專利名稱：人新蛋白hCRISP56及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)、分子生該物學(xué)、分子免疫學(xué)、基因工程等領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一個(gè)在人體正常組織表達(dá)的新蛋白hCRISP56及其編碼序列。
背景技術(shù)：
一些蛋白質(zhì)被合成后分泌到細(xì)胞外，這些蛋白統(tǒng)稱為分泌蛋白，它們對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育，細(xì)胞的分化、增殖和凋亡以及細(xì)胞間的通訊起著重要的作用。分泌蛋白是由信號(hào)肽介導(dǎo)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然后分泌到細(xì)胞外?？茖W(xué)家布洛貝爾根據(jù)他的研究成果，提出了信號(hào)肽假說，認(rèn)為在一些新生肽鏈的N末端，有一段長(zhǎng)度不等的肽段，通常由20～30個(gè)氨基酸殘基組成。它們的存在，決定了含有這類肽段的新生肽鏈能被分泌到細(xì)胞外，而在已被分泌到細(xì)胞外的成熟蛋白質(zhì)中，則不再含有這類肽段。SignalP是目前預(yù)測(cè)信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)的最有效的方法，本發(fā)明利用了SingalP2.0軟件，輔以ProP v.1.0b軟件，在眾多的新蛋白中獲得一個(gè)新的分泌蛋白，命名為hCRISP56，并初步預(yù)測(cè)該蛋白含有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域SCP和LCCL。
SCP家族，又稱為CRISP(Cysteine-rich extracellular proteins)家族，包含一大類在進(jìn)化上相關(guān)的分泌蛋白黃蜂毒液Ag5過敏原(vespid venom Ag5 allergens)，哺乳動(dòng)物睪丸特異性蛋白(mammalians testis-specific proteins)，植物致病相關(guān)蛋白(plantpathogenesis-related proteins)等等。Ag5可以引起人類的過敏反應(yīng)；睪丸特異性蛋白包括睪丸特異性基因Tpx-1編碼的蛋白和精子包膜糖蛋白Scg，Scg由附睪上皮細(xì)胞分泌表達(dá)，可能與精子的功能性成熟密切相關(guān)；植物中發(fā)現(xiàn)的致病相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PR)主要有五種PR-1到PR-5，當(dāng)植物受到病毒、細(xì)菌和真菌感染時(shí)就會(huì)產(chǎn)生PR，通過急性免疫反應(yīng)或系統(tǒng)的獲得性抵抗來保護(hù)植物。此外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白也屬于SCP家族，它可以在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中特異性地表達(dá)。雖然這些蛋白進(jìn)化上相關(guān)，功能上類似，但對(duì)于SCP家族的確切的生物學(xué)活性還有待研究的進(jìn)一步深入。
LCCL結(jié)構(gòu)域根據(jù)最初發(fā)現(xiàn)含有該結(jié)構(gòu)域的三個(gè)蛋白Limulus Factor C，Coch-5b2和Lgl1而命名的。Factor C是一種絲氨酸蛋白酶，LCCL結(jié)構(gòu)域是Factor C的N端多個(gè)功能基序之一，而Factor C的N端區(qū)域一旦與革蘭氏陰性菌表面的脂多糖(LPS)結(jié)合，就會(huì)引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)來保護(hù)宿主。Coch-5b2由14號(hào)染色體上的COCH基因編碼，COCH基因在內(nèi)耳中高水平表達(dá)，它的某些特定位點(diǎn)的無義突變會(huì)引起人類耳聾癥DFNA9，而這些會(huì)導(dǎo)致失聰?shù)耐蛔兙l(fā)生在LCCL結(jié)構(gòu)域中。Lgl1表達(dá)于胎肺間質(zhì)中，可能通過降解胞外基質(zhì)來控制胚胎肺的發(fā)育。在這些蛋白中，LCCL結(jié)構(gòu)域似乎在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和抵抗微生物方面起著重要的作用，但是其具體的功能仍有待開發(fā)。
此外，根據(jù)對(duì)hCRISP56的同源性分析，hCRISP56與25kD胰蛋白酶抑制劑有較高的同源性。胰蛋白酶抑制劑泛指分子量比較小、能夠抑制絲氨酸蛋白酶活性的一類物質(zhì)。絲氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白水解酶，在體內(nèi)廣泛存在，可以發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，維持機(jī)體正常的生理功能。這些酶的催化中心都有一個(gè)活性特異的絲氨酸側(cè)鏈，在與底物作用時(shí)該絲氨酸側(cè)鏈和底物上特異的肽鍵部位形成一個(gè)過渡的四面體結(jié)構(gòu)；胰蛋白酶抑制劑則具有類似的與酶相結(jié)合的部位，同時(shí)抑制劑的結(jié)構(gòu)類似于酶與底物變構(gòu)形成的四面體結(jié)構(gòu)，抑制劑上的活性氨基酸殘基占據(jù)了蛋白酶活性中心，使底物不能靠近活性中心部位，從而無法與酶進(jìn)行氫鍵或疏水鍵的結(jié)合，發(fā)揮抑制絲氨酸蛋白酶活性的作用。所以胰蛋白酶抑制劑在臨床上廣泛用于急性胰腺炎、手術(shù)后器官功能衰竭以及再灌注損傷、早產(chǎn)、肺氣腫、腦水腫、腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等疾病。本發(fā)明也涉及對(duì)hCRISP56的胰酶抑制劑活性的探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種新的人類蛋白多肽hCRISP56、該蛋白多肽的編碼序列、含有該編碼序列的載體及宿主細(xì)胞，以及該蛋白的抗體。
