(jìn)行人IgG2 Fc片段的點(diǎn)突變，測(cè)序鑒定后再用Kpn I/EcoR I插入真核表達(dá) 載體pAAV2-neo。表達(dá)載體pAAV2_neo是在pcDNA3. 1 (Invitrogen)基礎(chǔ)上改造而來(lái)，加上 AAV2的末端重復(fù)序列，以增加整合片斷在基因組內(nèi)的穩(wěn)定性(質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖幻。重組質(zhì)粒 的構(gòu)建過(guò)程詳見(jiàn)圖1。1.重組質(zhì)粒 pCR2. l-Ex-4-Fc 的構(gòu)建將實(shí)施例1中合成的目的基因片段插入pCR2. 1的Kpn I/BamH I位點(diǎn)，得到 連接產(chǎn)物PCR2. l-Ex-4。之后使用pCR2. l_Ex_4轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化菌體涂布于 LB(含100 μ g/ml氨芐青霉素)平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。然后進(jìn) 行酶切鑒定。將人IgG2Fc片段插入鑒定正確的重組質(zhì)粒的BamH I/EcoR I位點(diǎn)，得到 連接產(chǎn)物PCR2. l-Ex-4-Fc。之后，使用pCR2. Ι-Εχ-4-Fc來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化菌 體涂布于LB (含100 μ g/ml氨芐青霉素)平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。 pCR2. l-Ex-4-Fc的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4，其中陽(yáng)性克隆分別用Kpn I/EcoR I及BamH I/EcoR I回切出目的片段。將測(cè)序鑒定正確的陽(yáng)線克隆進(jìn)行下一步的點(diǎn)突變過(guò)程。2. IgG2Fc的點(diǎn)突變-重組質(zhì)粒pCR2. Ι-Εχ-4-mFc的構(gòu)建以上述pCR2. l-Ex-4-Fc陽(yáng)性克隆為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物5' CCTTTGTTGGAGACCGCGCACTTGTACTCC 3'，其目的是實(shí)現(xiàn)322位的點(diǎn)突變-MG — GCG,相應(yīng)的氨基酸突變?yōu)長(zhǎng)ys — Ala0該突 變是采用Mrategene的點(diǎn)突變?cè)噭┖?Strategene)進(jìn)行。按試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，將 篩選得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明突變后的序列與SEQ ID N0:4—致。測(cè) 序鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行下一步的克隆構(gòu)建。3.真核表達(dá)載體pEx-4-mFc的構(gòu)建將Ex-4-mFc片段從上述pCR2. Ι-Εχ-4-mFc陽(yáng)性克隆質(zhì)粒上切下來(lái)，插入到 pAAV2-neo的Kpn I/EcoR I位點(diǎn)，從而得到重組質(zhì)粒ρΕχ-4-mFc。使用ρΕχ-4-mFc轉(zhuǎn)化大 腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化菌體涂布于LB (含100 μ g/ml氨芐青霉素)平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒pEx-4-mFc的酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖5，其中，1和2分別表示陽(yáng)性 克隆用Kpn I/EcoR I回切出目的片段。選陽(yáng)性克隆進(jìn)行下一步的CHO穩(wěn)定表達(dá)株的篩選。實(shí)施例3 CHO穩(wěn)定表達(dá)株(E4F/CH0細(xì)胞)篩選及鑒定取10 μ g實(shí)施例2中制備的pEx-4-mFc質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞(ATCC)。兩天后按1 5的比例傳代，加入0. 4mg/ml 的G418 (Invitrogen)篩選，10天可見(jiàn)克隆形成。消化120個(gè)邊緣明顯分開(kāi)、細(xì)胞狀態(tài)良好 的單克隆接種于5個(gè)M孔板中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(第一輪篩選)，培養(yǎng)基為含 10%胎牛血清的DMEM/F12anvitrogen)。除非另有說(shuō)明，否則下述培養(yǎng)中的培養(yǎng)溫度和培 養(yǎng)基與此相同。取三天后的培養(yǎng)上清用ELISA法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，從中選出表達(dá)陽(yáng)性的 46個(gè)克隆分別接種于2個(gè)對(duì)孔板(第二輪篩選)。培養(yǎng)3天后，取上清用ELISA法檢測(cè)融 合蛋白的表達(dá)情況，從中選取表達(dá)較高的5個(gè)克隆1-C9、1-F2、2-C5、2-E11、2-F10，進(jìn)一步 用有限稀釋法進(jìn)行篩選。分別接種96孔板(3細(xì)胞/孔/200 μ 1)(第三輪篩選)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)(大約13天) 后，取培養(yǎng)上清用ELISA法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，2-Ε11為均一的克隆，分別挑取表達(dá) 較高的6個(gè)克隆接種M孔板，各平行接2孔。