-氨基己酸的20 mM Tris-HCl, pH 8.0中并通過在20,000 PSi通過弗式壓碎器（SLM Aminco)裂解S次。約20 W)a的重組ABP-20蛋白的表達通過SDS-PAGE用銀染色確認。轉(zhuǎn)化的 細胞在標準甘油儲存液中于-80°C保存。在Criterion IEF凝膠（Bio-Rad, Hercules, CA) 上進一步純化重組蛋白。將IEF凝膠切成7等段。每個切片代表的pH基于IEF標準(Bio-Rad)。 將切片浸潰在15 ml化is-Mes緩沖液抑7中，4°C搖動過夜。如下測定無凝膠提取物的ENOX 活性： 定點誘變:根據(jù)化aman等人(Braman, J., F*apwo;rth, C.和Greener, A.1996.Methods Mol. Biol. 57:32-44)通過定點誘變用丙氨酸置換指定的氨基酸。剪接變體產(chǎn)物的編號的 氨基酸和核巧酸位置是指為全長轉(zhuǎn)錄物的氨基酸分配的編號。 實施例
[0085] 候選植物ENOXl (YML117W)(來自琴葉擬南芥的EN0X1)的鑒定基于通過與釀酒酵 母ENOXl (YML117W)比較的同源性(BLAST)檢索（圖3)。所選擇的14 kDa氨基酸序列（圖3)在 擬南芥屬XP002882467的氨基酸84-126與酵母菌抓N64277 (YML117W)的氨基酸932-968之 間具有37%同一性和58%相似性。
[0086] 該14 kDa轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的潛在功能基序在與YML117W中的G958XGXXV對齊的G570XGXXL 處包含潛在的NADH結(jié)合位點。潛在的蛋白二硫鍵位點位于M458XXXXCC和M527XXXXXXC連同 C534處。潛在的銅位點位于H466PY、Y531LY (與M527XXXXXXC重疊)和Y479XXXXH處。
[0087] 分子量約14 W)a的重組擬南芥屬ENOXl的表達通過SDS-PAGE用銀染色確認（圖4)。 [008引蛋白表征：IEF-純化的重組MBP-標記的CEN0X2制備物的連續(xù)跟蹤說明了ENOX蛋白 的振蕩活性特征（圖5)。快速活性（箭頭）的間隔中穿插較小活性的間隔。周期長度為24 min。對于單獨NADH或植物ENOXl在NADH不存在時，未觀察到振蕩。
[0089] 對于更詳細的評估，在細菌中表達的重組植物ENOXl在每個1.5 min的1 min內(nèi)平 均的速率更清楚地顯示了 ENOXl蛋白特有的對外源添加 NADH的氧化的振蕩模式（圖6)。重復 模式為5個極大值的重復，其中兩個相隔6 min (箭頭），剩余的相隔4.5 min [6 + (4 X 4.5) = 24 min]。如來自其它來源的ENOXl蛋白的特征，通過加入1 yM稱黑激素使振蕩模 式相位同步(phase)(圖7)。稱黑激素加入后恰好24 min觀察到新的極大值并在其后通過稱 黑激素加入進行相位同步而繼續(xù)。
[0090] 如同一般性ENOX蛋白的特征，該蛋白還顯示蛋白二硫鍵-琉基互換(蛋白二硫鍵異 構(gòu)酶)活性，其通過二硫代二化晚基底物的時間-依賴性裂解說明（圖8)。觀察到與對于NADH 氧化相似的具有24 min的周期長度的振蕩模式(箭頭KNADH氧化和蛋白二硫鍵互換兩種活 性的主要極大值交替。
[0091] 重組ENOXl在標準測定中氧化還原型輔酶Q (圖9)，活性在A"o處（圖9A)或在A290處 (圖9B)測定。如同NADH氧化（圖6)和二硫代二化晚裂解（圖8)，重現(xiàn)了具有24 min周期的特 征性振蕩模式(箭頭）（圖9)。質(zhì)膜的氨釀(對于動物還原型輔酶Q/對于植物還原型輔酶Q或 葉綠釀)為ENOX蛋白的生理學底物。
[0092] 主要通過減少重組蛋白的聚集，取得所報道的比活需要通過等電聚焦進一步純 化。最高的比活在接近重組蛋白的計算等電點的約6.9的聚焦抑時取得(圖10)。