本發(fā)明的再一目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人hCRISP56蛋白和核酸序列的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的在本發(fā)明的一方面，提供了一種分離的人hCRISP56蛋白多肽，所述多肽具有與SEQ IDNO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。優(yōu)選的，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包括編碼具有人hCRISP56蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列雜交的序列。優(yōu)選的，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更優(yōu)的，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的再一方面，還提供了一種載體，所述載體含有上述分離的多核苷酸。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21；在另一個(gè)實(shí)施例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞CHO。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有hCRISP56蛋白活性的多肽的方法，該方法包括如下步驟(a)將編碼具有hCRISP56蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hCRISP56蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hCRISP56蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hCRISP56蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hCRISP56蛋白活性的多肽。
優(yōu)選的，步驟(a)中所述的核苷酸序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種抗體，所述抗體能與上述hCRISP56蛋白的部分肽段特異性結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種探針分子，所述的探針分子含有上述多核苷酸中約8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA，或人工化學(xué)合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。單鏈的DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，“分離的”多核苷酸是指，該多核苷酸或片斷已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該多核苷酸或片斷已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
本發(fā)明中，術(shù)語“hCRISP56蛋白(或多肽)編碼序列”是指編碼具有hCRISP56蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中205-1698位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框205-1698位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.1中205-1698位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人hCRISP56相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常位1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常位60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hCRISP56蛋白多肽”是指具有hCRISP56蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hCRISP56蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hCRISP56蛋白的活性片斷和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與hCRISP56DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hCRISP56多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hCRISP56多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還提供了hCRISP56多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