專利名稱：Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用基因診斷遺傳性疾病的方法，具體的說是一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
1871年德國眼科醫(yī)師Theodor Leber首次報(bào)道一家族遺傳性視神經(jīng)病變，主要表現(xiàn)為急性或亞急雙側(cè)中心視力喪失，僅通過母系傳遞，常累及青年男性，現(xiàn)稱為Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)。1988年Wallace等首次發(fā)現(xiàn)LHON與線粒體DNA(mtDNA)G11778A突變相關(guān)，至今已報(bào)道的相關(guān)mtDNA突變有40多種，其中90％-95％的LHON患者與三個(gè)原發(fā)性mtDNA突變(G11778A，G3460A和T14484C)相關(guān)。不同種族各種原發(fā)致病突變位點(diǎn)分布情況不同，白種人種中90％以上的LHON患者有G11778A，G3460A和T14484C位點(diǎn)中的一個(gè)突變，歐洲患者的這3個(gè)突變分別占50％～70％、15％～25％和15％；亞洲人群LHON家系中G11778A位點(diǎn)突變率很高，占90％以上。郭向明等對140例中國人LHON患者mtDNA 3個(gè)原發(fā)致病突變G11778A，G3460A和T14484C位點(diǎn)進(jìn)行突變頻譜分析，發(fā)現(xiàn)其突變率分別為92.9％、1.4％和5.7％。因此，利用基因鑒別診斷手段篩查LHON患者的首選就是分析mtDNA 3個(gè)原發(fā)致病突變位點(diǎn)。
針對Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的早期臨床診斷較難，特別是散發(fā)病例(即無家族病例史)，利用基因診斷成為確診該疾病的有力手段。LHON的mtDNA位點(diǎn)突變檢測方法很多，其原理都是基于PCR技術(shù)，包括傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR、SSCP-PCR、RFLP-PCR和線粒體基因組DNA測序等，這些方法的第一步都需要提取外周血樣中的mtDNA，有的還從分離淋巴細(xì)胞開始，所需時(shí)間較長、費(fèi)用較高。傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR較其他方法具有快速、簡單等特點(diǎn)，但一次PCR只能鑒別一個(gè)突變位點(diǎn)；RFLP-PCR法所用的限制性內(nèi)切酶受諸多因素影響常常導(dǎo)致酶切反應(yīng)失敗，造成結(jié)果誤判；SSCP-PCR法不僅耗時(shí)費(fèi)用高，且實(shí)驗(yàn)條件要求較高等因素影響了對LHON的臨床基因診斷的開展；而mtDNA全基因組測序價(jià)格昂貴等原因只適應(yīng)于科研。Yohsuke Minatogawa等報(bào)道一種直接利用全血細(xì)胞裂解液作模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，該方法需要microLYSISTM buffer(COSMO BIO Co.Ltd)來裂解細(xì)胞。
與本發(fā)明相關(guān)發(fā)明專利是1997年2月19日公開的“Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變檢測方法及其試劑盒(申請?zhí)?6116296.1)”，該發(fā)明僅針對線粒體DNAG11778A位點(diǎn)突變的LHON患者，需要溶血液經(jīng)變性提取總DNA，PCR擴(kuò)增目的基因片斷以及SfaNI限制性內(nèi)切酶消化和電泳等繁瑣的步驟，不僅耗時(shí)而且增加了相應(yīng)的費(fèi)用。
因此，建立一套快速、簡易、特異性好又靈敏度高的LHON基因診斷技術(shù)體系及制備其試劑盒將有助于普及推廣該病的臨床基因診斷。
從包括中國專利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，利用全血樣等位基因特異性多重PCR技術(shù)，單管一次性PCR同時(shí)檢測LHON線粒體DNA 3個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)尚未見到其相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為臨床提供一種快速、簡易基因診斷Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的檢測方法及其試劑盒。
本發(fā)明依據(jù)國內(nèi)外對Leber遺傳性視神經(jīng)病變的分子遺傳學(xué)研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)人類90％以上的Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA突變屬于3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)(G11778A，G3460A和T14484C)，利用等位基因位點(diǎn)特異性PCR法檢測線粒體DNA的點(diǎn)突變，就能達(dá)到明確檢測本遺傳性疾病的目的。
