具有產(chǎn)量增加潛能的植物生長(zhǎng)相關(guān)enox蛋白、序列和方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有產(chǎn)量増加潛能的植物生長(zhǎng)相關(guān)ENOX蛋白、序列和方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001]在某些方面，本發(fā)明設(shè)及基因工程、分子生物學(xué)、植物生物學(xué)、細(xì)菌學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。 [醒]發(fā)明背景 由于許多因素如天氣、昆蟲(chóng)或其它動(dòng)物侵襲，農(nóng)民可能遭受低作物產(chǎn)量或作物歉收。當(dāng) 此發(fā)生時(shí)，其可對(duì)農(nóng)民具有經(jīng)濟(jì)影響。有時(shí)，由于運(yùn)樣的事件農(nóng)民可能希望重新種植一種作 物來(lái)減輕其損失。在其它時(shí)候，農(nóng)民可能只是希望通過(guò)種植第二種作物來(lái)增加其生產(chǎn)力。
[0003] 在單個(gè)季節(jié)內(nèi)種植一種或多種作物的運(yùn)種實(shí)踐被稱(chēng)為"雙作"或"復(fù)種"。復(fù)種允許 農(nóng)民在給定的季節(jié)使用相同數(shù)量的±地同時(shí)增加其生產(chǎn)力。
[0004] 然而，取決于計(jì)時(shí)，在季節(jié)內(nèi)可能沒(méi)有足夠的剩余時(shí)間使第二種作物成熟。因此， 成功的復(fù)種季節(jié)需要小屯、管理作物的種植日期和收獲日期。
[0005] 種植的第二種作物可與種植的第一種作物相同，或其可為不同的。例如，可在第一 批大豆或第一批小麥之后種植第二批大豆。
[0006] 根據(jù)該背景，存在對(duì)具有增加的產(chǎn)量和/或減少的成熟時(shí)間的改善的和/或備選的 農(nóng)產(chǎn)品的需求。本發(fā)明的各方面致力于運(yùn)些需求。
[0007] 發(fā)明概述 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了來(lái)自琴葉擬南芥(Arabidopsis Iyrata)的植物候選 組成型ENOX (CNOX或ENOXl)蛋白的克隆、表達(dá)和表征。編碼該335 (165)個(gè)氨基酸的蛋白的 基因參見(jiàn)登錄號(hào)XP-002882467。先前通過(guò)定點(diǎn)誘變鑒定并且存在于植物的候選ENOXl蛋白 中的ENOX蛋白的特征性功能基序包括腺嚷嶺核巧酸和銅結(jié)合基序連同必需的半脫氨酸。然 而，人EN0X2的藥物結(jié)合基序化EMTE)序列缺失。在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白的活性不受 辣椒素、EGCg和其它EN0X2-抑制物質(zhì)影響。用NAD(P化和還原型輔酶Q二者作為底物均顯示 周期性氧化活性。結(jié)合的銅對(duì)于活性必不可少并且活性受到ENOXl-特異性抑制劑苦木內(nèi)醋 D抑制。稱(chēng)黑激素的加入使24 min周期相位同步(phase)W致下一個(gè)完整的周期在稱(chēng)黑激素 加入后24 min開(kāi)始，如同是一般性ENOXl活性所特有的。周期性蛋白二硫鍵-琉基互換活性 (disulfide-thiol interchange activity)連同24 min ENOXl蛋白周期特有的2氧化加3 互換活性模式也得到證明。純化的植物ENOXl蛋白的濃縮溶液形成不可溶的聚集體，缺乏酶 活性，與淀粉樣蛋白相似。聚集的制備物通過(guò)等電聚焦恢復(fù)活性。上述特征與哺乳動(dòng)物 ENOXl的那些類(lèi)似，使來(lái)自擬南芥屬(Arabidopsis)的ENOXl成為植物中過(guò)表達(dá)的理想候選， 作為增加生物量和產(chǎn)量的手段。
[000引在某些方面，本發(fā)明設(shè)及在雜種生物體，例如，但不限于細(xì)菌、植物和植物種子中 克隆、轉(zhuǎn)染和表達(dá)ENOX蛋白。
[0009]另外，本發(fā)明的實(shí)施方案描述了通過(guò)向植物施用ENOXl的小分子量激活劑增加植 物產(chǎn)量的方法。指定為T(mén)R-III，優(yōu)選半脫氨酸的激活劑作為葉面噴灑W約0.005-1.0磅/英 畝Qb/A)的量施用。優(yōu)選地，施用0.01化/A的半脫氨酸。此外，本發(fā)明提供增強(qiáng)植物生長(zhǎng)的 方法，所述方法包括作為種子處理向植物種子施用半脫氨酸。半脫氨酸W約0.001-1 mg/g 合適載體(mg/g)例如滑石的量施用到種子。優(yōu)選地，半脫氨酸在0.002-0.02 mg/g滑石的范 圍之間施用。本發(fā)明還提供增強(qiáng)植物根生長(zhǎng)和莖直徑(增加的站立能力）的方法，其包括向 植物施用半脫氨酸。