hCRISP56多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供hCRISP56蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hCRISP56多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)hCRISP56DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這里“特異性”是指抗體能結(jié)合于hCRISP56基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hCRISP56基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制hCRISP56蛋白的分子，也包括那些并不影響hCRISP56蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hCRISP56基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利NO.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的hCRISP56基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)hCRISP56或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hCRISP56功能的抗體以及不影響hCRISP56功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hCRISP56基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hCRISP56基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的hCRISP56核苷酸序列全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列，這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。當(dāng)然，也可通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長(zhǎng)的片段。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的hCRISP56全長(zhǎng)編碼序列電泳圖譜；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的同源性分析結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的軟件Treeview分析新蛋白hCRISP56進(jìn)化樹結(jié)果圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果圖(A、B為SignalP分析結(jié)果，C為ProP v.1.0b分析結(jié)果)；圖5是本發(fā)明實(shí)施例2的軟件分析hCRISP56功能結(jié)構(gòu)域圖示；圖6是本發(fā)明實(shí)施例3的hCRISP56-pcDNA3.1A酶切鑒定圖，其中1、2號(hào)克隆為陽性hCRISP56-pcDNA3.1A質(zhì)粒，M為100bp的marker；圖7是本發(fā)明實(shí)施例3的hCRISP56-pcDNA3.1A western bloting結(jié)果圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例3的hCRISP56-pcDNA3.1A亞細(xì)胞定位的熒光顯微鏡圖像；圖9是本發(fā)明實(shí)施例4的hCRISP56穩(wěn)定株western bloting結(jié)果圖；圖10是本發(fā)明實(shí)施例5的hCRISP56-pGEX-4T-1酶切鑒定結(jié)果圖；圖11是本發(fā)明實(shí)施例5的不同濃度的尿素洗脫hCRISP56融合蛋白結(jié)果圖；圖12是本發(fā)明實(shí)施例5的hCRISP56 last part的純化結(jié)果圖；圖中1代表未經(jīng)純化的上清，2代表結(jié)合后過柱的上清液，3代表洗脫下來的純化hCRISP56融合蛋白；圖13是本發(fā)明實(shí)施例6的hCRISP56組織表達(dá)譜結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1獲得hCRISP56蛋白的全長(zhǎng)編碼序列及其克隆載體根據(jù)NCBI公共數(shù)據(jù)庫的序列信息設(shè)計(jì)5’和3’端引物，以包括成人脾、心臟、腦、小腸、胸腺、肌肉、肺、睪丸、腎、肝十種cDNA的混合cDNA庫為模板，采用RT-PCR的方法獲得hCRISP56蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。
1.引物設(shè)計(jì)F-5’GCTGTCGCCGCTGCTACCGC(SEQ ID NO.3)R-5’GACGCCCCTTCTCCCCTGGT(SEQ ID NO.4)2. RT-PCR

PCR條件94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 90s；30 cycles；電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得大小為1670bp的DNA片段(見圖1)。利用博亞公司提供的凝膠純化的試劑盒純化目的DNA片段，加入Taq酶和dATP，70℃培育30min，獲得帶有A尾的目的DNA。
