22] *與Williams 82 ISU顯著不同 P < 0.001 **與Williams 82 ISU顯著不同 P = 0.015 與Wi 11 iams 82相比在溫室中種植后2個(gè)月收獲的ST-109-2-4大豆植物顯示80%提高的 與從新出現(xiàn)S葉的葉子和恰在新出現(xiàn)的S葉下方收獲的莖段分離的質(zhì)膜相關(guān)的ENOXl活 性。然而，植株僅高16%并且基部莖直徑僅增加5%。轉(zhuǎn)基因 ST-109-2-4和Williams 82植物二 者的質(zhì)膜ENOXl活性均W約12%響應(yīng)加入的100 yM半脫氨酸。運(yùn)些數(shù)據(jù)證明轉(zhuǎn)基因植物中過(guò) 表達(dá)的ENOXl到達(dá)質(zhì)膜并且仍響應(yīng)加入的半脫氨酸但生長(zhǎng)響應(yīng)不成比例地更少。
[0123] 候選植物生長(zhǎng)素-活化的ENOX蛋白（dNOX)的鑒定基于還包含已知ENOX蛋白的相應(yīng) 功能基序的已知生長(zhǎng)素-結(jié)合蛋白的同源性檢索。所選擇的20 kDa的氨基酸序列，ABP-20 (圖24，SEQ ID NO: 8)，在20 kD的轉(zhuǎn)錄物內(nèi)包含所需的功能基序，包括在G59LGTAG處的潛 在NADH結(jié)合位點(diǎn)、位于C44KK的潛在的蛋白二硫鍵位點(diǎn)W及順著位于H106TH和L160LH的潛 在的銅位點(diǎn)連同生長(zhǎng)素結(jié)合基序化06THPGASSVLIVAQ。
[0124] 具有約20 W)a分子量的重組ABP-20的表達(dá)通過(guò)SDS-PAGE用銀染色確認(rèn)（圖25)。
[0125] 蛋白表征:沒(méi)有生長(zhǎng)素添加時(shí)重組蛋白在純化期間都不顯示超過(guò)NADH自動(dòng)氧化的 背景速率的NADH氧化酶活性。添加生長(zhǎng)素（例如，1 yM 2,4-D)時(shí)活性在基線(xiàn)活性之上增強(qiáng) 10-20倍，IEF-純化級(jí)分的平均比活為約0.6 ± 0.2 ymol/min/mg蛋白。
[0126] 對(duì)于更詳細(xì)的評(píng)估，在細(xì)菌中表達(dá)和通過(guò)等電聚焦純化的重組植物ENOXl在每個(gè) 1.5 min的1 min內(nèi)平均的速率清楚地顯示ENOXl蛋白特有的對(duì)外源提供的NADH的氧化的振 蕩模式（圖26)。重復(fù)模式為5個(gè)極大值的重復(fù)，其中兩個(gè)相隔6 min (極大值①和②），剩余 的（極大值③、④和⑤)相隔4.5 min [6 + (4 X 4.5 min) = 24 min]。如來(lái)自其它來(lái)源的 ENOXl蛋白所特有的，標(biāo)記為①和②的極大值比極大值③、④和⑤更突出。當(dāng)用2，4-D代替天 然生長(zhǎng)素，嗎I噪-3-乙酸（IAA)時(shí)獲得相似的結(jié)果（圖27)。
[0127] 如同一般性ENOX蛋白所特有的，該蛋白還顯示蛋白二硫鍵-琉基互換(蛋白二硫鍵 異構(gòu)酶)活性，其通過(guò)二硫代二化晚基底物的時(shí)間-依賴(lài)性裂解說(shuō)明（圖28)。觀(guān)察到與對(duì)于 NADH氧化相似的具有24 min的周期長(zhǎng)度的振蕩模式。如先前所報(bào)道的（Morr自，D. J.和 Morr自，D. M.2003.Free Radical Res. 37: 795-808)，用DTDP，標(biāo)記為③、④和⑤的極大 值比標(biāo)記為①和②的那些更顯著，運(yùn)提示NADH氧化和蛋白二硫鍵互換的主要極大值的交 替。
[012引重組ENOXl在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中氧化還原型輔酶Q (圖29)，活性在A(yíng)"o處（圖29A)或在A(yíng)290 處（圖29B)測(cè)定。就NADH氧化而言（圖27)標(biāo)記為①和②的極大值比標(biāo)記為③、④和⑤的那些 更顯著。質(zhì)膜的氨釀(對(duì)于動(dòng)物還原型輔酶Q/對(duì)于植物還原型輔酶Q或葉綠釀)為ENOX蛋白 的生理學(xué)底物。
[0129] 主要通過(guò)減少重組蛋白的聚集，取得所報(bào)道的比活需要通過(guò)等電聚焦進(jìn)一步純 化。最高的比活在接近重組蛋白的計(jì)算等電點(diǎn)pH 5.19的約5.0的聚焦piH時(shí)取得。
[0130] 活性受到硫醇試劑PCMB和PCMS (表12)抑制。無(wú)活性的生長(zhǎng)素類(lèi)似物2,3-二氯苯 氧乙酸（2,3-D)沒(méi)有作用，如ENOXl-特異性苦木苦味素抑制劑苦木內(nèi)醋D-樣(表12)。抑制 生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的生長(zhǎng)但不控制植物生長(zhǎng)(Morr自，D. J., Crane, F. L., Barr, R., Penel, C.和Wu, L. Y. 1988.Physiol. Plant. 72: 236-240)的抗癌藥物順?shù)N、多柔比星(阿霉素） 和EN0X2特異性苦木苦味素抑制劑glaucarubolone也抑制該重組蛋白的活性。生長(zhǎng)惰性的 反銷(xiāo)沒(méi)有作用(表12)。