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，其中一孔用于保種，另一孔接 種6孔板。待6孔板內(nèi)的細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，抽提基因組DNA和總RNA，用PCR鑒定整合入基因組 的插入片段的存在情況，用RT-PCR鑒定插入片段的轉(zhuǎn)錄(即表達(dá))情況，結(jié)果如圖6和7 所示。結(jié)果表明2-Ε11為正確的重組克隆。取2-Ε11接種96孔板(1細(xì)胞/孔/200 μ 1)(第四輪篩選)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)(大約 15天)后，取培養(yǎng)上清用ELISA法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，均為均一的克隆，將其中表達(dá) 最高的分別擴(kuò)增、保種，進(jìn)行下一步表達(dá)和純化。pEx-4-mFc轉(zhuǎn)化CHO-Kl細(xì)胞后，將穩(wěn)定表 達(dá)的細(xì)胞命名為E4F/CH0細(xì)胞。實(shí)施例4制備重組Ex-4-mFc融合蛋白大規(guī)模培養(yǎng)實(shí)施例3中所述的E4F/CH0細(xì)胞，使用離心機(jī)(Avanti J-26XP，BECHMAN 公司，美國(guó))進(jìn)行離心，從而收集上清液，上清液用IM的NaOH調(diào)節(jié)ρΗ至7. 3，依次采用以下 方法進(jìn)行純化1.蛋白A親和層析將上述樣品上于經(jīng)緩沖液A(10mM磷酸鹽，ρΗ7. 3)平衡的重組蛋白A親和層析柱 (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Healthcare 公司)，用緩沖液 A 洗滌親和柱至基 線，用緩沖液B(50mM檸檬酸鹽，pH3. 5)洗脫，收集洗脫峰溶液并立即用IM Tris調(diào)節(jié)ρΗ至 8. 0。2.陰離子交換柱層析將步驟1中獲得的蛋白溶液用緩沖液C(20mM Tris-HCl, pH8. 0)稀釋10倍，上于 經(jīng)緩沖液C平衡的Q Sepharose Fast Flow層析柱。用緩沖液EK20mM Tris, pH8. 0,300mM NaCl)洗脫，收集洗脫峰的溶液。3.凝膠過(guò)濾選用凝膠過(guò)濾Superdex 200 prep grade 柱(GE Healthcare 公司)對(duì)步驟 2 中 獲得樣品進(jìn)行精細(xì)純化并轉(zhuǎn)換樣品緩沖系統(tǒng)，平衡液為緩沖液E (IOmM磷酸鹽，pH7. 0，150mMNaCl)，并用緩沖液E洗脫，收集洗脫峰溶液，純度達(dá)到98 %以上(圖8)，從而制得重組 Ex-4-mFc融合蛋白。實(shí)施例5 rEx-4-mFc的理化性能鑒定1. SDS-PAGE 純度分析采用SDS-PAGE系統(tǒng)(參見(jiàn)郭堯君，《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，科學(xué)出版社，1999年) 進(jìn)行非還原型電泳，用Bio-Rad GS800掃描測(cè)定，rEx-4-mFc純度為98.9% (圖8)。2.高效液相色譜純度分析采用親水硅膠體積排阻法測(cè)定，選用色譜柱為Waters PR0TEINPAK 300sw(7. 5_X 30cm)，排阻極限 400KDa。流動(dòng)相:0. mN￡i2HP04 與 0. IM KH2PO4 等體積混合， pH7. 0 ；上樣量100 μ 1，檢測(cè)波長(zhǎng)^Onm。峰面積歸一法分析其純度為98. (圖9)。3. N-末端氨基酸序列分析采用Edman降解法測(cè)定按照實(shí)施例4純化得到rEx-4-mFc的N-末端15個(gè)氨基酸 序列為His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp LeuSer Lys Gln Met Glu。N-末端氨基 酸序列分析結(jié)果與理論序列完全相同，說(shuō)明制備的rEx-4-mFc的一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的。4.免疫印跡反應(yīng)將兔抗Exendin-4、rEx-4-mFc、AP-羊抗兔 IgG (購(gòu)自 Sigma 公司)、NBT (購(gòu)自 USB 公司)、BCIP (購(gòu)自USB公司)用常規(guī)WesternBlot法(郭堯君，《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，科 學(xué)出版社，1999)進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果呈陽(yáng)性(見(jiàn)圖10)。檢測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)本發(fā)明所述的rEx-4-mFc的結(jié)構(gòu)、純度等項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)符合《中 國(guó)藥典》(第三部，2005年版)的相關(guān)要求。實(shí)施例6 rEx-4-mFc刺激胰島瘤細(xì)胞cAMP的產(chǎn)生Exendin-4特異性的與肺膜及胰島瘤細(xì)胞的GLP-I受體相互作用；與GLP-I —樣， 在分離的大鼠胰島和小鼠胰島瘤細(xì)胞β-TC-l中，在葡萄糖的刺激下，其呈劑量依賴(lài)的誘 導(dǎo)胰島素的分泌；同樣，也刺激大鼠胰島瘤細(xì)胞RIN-5F胞內(nèi)CAMP升高，該法已作為判定 Exendin-4生物學(xué)活性的重要指標(biāo)(李克堅(jiān)等，重組促胰島素分泌素生物學(xué)活性測(cè)定方法 的研究，《藥物分析雜志》，2006，12 1691)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔， 培養(yǎng)2 3天至細(xì)胞匯合率達(dá)80 %左右，無(wú)血清高糖培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，加入用含0. 