3.連接

16℃連接18hr4.轉(zhuǎn)化取5ul連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，置于冰上1h，42℃熱激90s后立即放在冰上，加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h，將轉(zhuǎn)化的菌液涂于LB(Amp)藍(lán)白板上，37℃培養(yǎng)過夜。在白平板上分別挑取多個(gè)菌落作PCR鑒定。
5.質(zhì)粒提取用VIOGENE公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取PCR鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒，經(jīng)核酸測(cè)序獲得hCRISP56蛋白編碼基因的核酸序列。
實(shí)施例2hsp56蛋白的生物信息學(xué)分析1. hCRISP56全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度為4574bp，其中預(yù)測(cè)的新蛋白的開放閱讀框位于205-1698位核苷酸，編碼497個(gè)氨基酸殘基，分子量為55919Da。該蛋白的核酸序列及蛋白序列見SEQID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.本發(fā)明hCRISP56經(jīng)過blast檢索，利用軟件Alignment，GeneDoc獲得與之同源性較高的蛋白，這些表現(xiàn)為同源性較高的蛋白均集中在hCRISP56的N端區(qū)域(見圖2)。其中hCRISP56與25kD胰蛋白酶抑制劑(即圖2中hPI15)的同源性為76％。
3.利用軟件Treeview分析新蛋白hCRISP56進(jìn)化樹(見圖3)，可以發(fā)現(xiàn)hCRISP56與rLgl1在進(jìn)化樹上親緣關(guān)系較近。
4.利用網(wǎng)上的共享web軟件SignalP http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/和ProP v.1.0b http//www.cbs.dtu.dk/services/ProP-1.0/預(yù)測(cè)信號(hào)肽及信號(hào)肽切割位點(diǎn)(見圖4)。
根據(jù)SignalP預(yù)測(cè)，該蛋白N端為信號(hào)肽的可能性為89.4％，信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于22與23號(hào)氨基酸的可能性為72.2％；根據(jù)ProP的預(yù)測(cè)，確證信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于22與23號(hào)氨基酸間，而前肽切割位點(diǎn)位于49號(hào)位點(diǎn)的Arg(R)。
5. PROSITEhttp//us.expasy.org/prosite/，ProfileScan http//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN，SMART http//smart.embl-heidelberg.de/smart/show_mot ifs.pl以及CDART http//www.ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml預(yù)測(cè)功能結(jié)構(gòu)域和基元(圖5)。
根據(jù)PROSITE，ProfileScan，CDART軟件的綜合預(yù)測(cè)結(jié)果，該蛋白含有兩種結(jié)構(gòu)域，SCP結(jié)構(gòu)域和LCCL結(jié)構(gòu)域，其中SCP家族位于54到208位氨基酸；LCCL結(jié)構(gòu)域有兩個(gè)，分別位于286~370和387~479位點(diǎn)處。
實(shí)施例3hCRISP56真核表達(dá)載體的構(gòu)建與分泌特性的驗(yàn)證1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)
F-5’AGTCTAGACATGAGCTGCGT(SEQ ID NO.5)R-5’GGGAATTCTCTGCCTGACAG(SEQ ID NO.6)2)PCR反應(yīng)，以克隆載體hCRISP56-pGEM Tesay為模板，58℃退火，35 cycles。
3)Xba I與EcoR I雙酶切hCRISP56的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pcDNA3.1A

37℃酶切2hr4)如常規(guī)方法連接，轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行雙酶切鑒定(見圖6)。
圖中1、2號(hào)克隆為陽性hCRISP56-pcDNA3.1A質(zhì)粒，M為100bp的marker；對(duì)這兩個(gè)克隆抽提質(zhì)粒，從T7和BGH兩端進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證了插入的目的基因的正確性。
2. Western bloting1)鋪細(xì)胞CHO細(xì)胞接種密度是1-1.5×105/35mm培養(yǎng)皿；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁；2)轉(zhuǎn)染A質(zhì)粒用量1～2ug，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；B脂質(zhì)體Lipofectamine(GibcoBRL公司)3ul-5ul，+100ul DMEM(無血清，無抗生素)，混勻；A+B，混勻，室溫靜置15-45min，一般30min；培養(yǎng)細(xì)胞去上清，用DMEM(無血清，無抗生素)洗一次，加800ul DMEM(無血清，無抗生素)，滴入轉(zhuǎn)染混合液，搖勻；37℃，5％CO2培養(yǎng)5-24小時(shí)，換液為DMEM(10％FCS)，繼續(xù)培養(yǎng)至總轉(zhuǎn)染時(shí)間為48-72小時(shí)。