[0093] 通過其對包括順銷、脫氨雌馬酪(911611〇^(11〇1)、66〔旨和辣椒素在內(nèi)的多種6顯乂2 抑制劑的抗性進一步將從IEF凝膠洗脫的ENOX活性鑒定為ENOXl，所有抑制劑均在足W完全 抑制EN0X2活性的濃度檢驗(表5)。用從IEF凝膠洗脫的ENOX，重組擬南芥屬ENOXl蛋白，未觀 察到抑制。活性受到ENOXl-特異性性苦木苦味素抑制劑苦木內(nèi)醋D (圖11)連同生長調(diào)節(jié)性 除草劑氣橫酷草胺(mef Iuidide)和橫酷橫?。╯ulfosulfuron)抑制（表5)。在1 yM時約2倍 刺激大豆質(zhì)膜NOX活性的生長素除草劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，沒有作用(表5)。
[0094] dNOX活性需要銅存在:銅對于dNOX活性必不可少（圖30)。當在S氣乙酸存在下解 折疊時，IEF-純化的dNOX在透析后和在生理抑時保留活性（圖30A)。然而，若dNOX在S氣乙 酸加銅馨合劑浴銅靈存在下解折疊，則活性喪失（圖30B)。隨后通過透析去除浴銅靈并在銅 存在下于生理抑時重折疊，活性恢復（圖30C)。
[00M]在氧化気中的周期長度：當在重水中測定ENOXl活性時產(chǎn)生周期長度從24 min增 加至約30 min的活性模式(圖13)。
[0096] 半脫氨酸對NADH氧化的刺激:半脫氨酸對NADH氧化的刺激對細菌中表達的重組擬 南芥屬ENOXl蛋白的ENOXl活性周期的極大值③特異(圖14)。
[0097] 表5. IEF-純化重組擬南芥屬ENOXl的NADH氧化酶活性和對EN0X2抑制劑，2，4-D和 ENOXl抑制劑苦木內(nèi)酷D的反應(yīng)。3個測定的均值±標準差
平行測定導致〉90%的重組人EN0X2抑制的順銷、脫氨雌馬酪、EGCg和辣椒素濃度。然 而，使用的酪醇和沒食子酸的濃度導致〉90%的arNOX化N0X3)抑制，在約兩倍刺激大豆 dNOX的1 iiM 2,4-D沒有作用?？嗄緝?nèi)醋D為一般的ENOXl抑制劑。
[0098] 添加的TR-III增強大豆生長的期望基于W下兩個前提： 1. ENOXl細胞表面和生長-相關(guān)蛋白與細胞伸長(增大)活性速率通常成正比;和 2. TR-HI通過ENOXl蛋白的構(gòu)象變化不可逆地活化ENOXl。
[0099] 從經(jīng)處理種子生長的幼苗如預(yù)期的顯示提高的ENOXl活性。
[0100] 如圖16中所示，從TR-III處理的種子生長的植物的葉顯示提高的ENOX1，提高比例 與圖15中黑暗-生長的幼苗大致相同。
[0101] TR-111對ENOXl活性的不可逆刺激如預(yù)期持續(xù)并且似乎通過募集過程 (recruitment process)維持。
[0102] 與Escalate相比，用2.5 g/cwt TR-III處理的幼苗的1周后生長增強，但更低或更 高的比率未增強（圖17)。
[0103] 用Escalate + 2.5 g/cwt TR-III進行種子處理增強上胚軸伸長，但并非W與 ENOXl活性的ENOXl刺激成比例的方式，因為0.25或25 g/cwt無作用。
[0104] TR-III在約1(T7 M的狹窄濃度范圍內(nèi)刺激芽生長(圖18)。
[0105] 在溫室研究中TR-III增強了用TR-III噴霧的大豆植物的生長(表6)。
[0106] 僅用Escalate + 0.25 g/cwt TR-III時上胚軸伸長增強（與未處理或單獨 Escalate相比50%)(圖 19)。
[0107] 生長反應(yīng)與平行測量的TR-III對葉ENOXl水平的作用不相似。
[0108] 0.01化/A時觀察到上胚軸增大。如過去一樣，TR-III在0.001或0.1化/A時作用 很小或無作用（圖20)。
[0109] 在溫室研究中Escalate加0.25和2.5 g/cwt的TR-III增加重量和莖直徑(表7)。