本發(fā)明提供的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒，是以直接加入全血樣作DNA模板，利用等位基因位點(diǎn)特異性多重PCR方法，同時(shí)檢測LHONmtDNA的3個(gè)原發(fā)致病性突變位點(diǎn)(G11778A，G3460A和T14484C)。該試劑盒包括的3對PCR引物的上游引物3’-末端為突變堿基，通過優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，PCR僅能在帶有點(diǎn)突變的患者血樣中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，而正常人沒有PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。因此，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙啶染色和紫外檢測PCR產(chǎn)物的有無以及PCR產(chǎn)物片段的大小，就能確診本病，即如果PCR產(chǎn)物長為222bp，則為G11778A突變的LHON患者；PCR產(chǎn)物為294bp，則為T14484C突變患者；PCR產(chǎn)物為360bp，是G3460A位點(diǎn)突變患者；若出現(xiàn)2條帶，比如一條PCR產(chǎn)物長為222bp，另一條為294bp，則說明該LHON患者含有G11778A和T14484C 突變，其余的依次類推；若出現(xiàn)3條帶，則說明該LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三突變。一般來說LHON患者中出現(xiàn)雙位點(diǎn)突變是非常非常之稀少，僅見國外報(bào)道1例，而同時(shí)具有這3個(gè)位點(diǎn)突變的LHON患者目前仍未見報(bào)道。
本發(fā)明提供的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒主要針對具有3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)(G11778A，G3460A和T14484C)的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者的基因診斷。
本發(fā)明提供的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒，其特征在于該基因診斷試劑盒是直接利用全血樣作PCR的DNA模板，不需要純化血樣中的DNA，而且只需要0.5-1.0μl的微量血樣。
本發(fā)明提供的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒，其特征在于該基因診斷試劑盒是利用等位基因位點(diǎn)特異性多重PCR(MAS-PCR)法，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)單管一次性PCR反應(yīng)同時(shí)檢測mtDNA的3個(gè)原發(fā)致病性突變位點(diǎn)(G11778A，G3460A和T14484C)來診斷LHON疾病。
本發(fā)明的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒組成部件見下表-1表-1 Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒組成1.TaKaRa Ex Taq(5U/μl)50μl2.10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 1ml3.dNTP Mixture(各2.5mM) 800μl4.MAS PCR primers mixture(各20pM) 600μl5.6×Loading Buffer 1ml上述試劑盒中PCR引物是根據(jù)人類線粒體基因組DNA(mtDNA)序列以及mtDNA G11778A、G3460A和T14484C點(diǎn)突變設(shè)計(jì)的，即在3條上游PCR引物的3’-末端設(shè)計(jì)為突變堿基，其DNA序列見下表-2表-2 MAS PCR primers組成及其序列引物名稱 核酸位置引物序列MS11778F11759～11778nt 5’-TACGAACGCACTCACAGACA-3’MS14484F14460～14484nt 5′-CTGTAGTATATCCAAAGACAACGAC-3′MS3460F 3441～3460nt5’-ACTACAACCCTTCGCTGTCA-3’11778R 11961～11980nt 5’-GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3’14484R 14734～14753nt 5’-GGGTCATTGGTGTTCTTGTA-3’3460R 3781～3800nt5’-AGGGTGGAGAGGTTAAAGGA-3’用本發(fā)明上述試劑盒基因診斷Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法，按下列步驟進(jìn)行1) 按下表配制MAS-PCR反應(yīng)體系(25μl)，混勻置于PCR儀上；10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μlMAS PCR primers mixture(各20pM)1.5μl全血樣本 0.5μlTaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.13μldH2O 19.37μl2) 按以下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃4min預(yù)變性→94℃30sec 30個(gè)循環(huán)→72℃4min→4℃保存59.8℃ 30sec72℃45sec3) 反應(yīng)結(jié)束后，加入5μl 6×Loading Buffer混合，取10-15μl經(jīng)1.5％-1.8％的瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘后于紫外儀上觀察。若出現(xiàn)222bp大小的PCR產(chǎn)物，則為G11778A點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)294bp大小的PCR產(chǎn)物，則為T14484C點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)360bp大小的PCR產(chǎn)物，則為G3460A點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)2條帶，比如一條PCR產(chǎn)物長為222bp，另一條為294bp，則說明該LHON患者含有G11778A和T14484C雙突變，其余的依次類推；若出現(xiàn)3條帶，則說明該LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三個(gè)位點(diǎn)突變；若沒有特異性PCR產(chǎn)物條帶，則90％以上可以排除其為LHON患者。