3)樣品處理上清收集細(xì)胞培養(yǎng)盤中的上清，13000rpm，8min。收集離心上清，取200ul純化。
細(xì)胞用PBS(pH7.4)2ml洗盤中細(xì)胞兩次，加200ul裂解緩沖液，冰上20分鐘裂解。然后刮下細(xì)胞，將裂解液于4℃離心12000rpm，8min，回收上清，進(jìn)行純化。
TALON樹脂預(yù)處理將1體積的TALON樹脂貯存液于5000rpm離心5分鐘，去上清，用1×E/W緩沖液洗兩次，然后加等體積的1×E/W緩沖液得到50％的樹脂混合液。
樣品純化在樣品中加入適量的預(yù)處理過的50％Slurry，加入800ul 1×E/W緩沖液，4℃結(jié)合2小時(shí)。8000rpm離心5分鐘去上清，用1×E/W緩沖液洗3-4次，去除非特異結(jié)合的蛋白。
4)蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜常規(guī)蛋白電泳分離樣品；15％分離膠，60V 30min，160V 1hr20min。
濕法轉(zhuǎn)膜1hr，電壓110V。
5)膜的封閉3％脫脂牛奶/2％BSA/PBST 50ml，水平搖床，室溫封閉4小時(shí)6)一抗(鼠抗人C-Myc 9E10)用封閉液稀釋一抗，鼠抗人C-myc 9E10(200ng/ul)稀釋倍數(shù)1000倍；將膜完全沒于一抗稀釋液中。
水平搖床，室溫2小時(shí)，也可過夜。
PBST室溫洗3*10分鐘7)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)用封閉液稀釋二抗，10000倍稀釋；水平搖床，室溫2小時(shí)；PBST室溫洗3*10分鐘8)檢測(cè)將檢測(cè)試劑(ECL plus)A液與B液以40∶1的比例混合，用量為0.1ml/cm2；膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測(cè)試劑加在膜上，覆蓋整個(gè)膜表面，室溫放置2分鐘；用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測(cè)試劑；膜用保鮮膜封起，暗室曝光(見圖7)。
由Westernbloting圖可以看到，hCRISP56在瞬轉(zhuǎn)的CHO細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞裂解中的蛋白含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于培養(yǎng)液中的蛋白含量，證明hCRISP56為一個(gè)典型的分泌蛋白；此外，細(xì)胞裂解中的蛋白分子量要比分泌到培養(yǎng)液中的蛋白分子量大，提示該分泌蛋白可能如ProPv.1.0b所分析的，存在著一個(gè)前肽的剪切位點(diǎn)，該位點(diǎn)的切割可能在使無活性的hCRISP56轉(zhuǎn)化為活性蛋白中起著重要的作用。
3.亞細(xì)胞定位1)鋪細(xì)胞接種CHO細(xì)胞；37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜。
2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染2ug hsp56-pcDNA3.1A質(zhì)粒3)熒光抗體染色轉(zhuǎn)染48-60h后，取出培養(yǎng)皿，置冰上5min，用PBS(pH7.4)洗2次，每次2ml；加入2％PFA(w/v)/0.1％Triton-X-100/PBS 1ml，冰上30min固定；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；Blocking，PBS/5％BSA，1ml/dish，室溫，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；吸去dish中的洗滌液，用鑷子取出蓋玻片，有細(xì)胞的一面朝上，放在吸水紙上；用蠟筆沿蓋玻片的四周劃一個(gè)方框，并沿玻片的中心線劃一條線，使左右兩半大小相當(dāng)；擦干原dish，將蓋玻片放回，玻片的一半加40-50ul PBS/5％BSA，另一半加一抗稀釋液；置濕盒內(nèi)，4℃，過夜，或4℃，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；玻片的兩半都加二抗稀釋液，4℃，2hrs；洗滌，PBS/0.05％Tween20，1ml/dish，5min×2；取干凈的載玻片一塊，作上標(biāo)記，滴一滴mounting solution，約15-20ul；用鑷子取出蓋玻片，邊緣搭在紙巾上吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，貼在載玻片上，不要有氣泡；蓋玻片的邊緣四周刷上無色指甲油，待干；擦去蓋玻片上表面析出的PBS鹽份(optional)；用熒光顯微鏡拍攝照片(見圖8)。
圖中可見hCRISP56表達(dá)于細(xì)胞漿中，進(jìn)一步證實(shí)該蛋白是一分泌蛋白。