半脫氨酸W約0.005-1.0化/A的量施用。優(yōu)選地，給植物施用O. Ol化/ A的半脫氨酸。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了植物候選組成型ENOX蛋白的克隆、表達(dá)和表 征，在某些實(shí)施方案中所述蛋白被天然（IAA)和合成的（2,4-二氯苯氧乙酸，2,4-D)生長(zhǎng)素 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子W約1 iiM的最適條件激活，并且更高的濃度不太有效。先前通過(guò)定點(diǎn)誘 變鑒定并且在候選的生長(zhǎng)素-激活的ENOX (dNOX)中存在的植物ENOXl蛋白的特征性功能基 序，除了先前鑒定的生長(zhǎng)素結(jié)合基序外還包括腺嚷嶺核巧酸和銅結(jié)合基序連同必需的半脫 氨酸。通過(guò)氧化的[NAD(P)H和還原型輔酶Q作為底物]均顯示周期性氧化活性，W及對(duì)于蛋 白二硫鍵互換，產(chǎn)生其它生長(zhǎng)-相關(guān)ENOX蛋白的24 min周期性特征性的2氧化加3互換活性 模式。結(jié)合的銅對(duì)于活性必不可少并且活性受至化NOXl-特異性抑制劑苦木內(nèi)醋D抑制。制備 物在生長(zhǎng)素不存在時(shí)缺乏活性。無(wú)活性的生長(zhǎng)素2,3-D無(wú)效，如EN0X2抑制劑一樣。純化的植 物ENOXl蛋白的濃縮溶液形成不可溶的聚集體，缺乏酶活性，與淀粉樣蛋白相似。聚集的制 備物通過(guò)等電聚焦恢復(fù)活性。上述與哺乳動(dòng)物ENOXl的那些類(lèi)似的特征使植物dNOX成為在 植物中過(guò)表達(dá)的第二候選，作為增加生物量和產(chǎn)量的手段。
[0011] 在此隨附的權(quán)利要求書(shū)中提供了另外的概述，其各自被認(rèn)為是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方案的概述。
[0012] 本發(fā)明前述和又進(jìn)一步的方面將從下列詳述和附圖變得更顯而易見(jiàn)。
[001引 附圖簡(jiǎn)述 圖1.細(xì)胞生長(zhǎng)與ENOXl活性相關(guān)。
[0014] 圖2.人ENOXl過(guò)表達(dá)增加細(xì)胞大小。
[0015] 圖3. NCBI參考序列：XI^_002882467.1 (沈Q ID NO 5)。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) YML117W (沈Q ID NO: 6)與擬南芥屬ENOXl (SEQ ID NO: 7)的比對(duì)。重組擬 南芥屬ENOXl氨基酸84-126與YML117W氨基酸932-968之間存在37% (16/43)的同一性和58% (25/43)的相似性。
[0016] 圖4.在銀染色的15% SDS-PAGE上顯示的14 kD重組擬南芥屬ENOXl的表達(dá)。泳道1 和2:祀TlIa-AraENOXl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的全細(xì)胞(2 );泳道3:弗式壓碎器壓碎的祀TlIa- Ar址NOXl轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的沉淀(2 yl)。表達(dá)的重組擬南芥屬ENOXl (箭頭)存在于弗式壓 碎器壓碎的大腸桿菌的沉淀中。
[0017] 圖5.對(duì)于IEF純化的擬南芥屬ENOXl的級(jí)分顯示12 min期間對(duì)作為NADH消耗的量 度的A34日減少的連續(xù)跟蹤。測(cè)定條件如(Jiang, Z., Gorenstein, N. M., Morr自，D. M.和 Morr自，D. J. 2008.Biochemistry 47:14028-14038)所描述的，不同之處在于NADH濃度為 0.75 ml和使用S陽(yáng)CTRA max 340PC微板閱讀器自動(dòng)收集和存儲(chǔ)數(shù)據(jù)?；旌衔镌?00山的總 體積中包含大約20 yg ENOXl。
[0018] 圖6. IEF-純化的重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性。圖示了5個(gè)極大值的振 蕩模式。相隔6 min的主要極大值由標(biāo)記為1和2的極大值指示。之后的=個(gè)次要的極大值與 主要的極大值分離并且彼此相隔4.5 min,建立了24 min的周期[6 + (4.5 X 4) = 24]。
[0019] 圖7. IEF-純化的重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性和對(duì)1 yM稱(chēng)黑激素的反 應(yīng)。加入稱(chēng)黑激素后，新的極大值在稱(chēng)黑激素加入(箭頭)之后24 min出現(xiàn)，其為ENOXl的一 個(gè)特征。