[0131] ENOXl活性需要銅的存在:銅對(duì)于ENOXl活性必不可少（圖30)。當(dāng)在S氣乙酸存在 下解折疊時(shí)，IEF-純化的ENOXl在透析后和在生理抑時(shí)保留活性（圖30A)。然而，若ENOXl在 =氣乙酸加銅馨合劑浴銅靈存在下解折疊，則活性喪失（圖30B)。隨后通過(guò)透析去除浴銅靈 并在銅存在下于生理抑時(shí)重折疊，活性恢復(fù)(圖30C)。
[0132] 通過(guò)定點(diǎn)誘變對(duì)ABP-20基序的功能分配的確認(rèn):對(duì)于dNOX (ABP-20)的特定功能 基序通過(guò)定點(diǎn)誘變提供ENOX蛋白共有基序的功能分配的確認(rèn)(表13)。在ENOXl蛋白共有的 CKK基序內(nèi)，對(duì)于NADH氧化和蛋白二硫鍵-二琉基互換活性二者C44A置換中的活性減少81%。 假定腺嚷嶺核巧酸結(jié)合基序中的G59A置換很大程度上消除了 NADH氧化但對(duì)二硫鍵-琉基互 換沒(méi)有作用。生長(zhǎng)素結(jié)合基序中的E113H置換還消除NADH氧化酶活性的生長(zhǎng)素-刺激。假定 銅位點(diǎn)的置換，H106A和化52A，使NADH氧化和二硫鍵-琉基互換二者的活性減少至與接近背 景。
[0133] 表13 . IEF-純化的重組ABP-20的NADH氧化酶活性和對(duì)生長(zhǎng)素及ENOX抑制劑的響 應(yīng)。3個(gè)測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差
表14.通過(guò)定點(diǎn)誘變對(duì)dNOX (ABP-20)的功能基序的確認(rèn)
術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"和"一種"和"所述"W及相似的提及對(duì)象在描述本發(fā)明的情境中，特別是在 所附權(quán)利要求的情境中，解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)二者，除非本文中另外指明或上下文明顯 矛盾。本文對(duì)數(shù)值范圍的敘述僅意在用作逐一提及落入范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú)值的速記方法， 除非本文另外指明，并且每個(gè)單獨(dú)的數(shù)值如同其在本文中逐一列出而包括到說(shuō)明書(shū)中。本 文所述的所有方法可W W任何合適的次序?qū)嵤潜疚牧硗庵该骰蛄硗馀c上下文明顯矛 盾。本文所提供的任何和所有實(shí)施例，或示例性語(yǔ)言（例如，"例如"）的使用，僅意在更好地 闡明本發(fā)明并且不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，除非另外要求。說(shuō)明書(shū)中的任何語(yǔ)言均不應(yīng) 解釋為指示任何非-要求的要素為本發(fā)明的實(shí)踐所必需的。
[0134]盡管本發(fā)明已經(jīng)在附圖和前述說(shuō)明書(shū)中詳細(xì)說(shuō)明和描述，但性質(zhì)上其應(yīng)被認(rèn)為是 說(shuō)明性的而非限制性的，應(yīng)理解的是僅顯示和描述了優(yōu)選的實(shí)施方案并且在本發(fā)明精神內(nèi) 的所有變化和修飾均期需得到保護(hù)。另外，本文引用的所有參考文獻(xiàn)指示本領(lǐng)域的技術(shù)水 平并且通過(guò)引用W其整體結(jié)合到本文中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 包含編碼外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋白的分離DNA的DNA構(gòu)建體。2. 權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體為質(zhì)粒。3. 權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體為pETl la載體。4. 權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA序列位于pET 11 a載體的Nhe I和BamHI位點(diǎn)之 間。5. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋 白為重組氧化酶二硫鍵巰基互換蛋白。6. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋 白為來(lái)自智人(Homo sapiens)的哺乳動(dòng)物氧化酶。7. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋 白為來(lái)自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的裂殖酵母氧化酶。8. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋 白為來(lái)自擬南芥屬(Arab i dop s i s)的高等植物氧化酶。9. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋 白為來(lái)自李屬(Prunus)的高等植物氧化酶。10. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA序列為SEQ ID NO: 1。11. 權(quán)利要求1-4的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA序列為SEQ ID NO: 2。12. 權(quán)利要求1-4的構(gòu)建體，其中所述DNA序列為SEQ ID NO: 3。13. 權(quán)利要求1-4的構(gòu)建體，其中所述DNA序列為SEQ ID NO: 4。14. 包含權(quán)利要求1的構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞。15. 權(quán)利要求14的細(xì)菌細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)物種的。16. 能夠在植物中表達(dá)多肽的嵌合基因，其包含編碼多肽的DNA，其中所述多肽為外-煙 酰胺二核苷酸氧化酶二硫鍵巰基互換蛋白。17. 權(quán)利要求16的基因，其中所述DNA編碼來(lái)自智人的外-煙酰胺二核苷酸氧化酶二硫 鍵疏基互換蛋白。18. 權(quán)利要求16的基因，其中所述DNA編碼來(lái)自擬南芥屬的外-煙酰胺二核苷酸氧化酶 ^硫鍵疏基互換蛋白。19. 權(quán)利要求16的基因，其中所述DNA編碼來(lái)自釀酒酵母的外-煙酰胺二核苷酸氧化酶 ^硫鍵疏基互換蛋白。20. 包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的微生物。21. 包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的植物。22. 包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的植物種子。23. 權(quán)利要求21的植物，其中所述植物為大豆、玉米、高粱、蔬菜、塊根作物、水果或飼料 植物。24. 權(quán)利要求22的植物種子，其中所述植物種子為大豆種子、玉米種子、高粱種子、蔬菜 種子、塊根作物塊莖、水果種子或飼料植物種子。25. 用于增加包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的植物中的外-煙酰胺二核苷酸 氧化酶二硫鍵巰基互換蛋白的活性的方法，包括向植物中加入EN0X激活劑。26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述ENOX激活劑為半胱氨酸。27. 權(quán)利要求25的方法，其中所述EN0X激活劑為生長(zhǎng)素。28. 用于包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物種子的種子包衣，其包 含EN0X激活劑。29. 權(quán)利要求28的種子包衣，其中所述EN0X激活劑為半胱氨酸。30. 用于栽培包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的植物的方法，包括作為葉面噴 灑噴霧包含半胱氨酸的組合物。31. 用于誘導(dǎo)包含權(quán)利要求16-19中的一項(xiàng)的嵌合基因的大豆作物早期開(kāi)花的方法，包 括給予所述作物生長(zhǎng)素或EN0X激活劑。32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述EN0X激活劑為半胱氨酸。
【專(zhuān)利摘要】本文描述了可用于增加轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的產(chǎn)量的物質(zhì)組合物和方法。公開(kāi)了ENOX蛋白的序列信息和用于轉(zhuǎn)染的方法。另外，公開(kāi)了ENOX蛋白的小分子激活劑。公開(kāi)了來(lái)自酵母菌釀酒酵母(<i>Saccharomyces</i><i> cerevisiae</i>)、擬南芥(<i>Aribidopsis</i><i> thaliana</i>)和桃樹(shù)(<i>Prunus</i><i> persicaria</i>)的ENOX蛋白的序列信息。公開(kāi)了可表現(xiàn)出一種或多種下列特征的轉(zhuǎn)基因微生物和/或植物，所述特征包括但不限于加速成熟、細(xì)胞大小增加、站立能力增加、根和木質(zhì)部發(fā)育增加以及產(chǎn)量增加。
【IPC分類(lèi)】A01H5/00, C12N15/82, C12N9/02, C12N15/63, C12N15/62, C12N15/53
【公開(kāi)號(hào)】CN105705642
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】D.J.莫雷, D.M.莫雷
【申請(qǐng)人】摩-紐克企業(yè)
【公開(kāi)日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2013年6月25日