[0110] TR-in種子處理增強的ENOXl活性在從溫室生長大豆的1 cm莖段分離的質(zhì)膜中反 映出來(表8)。對于TR-III的兩個比率，均存在平均1節(jié)/植物的增加和1.2個豆芙/節(jié)-1.8個 豆芙/節(jié)的增加。分枝數(shù)目從對于單獨的Escalate 0.5個/植物增加至對于Escalate + TR-III 1.5-1.6個分枝/植物?？傊琖平均2個豆芙/分枝、1個額外的節(jié)和0.6個額外的豆芙/ 節(jié)計，如所觀察到的產(chǎn)生(2 + 2 + 6 = 10)個額外的豆芙/植物。每個豆芙產(chǎn)生約0.25 g豆 子，運轉(zhuǎn)化為10 X 0.25 g = 2.5額外克豆子/植物，與對于單獨的Escalate 2.8 g/植物相 比，運使TR-III小塊±地的產(chǎn)量為2.8 + 2.5 = 5.3克/植物(表9)。低和高TR-III比率之間 的主要差異為變異性。用0.25 g/cwt TR-III，與單獨的Escalate相比僅重要參數(shù)輕微顯 著。然而，用2.5 g/cwt TR-III，由于單獨的Escalate 和TR-III加2.5 g/cwt Escalate二 者的重復試驗之間驚人的一致，與單獨Escalate的差異非常顯著。
[0111] 11/5/12收獲的雙作大豆植物通過增加的豆芙/植物、增加的節(jié)/植物、分枝/植物 和莖直徑響應(yīng)TR-IH種子處理(表9)。植物高度未受影響。
[0112] 雙作大豆響應(yīng)TR-III的一個主要指標為略低于第一節(jié)的植物基部處莖直徑的增 加（表9)。莖變厚通過組織學分析確認（表10)。用在九月初收集的樣品，與對于單獨的 Escalate 2.7 +/- 0.3 mm的木質(zhì)部相比，Escalate + 2.5 g/cwt TR-III具有3.3 +/-0.4 mm的木質(zhì)部(P = 0.0847)，運轉(zhuǎn)化為約40%的木質(zhì)部體積增加。收獲時，與對于單獨的 Escalate 4.2 mm的木質(zhì)部相比，對于Escalate + 2.5 g/cwt TR-III，木質(zhì)部的量為5.3 ITim O
[0113] 當校正站立計數(shù)（s1:and count)時，對于Escalate + 2.5 g/cwt TR-III，雙作大 豆產(chǎn)量增加23%。
[0114] 與在溫室中的第二個和第S個S葉的葉子之間收獲的1 cm莖段的質(zhì)膜ENOXl活性 增加70%相比（表11)。
[0115] 表6. TR-III噴霧。溫室生長的375 NR大豆在種植后14天噴霧并在噴霧后10天測 量。
[0116] 表7.子葉W上第一個節(jié)間的重量和莖直徑。3個重復試驗的均值，每個重復試驗5 棵植物。種植后40天溫室生長的375 NR大豆。
[0117] 表8.種植后40天在溫室生長的375 NR大豆的第二和第S個S葉的葉子之間收獲 的2 cm萃段的質(zhì)膛ENOXl活忡。夾自3個軍復試輪的雙份測吿，毎個軍復試輪5棵植物。
[0118] 表9. 2012 Arcadia South DC大豆處理研究的匯總。Beck Plots, Atlan化，IN.
表10.從3棵成熟期植物的10-12個切片組織學測量的大豆木質(zhì)部直徑和面積。
[0119] 表11.來自在Becks 375 NR溫室生長大豆的第二和第S個S葉的葉子之間收獲 的I cm莖段的質(zhì)膜ENOXl活性。比較3盆每盆5棵植物的平均值±標準差的雙份測定(測定 各植物）。
[0120] 表12.種植后2個月在溫室中生長的轉(zhuǎn)基因 ST109-2-4 (10棵植物WPWilliams 82 ISU (20棵植物)大豆的生長和質(zhì)膜ENOXl活性。
[0121] 在從新出現(xiàn)S葉的葉子和新出現(xiàn)S葉的葉子下1 cm收獲的莖制備的質(zhì)膜上測量 ENOXl活性。S葉的葉子和莖組織并無不同，所報告的值為二者的平均值±標準差。
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