專利名稱：腫瘤轉移相關蛋白及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域中的腫瘤轉移相關蛋白及其編碼基因。
背景技術：
腫瘤轉移一直以來是腫瘤臨床治療所面臨的最嚴峻挑戰(zhàn)。雖然人們早已知道腫瘤轉移是一個包括多個步驟的過程，但對其分子生物學機理尚未完全明了。近十幾年來，腫瘤轉移研究的重點轉入克隆和鑒定調控腫瘤轉移表型相關基因或轉移過程不同階段相關基因的領域，試圖揭示腫瘤轉移在基因水平的本質。上世紀八十年代，在Filder的腫瘤異質理論的基礎上，Wessinman提出了表型克隆的概念，使得在基因的確切染色體定位及其生化功能未知的情況下克隆與細胞某一表型相關的基因成為可能，基于此理論的技術已成為現代分子生物學一個重要的研究手段。
發(fā)明創(chuàng)造內容本發(fā)明的目的是提供腫瘤轉移相關蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的腫瘤轉移相關蛋白，名稱為PCMAG1，來源于人屬人(Homosapiens)，是具有序列表中SEQ ID №5氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQID №5的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與腫瘤轉移相關的由SEQ ID №5衍生的蛋白質。
序列表中的序列5由434個氨基酸殘基組成。
上述腫瘤轉移相關蛋白的活性片段PCMAG1-A，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多肽，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與腫瘤轉移相關的由SEQ ID №2衍生的多肽。
序列表中的序列2由122個氨基酸殘基組成，由序列表中序列5的自氨基端的第313-434位氨基酸殘基組成。
生物信息學分析表明PCMAG1具有兩個N-糖基化(N-glycosylation)位點(自序列5的氨基端第378-381位氨基酸殘基和第386-389位氨基酸殘基，即自序列2的氨基端第66-69位氨基酸殘基和第74-77位氨基酸殘基)，一個酪蛋白激酶(Caseinkinase)II磷酸化位點(自序列5的氨基端第329-332位氨基酸殘基，即自序列2的氨基端第17-20位氨基酸殘基)和一個N-豆蔻?；?N-myristoylation)位點(自序列5的氨基端第361-366位氨基酸殘基，即自序列2的氨基端第49-54位氨基酸殘基)。
上述腫瘤轉移相關蛋白及其活性片段的編碼基因均屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述腫瘤轉移相關蛋白的編碼基因，名稱為pcmag1，可具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №5蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中序列4的cDNA序列由2354個堿基組成，該基因的編碼序列為自5’端第124到第1428位堿基序列。
上述腫瘤轉移相關蛋白活性片段的編碼基因，名稱為pcmag1-a，可具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中序列1的cDNA序列由1420個堿基組成，該基因的編碼序列為自5’端第34到第402位堿基序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有本發(fā)明腫瘤轉移相關蛋白及其活性片段的編碼基因的表達載體、細胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
實驗表明PCMAG1的活性片段PCMAG1-A對人肺巨細胞癌細胞系PLA-801的低轉移株PLA-801C細胞生長有明顯的促進作用；轉染pcmag1-a正義表達載體的PLA-801C細胞株的S期和S+G2/M期所占的比例明顯高于空載體對照；RT-PCR結果顯示，在轉染pcmag1-a正義表達載體的PLA-801C細胞株中，MMP-2的mRNA含量是轉染空載體對照細胞的2.5倍；細胞定位實驗初步表明pcmag1-a表達產物存在于細胞漿中；在已經經病理診斷證實有肺內或淋巴結轉移的12個病例中，pcmag1-a在8例標本中有較強的表達；在病理診斷尚未發(fā)現轉移的12個病例中，pcmag1-a在4例中有較強的表達；在5例癌旁組織標本中，pcmag1-a僅在兩例標本中有微弱表達。以上實驗結果說明PCMAG1及其活性片段PCMAG1-A與腫瘤轉移密切相關。
本發(fā)明的腫瘤轉移相關蛋白及其編碼基因為進一步研究腫瘤轉移發(fā)生的分子機制提供了線索，并具有潛在的臨床應用價值。


圖1為PCR檢測抑制消減雜交效率圖2為RT-PCR驗證目的序列在兩株細胞中表達的差異圖3為pcmag1-a的Northern雜交結果圖4為MTT摻入實驗分析pcmag1-a對細胞生長的影響曲線圖5為流式細胞分析轉染各株細胞周期組成的變化柱狀6為pcmag1-a亞細胞定位照片圖7為RT-PCR分析轉染前后細胞中MMP-2的mRNA變化的電泳圖譜圖8A為RT-PCR分析pcmag1-a在已經病理診斷證實有肺內或淋巴結轉移的標本中表達情況的電泳圖譜圖8B為RT-PCR分析pcmag1-a在經病理診斷證實尚未發(fā)生轉移的標本中表達情況的電泳圖譜圖9為PCMAG1-A原核表達結果圖10為抗PCMAG1-A兔多克隆抗體的效價分析圖11為應用抗His標簽抗體檢測原核表達的PCMAG1-A圖12為pcmag1在PLA-801D中的表達檢測圖13為應用抗PCMAG1-A兔多克隆抗體檢測PLA-801C和PLA-801D中PCMAG1內源性表達的差異圖14為應用siRNA方法影響PCMAG1在PLA-801D中的表達具體實施方式