實(shí)施例4hCRISP56蛋白CHO穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建1.穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建1)2μg真核表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞(35mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)12小時(shí)；2)消化至100mm培養(yǎng)皿，加G418至終濃度1000μg/ml(CHO)，培養(yǎng)2-3星期直至有克隆形成；3)吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，PBS洗兩次，胰酶浸泡過的無菌濾紙片覆蓋于克隆上，消化數(shù)分鐘后轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)。
2.如常規(guī)方法Western blot鑒定表達(dá)目的蛋白的克隆(見圖9)。
通過兩張圖片的對(duì)比可以進(jìn)一步確證hCRISP56為分泌蛋白，并且在細(xì)胞培養(yǎng)液中，我們可以看到有趣的現(xiàn)象，hCRISP56有呈現(xiàn)出三條不同的條帶。推測(cè)為hCRISP56經(jīng)過翻譯后修飾，被蛋白酶切割而產(chǎn)生具有活性的蛋白。
實(shí)施例5hCRISP56蛋白的表達(dá)、純化和特異性抗體的獲得1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建1)引物設(shè)計(jì)F-5’GTGAATTCATGAGCTGCGTCCTGGGT(SEQ ID NO.7)R-5’TGCTCGAGATTCACTGCCTGACAGCA(SEQ ID NO.8)2)PCR反應(yīng)，以克隆載體hCRISP56-pGEM Tesay為模板，58℃退火，35個(gè)循環(huán)。
3)Xho I與EcoR I雙酶切，37℃酶切2hr。
4)如常規(guī)方法連接，轉(zhuǎn)化，抽質(zhì)粒，酶切鑒定，結(jié)果見圖10。
2. hCRISP56蛋白的原核表達(dá)和純化1)hCRISP56蛋白的大量表達(dá)將轉(zhuǎn)化了BL21的質(zhì)粒涂平板，挑單克隆接種于5mlLB(Amp)培養(yǎng)基中，37℃搖床300rpm過夜；取2.5ml菌液接種于250mlLB(Amp)中，37℃搖床300rpm培養(yǎng)2hr；加入0.4mMIPTG誘導(dǎo)，26℃搖床200rpm培養(yǎng)4hr；8000rpm，4℃離心10min，去上清，加入預(yù)冷的PBS重懸；加入DTT至最終濃度為5mM，加入PMSF至最終濃度為100ug/ml；冰浴超聲裂解細(xì)胞成勻漿；加Triton X-100至終濃度1％，冰浴30min；12000rpm離心10min，分裝上清；2)hCRISP蛋白包涵體的洗脫Wash buffer A重懸菌體，8000rpm，30min，去上清；Wash buffer B重懸菌體，8000rpm，30min，去上清；用含有不同濃度尿素的Wash buffer C洗脫目的蛋白。
由于尿素的濃度達(dá)到8M時(shí)才獲得較高含量的hCRISP56融合蛋白(見圖11)，而尿素在后續(xù)的純化過程中不易除去，所以在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)了新的引物序列，得到的新DNA片段編碼hCRISP56的后段部分蛋白，該部分蛋白可以從上清中純化得到。
3)hCRISP56 last part融合蛋白的純化蛋白表達(dá)過程如常規(guī)操作；在收集的上清中加入適量50％Glutathione Sepharose 4B Slurry，4℃搖動(dòng)結(jié)合2hr；轉(zhuǎn)移到純化柱子中，用dilution buffer洗雜蛋白；換用GST Elution buffer洗脫，測(cè)蛋白濃度，并用蛋白電泳檢測(cè)(見圖12)。
圖中1代表未經(jīng)純化的上清，2代表結(jié)合后過柱的上清液，3代表洗脫下來的純化hCRISP56融合蛋白。表明本發(fā)明已經(jīng)獲得了純化的hCRISP56的部分蛋白，以此作為抗原來獲得對(duì)hCRISP56具有特異性的多克隆抗體。多克隆抗體的制備按常規(guī)方法。
實(shí)施例6Northern bloting獲得組織表達(dá)譜1)雜交膜的預(yù)處理(第一次所用的膜不需要這樣的高溫去探針處理，第二、三次再用同一塊膜時(shí)才用此法，第一次僅用膜于2×SSC浸泡10分鐘)在0.5％SDS溶液中處理印跡膜100℃ 10min，從加熱爐上取下來，室溫冷卻10min。
2)預(yù)雜交(prehybridization)68℃預(yù)熱ExpressHyb solution。
將膜放入2×SSC中，浸泡lO分鐘左右。把濕潤(rùn)好的膜貼雜交管管壁輕輕移入，避免產(chǎn)生氣泡。
變性sperm DNA(100℃水浴5min，立即放入冰中，5min)。5ml ExpressHyb+50μl spermDNA于15ml管子中充分混勻，然后再倒入雜交管中。
雜交爐中，68℃，10rpm/min，大于2小時(shí)。
3)標(biāo)記探針(labeling primer)探針是PCR產(chǎn)物，形成模板。
隨機(jī)引物標(biāo)記采用標(biāo)記試劑盒

加EDTA終止反應(yīng)(終濃度30mM)室溫，1min。附0.5M EDTA用量在1.5-3.0μl。
4)純化探針，用G25(或G50)柱子，原理凝膠過濾柱子平衡混勻柱子中的平衡液，掰掉柱子的封閉端，將柱子置于一新的離心管中，3000rpm，2min。倒掉平衡液在室內(nèi)的自來水池中，3000rpm，再離心1min。
柱子置于一新的離心管中，加入標(biāo)記好的探針液，3000rpm，2min，收集探針于1.5ml離心管中。從而去除掉未標(biāo)記的[α-32P]dCTP，小片斷(小于300bp)，留下較大片斷約500bp。
5)雜交純化后的探針應(yīng)立即變性100℃，5分鐘，立即冰上5分鐘。
把收集后的探針(25μl左右)加入到雜交管中的預(yù)雜交液中，切記勿將探針直接加到膜上，輕輕混勻，把雜交管再移入雜交爐中。68℃，2hours，10rpm.