本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明是以直接加入全血樣作PCR的DNA模板，利用MAS-PCR法，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)單管一次性PCR反應(yīng)同時(shí)檢測LHONmtDNA的3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)(G11778A，G3460A和T14484C)。因此，該方法較目前檢測LHON mtDNA位點(diǎn)突變的方法具有明顯的三大優(yōu)點(diǎn)1)直接采用外周全血樣作DNA模板，不需要額外的細(xì)胞裂解和純化mtDNA，因此大大縮短診斷的時(shí)間和減少相應(yīng)的費(fèi)用；2)所需血樣量少，僅需要末梢一滴血樣就可以進(jìn)行診斷，這也解決了老年人和小孩血樣采集較難的問題，且可將血樣保存于濾紙上通過郵寄進(jìn)行診斷；3)單管一次性PCR同時(shí)檢測LHONmtDNA的3個(gè)原發(fā)致病突變位點(diǎn)，能夠覆蓋90％以上的LHON患者的診斷，而且具有更快速、簡易和高效等優(yōu)點(diǎn)。由此可見，該方法克服了目前LHON的臨床基因診斷的缺點(diǎn)，非常適合于LHON的快速臨床基因診斷，具有巨大的普及推廣應(yīng)用價(jià)值。


圖1利用本發(fā)明提供的試劑盒進(jìn)行等位基因特異性多重PCR法檢測LHONmtDNA 3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)的電泳結(jié)果。其中，MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)X174-HincIIdigest；AmtDNAG11778A點(diǎn)突變的LHON患者血樣；BmtDNAT14484C點(diǎn)突變的LHON患者血樣；CmtDNA G3460A點(diǎn)突變的LHON患者血樣；DmtDNA G11778A和T14484C點(diǎn)突變的LHON患者混和血樣；EmtDNA G11778A和G3460A點(diǎn)突變的LHON患者混和血樣FmtDNA T14484C和G3460A點(diǎn)突變的LHON患者混和血樣；GmtDNA G11778A、T14484C和G3460A點(diǎn)突變的LHON患者混和血樣；H正常人血樣(陰性對照)。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1本發(fā)明的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒該試劑盒組成(400次反應(yīng)量)1.TaKaRa Ex Taq(5U/μl)50μl2.10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 1ml3.dNTP Mixture(各2.5mM)800μl4.MAS PCR primers mixture(各20pM) 600μl5.6×Loading Buffer1ml上表中MAS PCR primers組成及其DNA序列引物名稱 核酸位置引物序列MS11778F 11759～11778nt 5’-TACGAACGCACTCACAGACA-3’MS14484F 14460～14484nt 5′-CTGTAGTATATCCAAAGACAACGAC-3′MS3460F 3441～3460nt5’-ACTACAACCCTTCGCTGTCA-3’11778R11961～11980nt 5’-GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3’14484R14734～14753nt 5’-GGGTCATTGGTGTTCTTGTA-3’3460R 3781～3800nt5’-AGGGTGGAGAGGTTAAAGGA-3’實(shí)施例2基因診斷Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的檢測方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1) 按下表配制MAS PCR反應(yīng)體系(25μl)，混勻置于PCR儀上；10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) 2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μlMAS PCR primers mixture(各20pM)1.5μl全血樣本 0.5μlTaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.13μldH2O 19.37μl