下述實施例中所提到的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
模型細胞株所用細胞株為PLA-801C和PLA-801D(購自三○一醫(yī)院)，是應用有限稀釋法從人肺巨細胞癌母系PLA-801中分離建株的細胞(陸應麟等.人肺巨細胞癌PLA-801母系細胞及其克隆化細胞株(A，C，D，E)裸鼠皮下種植后自發(fā)轉移特性的研究.中華腫瘤雜志，1989，11(1)，3-7)，分子遺傳學分析表明二者具有較為一致的核型(Mei L，Lezhen C.Po Z et al.Study on the metastatic mechanisms of human giant-celllung carcinoma comparison between the strains C and D.Asian Pac J AllergyImmunol.1998，16(4)，167-176)，其中D株具有較強的轉移能力而C株細胞沒有轉移能力(蔣代鳳，劉萬里，陸應麟等IL-18促進肺癌細胞轉移的功能鑒定.中華腫瘤雜志，2003，25(4)，348-352；Jiang D，Ying W，Lu Y，et al Identification ofmetastasis-associated protein by protiomic analysis and functionexploration of interleukin-18 in metastasis.Proteomics，2003，3(5)，724-737)。它們是研究腫瘤轉移的良好模型。細胞株用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。
實施例1、PCMAG1活性片段PCMAG1-A及其編碼基因的獲取及其在模型細胞中表達差異的驗證1、抑制消減雜交利用Advantage cDNA PCR試劑盒(ClonTech)，按試劑盒操作建議進行抑制消減雜交。具體步驟如下以具有高轉移潛能的PLA-801D為實驗方(Tester)，不具有轉移潛能的PLA-801C為驅動方(Driver)。從上述兩株細胞中分離mRNA合成cDNA并經過RsaI酶切并純化后溶于水中，Driver不做處理，Tester分為兩份，利用T4連接酶分別接上兩種特異的接頭1和2(接頭15-ctaatacgactcactatagggctcgagcggccgcccgggcaggt-33-ggcccgtcca-5接頭25-ctaatacgactcactatagggcagcgtggtcgcggccgaggt-33-gccggctcca-5)，得到Tester1和Tester2，然后進行兩次雜交。第一輪雜交為Tester1和Tester2分別與Driver雜交，然后再將第一次的兩種雜交產物和過量的Driver三者同時混合進行第二次雜交。雜交產物經巢式PCR進行兩次擴增后與pGEM-T載體連接，轉化大腸桿菌J M109，PCR鑒定是否有插入片段。通過比較看家基因G3PDH在消減和未消減樣品中的豐度分析抑制消減雜交效率。結果如圖1所示，表明在SSH中得到的多個含有目的基因片段的細菌克隆經PCR確認含有長度在250-700bp之間的外源基因片段；經過消減，在兩株細胞中豐度相同的轉錄子得到有效抑制。圖1中，1-4為未消減對照樣品在PCR第18、23、28、33個循環(huán)時的電泳情況；5-8分別為兩輪消減后樣品在PCR第18、23、28、33個循環(huán)時的電泳情況，MDL2000 Marker。
2、基因芯片對抑制消減雜交得到的差異片段進行初篩挑選步驟1中的能夠擴增出單一、清晰條帶的克隆，并將其PCR產物進行純化后以0.5μg/μl的濃度點在氨基化玻片上制成基因芯片，然后參照Schena(SchenaM，Shalon D，Davis RW，et al.Quantitative monitoring of gene expressionpatterns with a complementary DNA microarray.Science 1995，270(5235)，467-470)的方法用源于兩株細胞、分別用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP標記cDNA探針，與芯片在48℃雜交14-18h，雜交完成后用ScanArray3000激光掃描儀用兩種不同波長(Cy3，550nm Cy5，649nm)的激光分別掃描，最后ImaGene3.0軟件分析以確定在兩種波長的激光下熒光信號的強度和比值，從而得知每一個克隆在兩株細胞中的表達情況。結果共得到101條表達具有顯著性差異的EST片段(分別命名為1-101號)。將上述具有表達差異的EST片段進行測序以后，與核酸數據庫和蛋白質數據庫中的序列進行比較。除去相同的序列共得到79條與肺巨細胞癌細胞轉移呈正相關的序列。