6)洗膜低嚴(yán)緊度洗膜室溫，SDS 0.05％(wash solution I)把雜交液倒入廢液缸中，用wash solution I室溫洗膜3次(3×50ml)高嚴(yán)緊度洗膜50℃，SDS 0.1％(wash solution II)每次10min，于搖床中洗，換液5-8次，至劑量在300左右或以下，就可以停止洗膜。
7)封膜，壓片(保證膜在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都是濕潤(rùn)的)，用保鮮膜封膜，盡量無氣泡，以保證膜處在濕潤(rùn)狀態(tài)。膜放于磷屏上。(注意磷屏要事先消磁半小時(shí))，壓12小時(shí)左右即可。電腦掃描信號(hào)，使用的程序是arraytool-MCD-scan control.
采用Clontech公司的人類多組織RNA印跡膜對(duì)該基因的組織分布進(jìn)行研究。該印跡膜含12種組織，外周血白細(xì)胞、肺、胎盤、小腸、肝、腎、脾、胸腺、結(jié)腸、骨骼肌、心、腦。結(jié)果表明，該基因的mRNA分布廣泛，但其中胎盤、肺、小腸、心組織中表達(dá)量較高(見圖13)。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人新蛋白hCRISP56及其編碼序列<130>NP-1416<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>4574<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(205)..(1698)<400>1ggcggctgct cccattgagc tgtctgctcg ctgtgcccgc tgtgcctgct gtgcccgcgc 60tgtcgccgct gctaccgcgt ctgctggacg cgggagacgc cagcgagctg gtgattggag120ccctgcggag agctcaagcg cccagctctg cccgaggagc ccaggctgcc ccgtgagtcc180catagttgct gcaggagtgg agcc atg agc tgc gtc ctg ggt ggt gtc atc 231Met Ser Cys Val Leu Gly Gly Val Ile1 5ccc ttg ggg ctg ctg ttc ctg gtc tgc gga tcc caa ggc tac ctc ctg 279Pro Leu Gly Leu Leu Phe Leu Val Cys Gly Ser Gln Gly Tyr Leu Leu10 15 20 25ccc aac gtc act ctc tta gag gag ctg ctc agc aaa tac cag cac aac 327Pro Asn Val Thr Leu Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Tyr Gln His Asn30 35 40gag tct cac tcc cgg gtc cgc aga gcc atc ccc agg gag gac aag gag 375Glu Ser His Ser Arg Val Arg Arg Ala Ile Pro Arg Glu Asp Lys Glu45 50 55gag atc ctc atg ctg cac aac aag ctt cgg ggc cag gtg cag cct cag 423
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Tyr Ala Asp Thr Ser Ser Ile Cys Lys Thr Ala Val His Ala Gly Val435 440 445Ile Ser Asn Glu Ser Gly Gly Asp Val Asp Val Met Pro Val Asp Lys450 455 460Lys Lys Thr Tyr Val Gly Ser Leu Arg Asn Gly Val Gln Ser Glu Ser465 470 475 480Leu Gly Thr Pro Arg Asp Gly Lys Ala Phe Arg Ile Phe Ala Val Arg485 490 495Gln<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3gctgtcgccg ctgctaccgc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4gacgcccctt ctcccctggt20<210>5
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5agtctagaca tgagctgcgt20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>7gtgaattcat gagctgcgtc ctgggt 26<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8tgctcgagat tcactgcctg acagca 2權(quán)利要求
1.一種分離的人hCRISP56蛋白多肽，其特征在于，所述多肽具有與SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的人hCRISP56蛋白多肽，其特征在于，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包括編碼具有人hCRISP56蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列雜交的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
5.如權(quán)利要求3所述的一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ IDNO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求3所述的分離的多核苷酸。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有hCRISP56蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(a)將編碼具有hCRISP56蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hCRISP56蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸205-1698位的核苷酸序列有至少70％同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hCRISP56蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hCRISP56蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hCRISP56蛋白活性的多肽。
9.一種抗體，其特征在于，所述抗體是能與權(quán)利要求1所述的hCRISP56蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種探針分子，其特征在于，所述的探針分子含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸中約8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的人類蛋白多肽hCRISP56、該蛋白多肽的編碼序列、含有該編碼序列的載體及宿主細(xì)胞，以及該蛋白的抗體。本發(fā)明還公開了一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人hCRISP56蛋白和核酸序列的方法。根據(jù)對(duì)hCRISP56的同源性分析，hCRISP56與25kD胰蛋白酶抑制劑有較高的同源性。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1749273SQ20041006639
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者祁佳, 張海擴(kuò), 趙斌, 黃健, 韓澤廣 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心