1 % BSA無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度rEx-4-mFc，37°C反應(yīng)30min，去上清，裂解細(xì)胞抽提cAMP 并用酶免法檢測(cè)。結(jié)果表明，在相同分子數(shù)的條件下，rEx-4-mFc保持與Exendin-4相似的 刺激大鼠胰島瘤細(xì)胞RIN-5F胞內(nèi)cAMP升高的作用(圖11)。實(shí)施例7 rEx-4-mFc刺激胰島瘤細(xì)胞胰島素的產(chǎn)生在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種2 X IO4個(gè)/孔細(xì)胞，培養(yǎng)2 3天至細(xì)胞匯合率達(dá)80 % 左右，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，加入用含0. 1% BSA和0. 4%胎牛血清高糖培養(yǎng)基稀釋 的不同濃度rEx-4-mFc，培養(yǎng)2天，取上清并用酶免法檢測(cè)分泌的胰島素。結(jié)果也表明，在 相同分子數(shù)的條件下，rEx-4-mFc保持與Exendin-4相同的促胰島瘤細(xì)胞胰島素分泌作用 (圖⑵。實(shí)施例8 rEx-4-mFc的凍干粉針取實(shí)施例4制備的rEx-4-mFc，按照下列配方制備凍干粉針。
10
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1)促胰島素分泌素；2)連接肽；以及3)人IgG2Fc突變體；其中所述融合蛋白從N端到C端依次為促胰島素分泌素、連接肽和人IgG2 Fc突變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述促胰島素分泌素為重組促胰島 素分泌素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述連接肽具有如SEQID N0:5所 示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgG2Fc突變體為人IgG2Fc 的第322位氨基酸Lys突變?yōu)榘被酇la而形成的突變體；優(yōu)選地所述人IgG2 Fc突變體 具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
6.一種分離的用于編碼根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的融合蛋白的DNA序列， 該DNA序列包含自5’到3’端的用于依次編碼促胰島素分泌素、連接肽和人IgG2 Fc突變 體的DNA，優(yōu)選地所述DNA序列具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
7.含有權(quán)利要求6所述的DNA序列的表達(dá)載體，優(yōu)選地所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體， 更優(yōu)選地所述真核表達(dá)載體為將權(quán)利要求6所述的DNA序列插入pAAV2-ne0的Kpn I/EcoR I位點(diǎn)而形成的。
8.含有權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地所述宿主細(xì)胞為CHO-Kl細(xì)胞。
9.一種治療糖尿病、優(yōu)選治療I型和II型糖尿病、與營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的糖尿病以及繼發(fā) 性糖尿病的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的融合蛋白；以及藥學(xué)上可接受的載體。
10 一種根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的融合蛋白的制備方法，該方法包括提供用包含編碼所述融合蛋白的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后 的宿主細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行離心，然后將離心后的上清液依次用親和層析法、離子交換層 析法和分子篩層析法進(jìn)行純化，從而獲得所述融合蛋白，其中所述親和層析法優(yōu)選使用 rProteinA Sepharose FF親和層析柱，所述離子交換層析法優(yōu)選使用Qkpharose FF層析 柱，所述分子篩層析法優(yōu)選使用Superdex 200柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其包含促胰島素分泌素、連接肽和人IgG2 Fc突變體；其中所述融合蛋白從N端到C端依次為促胰島素分泌素、連接肽和人IgG2 Fc突變體。本發(fā)明還涉及該融合蛋白的制備方法。該融合蛋白可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)，且純化工藝簡(jiǎn)單，利于進(jìn)一步的大規(guī)模制備。本發(fā)明所獲得的融合蛋白不僅具有天然促胰島素分泌素的生物活性，還具有血清半衰期更長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可刺激胰島素的分泌，抑制進(jìn)食后胰高血糖素的釋放，從而可用于各種類(lèi)型的糖尿病的治療。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102070717SQ20091022293
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者何凱, 葉學(xué)君, 張仁懷, 楊立明, 汪猜, 聞亞磊, 陽(yáng)勇, 韓為躍 申請(qǐng)人:東莞太力生物工程有限公司