[0020] 圖8.從二硫代二化晚(DTDP)底物的裂解測(cè)量的IEF-純化的重組擬南芥屬ENOXl 的蛋白二硫鍵-琉基互換活性。觀察到振蕩的活性，活性與相隔4.5 min的=個(gè)極大值而非 相隔6 min的兩個(gè)極大值最密切相關(guān)。
[002。 圖9.通過(guò)A"q(A)的增加或A29Q (B)的減少測(cè)量的重組擬南芥屬ENOXl氧化氨釀 (還原型輔酶Q)的能力。如圖6的NADH氧化一樣，活性振蕩，具有相隔6 min的突出的極大值 (箭頭），W建立包含相隔4.5 min的3個(gè)額外的極大值(總計(jì)5個(gè)極大值)的24 min周期。
[0022] 圖10.通過(guò)等電聚焦，純化和活化重組擬南芥屬ENOXl。
[0023] 圖11.特異性ENOXl苦木苦味素抑制劑苦木內(nèi)醋D對(duì)重組擬南芥屬ENOXl的抑制。
[0024] 圖12.用TFA +浴銅靈減小的重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性。A.在TFA 的存在下，24 min的周期未受影響。B.當(dāng)用TFA和浴銅靈測(cè)定時(shí)，24 min的周期大大減少。 C.通過(guò)透析去除浴銅靈和重新加入銅恢復(fù)全部的活性。
[0025] 圖13.當(dāng)在〇2〇中測(cè)定時(shí)擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性顯示24 min至30 min 的周期長(zhǎng)度增加。重水增加周期長(zhǎng)度的作用為生物鐘的標(biāo)志之一。
[00%] 圖14.半脫氨酸對(duì)NADH氧化的刺激對(duì)在細(xì)菌中表達(dá)的重組ENOXl蛋白的ENOXl活 性周期的極大值③特異。
[0027] 圖15.使大豆種子于黑暗中在賠石中發(fā)芽并收集恰在鉤部分化OOk)下方的2 cm 下胚軸切片。將運(yùn)些均質(zhì)化，制備質(zhì)膜，并測(cè)定ENOXl活性。
[0028] 圖16.如圖15中，除了在溫室中生長(zhǎng)1個(gè)月后的大豆植物的葉組織(第一和第二個(gè) S葉)外。
[0029] 圖17.使大豆植物種子于黑暗中在賠石中發(fā)芽，7天后，從根上方切除幼苗并放置 在光照中的小瓶所包含的水中。
[0030] 圖18.如圖17中，不同之處在于使未處理的種子發(fā)芽和將切除的芽轉(zhuǎn)移至在水中 制備的不同濃度的TR-III溶液中。
[0031] 圖19.植物在溫室中自處理的種子生長(zhǎng)。
[0032] 圖20.如圖19中，不同之處在于植物來(lái)自未處理的種子和用不同比率的TR-III噴 霧。該實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中但在0.01化/A TR-III時(shí)觀察到上胚軸增大，與過(guò)去一樣，0.001或 0.1化/A作用很小或無(wú)作用。
[0033] 圖21.田間實(shí)驗(yàn)中每棵大豆植物的豆芙，該實(shí)驗(yàn)比較了無(wú) TR-III (實(shí)屯、符號(hào))與7 月3日作為葉面噴灑施用的0.01化/A TR-III (開(kāi)符號(hào)，虛線）。
[0034] 圖22.比較無(wú) TR-III、TR-III 1:50和TR-III 1:500,從用滑石處理的種子生長(zhǎng)的 植物的大豆莖的次生木質(zhì)部的增加。
[00對(duì)圖23.來(lái)自圖21的田間實(shí)驗(yàn)的大豆的站立能力。無(wú) TR-III植物(左)嚴(yán)重倒伏。TR-III處理的植物(右)不倒伏。
[0036] 圖24.重組生長(zhǎng)素-活化的ENOX蛋白（ABP-20)的序列（SEQ ID NO: 8)。
[0037] 圖25.在銀染色的15% SDS-PAGE上顯示的20 kD重組ABP-20的表達(dá)。泳道1:攜帶 載體祀T-Ub的全細(xì)胞;泳道2:祀Tl A-ABP-20轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的全細(xì)胞(2 y 1);泳道3:弗 式壓碎器壓碎的祀Tl A-ABP-20轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的上清液(2 yl);泳道4:弗式壓碎器壓碎 的祀TUb-ABP-20轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的沉淀(2 yl)。表達(dá)的重組ABP-20存在于弗式壓碎器壓 碎的大腸桿菌的沉淀中（箭頭）。
[003引圖26. IEF純化的重組ABP-20的NADH氧化酶活性。在60 min時(shí)加入2,4-二氯苯氧 乙酸（2,4-D) (1 yM)W活化該酶。圖示了5個(gè)極大值的振蕩模式。相隔6 min的主要極大值 由單箭頭指示。之后的=個(gè)次要極大值與主要極大值分離并彼此相隔4.5 min,建立了24 min的周期[6 + (4.5 X 4)] = 24]。
[0039] 圖27.如圖26,不同之處在于通過(guò)60 m