2) 按以下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 4min預(yù)變性→94℃ 30sec 30個(gè)循環(huán)→72℃4min→4℃保存59.8℃ 30sec72℃ 45sec3) 應(yīng)結(jié)束后，加入5μl 6×Loading Buffer混合，取10-15μl經(jīng)1.5％-1.8％的瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘后于紫外儀上觀察。若出現(xiàn)222bp大小的PCR產(chǎn)物，則為G11778A點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)294bp大小的PCR產(chǎn)物，則為T14484C點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)360bp大小的PCR產(chǎn)物，則為G3460A點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)2條帶，比如一條PCR產(chǎn)物長為222bp，另一條為294bp，則說明該LHON患者含有G11778A和T14484C雙突變，其余的依次類推；若出現(xiàn)3條帶，則說明該LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三個(gè)位點(diǎn)突變；若沒有特異性PCR產(chǎn)物條帶，則90％以上可以排除其為LHON患者(見圖1)。
權(quán)利要求
1.一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒的部件組成如下表1.TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 50μl2.10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)1ml3.dNTP Mixture(各2.5mM) 800μl4.MAS PCR primers mixture(各20pM) 600μl5.6×Loading Buffer 1ml其中，MAS PCR primers的組成及其DNA序列如下表引物名稱核酸位置 引物序列MS11778F11759～11778nt 5’-TACGAACGCACTCACAGACA-3’MS14484F14460～14484nt 5′-CTGTAGTATATCCAAAGACAACGAC-3′MS3460F 3441～3460nt 5’-ACTACAACCCTTCGCTGTCA-3’11778R 11961～11980nt 5’-GGAGTATAGGGCTGTGACTA-3’14484R 14734～14753nt 5’-GGGTCATTGGTGTTCTTGTA-3’3460R 3781～3800nt 5’-AGGGTGGAGAGGTTAAAGGA-3’
2.一種臨床基因診斷Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1)按下列組分配制MAS-PCR反應(yīng)體系(25μl)，混勻，置于PCR儀上；10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5μldNTP Mixture(各2.5mM) 1.0μlMAS PCR primers mixture(各20pM) 1.5μl全血樣本 0.5μlTaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.13μlddH2O 19.37μl2)按以下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94℃4min預(yù)變性→94℃30sec 30個(gè)循環(huán)→72℃4min→4℃保存59.8℃ 30sec72℃45sec3)反應(yīng)結(jié)束后，加入5μl 6×Loading Buffer混合，取10-15μl經(jīng)1.5％-1.8％的瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘后于紫外儀上觀察。若出現(xiàn)220bp大小的PCR產(chǎn)物，則為G11778A點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)292bp大小的PCR產(chǎn)物，則為T14484C點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)360bp大小的PCR產(chǎn)物，則為G3460A點(diǎn)突變的LHON患者；若出現(xiàn)2條帶，比如一條PCR產(chǎn)物長為220bp，另一條為292bp，則說明該LHON患者含有G11778A和T14484C雙突變，其余的依次類推；若出現(xiàn)3條帶，則說明該LHON患者含有G11778A，G3460A和T14484C三個(gè)位點(diǎn)突變；若沒有特異性PCR產(chǎn)物條帶，則90％以上可以排除其為LHON患者。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變的基因診斷試劑盒及其檢測方法，屬利用基因診斷遺傳性疾病的方法。該發(fā)明是根據(jù)90％以上的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變患者的線粒體DNA突變屬于3個(gè)原發(fā)性致病位點(diǎn)突變(G11778A，G3460A和T14484C)，設(shè)計(jì)和合成位點(diǎn)特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術(shù)，單管一次性PCR反應(yīng)，同時(shí)檢測LHON患者的線粒體DNA 3個(gè)原發(fā)性致病突變位點(diǎn)，具有簡便快速、高效、費(fèi)用低、特異性好、只需微量血液樣本等優(yōu)點(diǎn)，為LHON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡易、可靠的方法和試劑盒，具有巨大的普及推廣應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661116SQ20051000609
公開日2005年8月31日 申請日期2005年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月11日
發(fā)明者陽菊華, 童繹, 陳貽鍇, 林宇嵐 申請人:福建醫(yī)科大學(xué)