3、測序、生物信息學分析序列測定由諾賽基因公司協助進行，使用的測序儀為ABI-3730XL。然后利用互聯網上相關資源對與高轉移表型密切相關的ESTs進行分析。結果表明3號(346bp，序列表中序列3)與BC006236同源，設計引物(上游引物5-cttgcaggaacttgcatcaa-3，下游引物5-caacggcattatattgctgtc-3)按照常規(guī)方法從PLA-801D細胞中利用RT-PCR擴增出長度為1420bp的片段，測序結果表明其具有序列表中序列1的核苷酸序列，名稱為pcmag1-a；生物信息學分析該1420bp片段在基因組上的相應序列定位于4q21，由4個外顯子組成，長約為8.5Kbp，所有的內含子/外顯子符合GT/AG剪切模式，序列末端具有典型的“AATAAA”添加polyA尾的信號。對該cDNA序列在基因組上的相應序列前約2000bps的基因序列進行了分析，發(fā)現在該cDNA的第一個外顯子前面有可能的啟動子序列，該1420bp片段預測所得的分值為0.92(此值表明僅有0.1-0.3％的假陽性的可能)。ORF分析表明，該1420bp片段有一個編碼122個氨基酸殘基(序列2)的ORF，為序列表中序列1的自5’端第34到第402位堿基。通過對這個多肽序列進行同源檢索后，未發(fā)現與已知功能蛋白序列同源。該多肽以α螺旋為主并含有部分片層結構和無規(guī)卷曲，更精細的分析表明該多肽具有兩個N-糖基化(N-glycosylation)位點(自序列2的氨基端第66-69位氨基酸殘基和第74-77位氨基酸殘基)，一個酪蛋白激酶(Casein kinase)II磷酸化位點(自序列2的氨基端第17-20位氨基酸殘基)和一個N-豆蔻?；?N-myristoylation)位點(自序列2的氨基端第49-54位氨基酸殘基)。
4、RT-PCR針對pcmag1-a序列分別設計如下引物，上游引物5-TGTTTAAAAAGG GGAGCTTTG-3，下游引物5-CAACGGCATTATATTGCTGTC-3；內參照G3PDH引物序列上游引物5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3利用PLA-801C和PLA-801D的總RNA和OligodT15引物按常規(guī)方法逆轉錄成cDNA后，進行PCR擴增。擴增參數如下于94℃變性5分鐘之后，再于94℃30秒；54℃30秒；72℃90秒，擴35個循環(huán)，最后于72℃延伸7分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。結果如圖2所示，pcmag1-a的擴增片段長度為1399bp，pcmag1-a在PLA-801D中的表達遠高于在PLA-801C中的表達。圖2中，C表示PLA-801C，D表示PLA-801D。
5、Northern雜交將PLA-801C、D兩株細胞的總RNA甲醛變性凝膠電泳后利用毛細管法轉到硝酸纖維素膜上，分別以3號片段(346bp，序列3)為模板，利用PCR法標記的32P同位素探針與膜在雜交液(50％甲酰胺、0.1％SDS、5×SSPE、2×Denhardt)中于42℃雜交16-24小時，按常規(guī)方法洗膜、顯影。結果如圖3所示，表明pcmag1-a在PLA-801D中的表達遠遠高于在PLA-801C中的表達。圖3中，C表示PLA-801C，D表示PLA-801D。
實施例2、pcmag1-a功能的鑒定1、真核表達載體的構建及轉染按照常規(guī)方法將pcmag1-a的cDNA(1420bp)序列正向(EcoRI單酶切)或反向(EcoRI、BamHI雙酶切)插入pcDNA3(美國Clontech公司)的多克隆位點構建得到其正義真核表達載體pcDNA3-spcmag1-a和反義真核表達載體pcDNA3-apcmag1-a。以空載體pcDNA3為對照，利用lipofectamin2000(美國GIBCO/Invitrogen公司)將正義表達載體轉染入具有低轉移潛能的細胞株PLA-801C中，反義載體轉染入具有高轉移潛能的細胞株PLA-801D中，利用G418篩選出抗性細胞，并對抗性細胞進行PCR鑒定，得到轉染正義表達載體pcDNA3-spcmag1-a的細胞株-PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和轉染反義表達載體pcDNA3-apcmag1-a的細胞株-PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a。將空載體pcDNA3轉入PLA-801C或PLA-801D中，得到轉染空載體的對照細胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3。
2、轉染細胞的生長特性通過MTT摻入實驗觀察轉染細胞的生長特性將用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)至對數生長期的PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a及轉染空載體pcDNA3的對照細胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3消化、計數，調整到1000個細胞/毫升，然后在96孔板中每孔分別接種200個細胞，分別在接種的第2、4、6、8、10、12、14天，在細胞中加入MTT(25mg/ml)20μl后繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，小心吸棄上清并加入200μl二甲基亞砜，每株細胞每次設6個平行孔，待紫色結晶溶解完全后，用酶聯儀測其492nm處的吸光度以檢測各株細胞的增殖活力。結果如圖4所示，表明pcmag1-a對PLA-801C細胞生長有促進作用，pcDNA3-apcmag1-a抑制了PLA-801D細胞的生長。
3、pcmag1-a對細胞周期的影響采用流式細胞儀分析細胞周期將用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)至對數生長期的PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a以及轉染空載體的對照細胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3用PBS洗滌后，以含3％小牛血清的70％乙醇于-20℃固定24小時后以PBS洗去固定液，加入0.2ml RNase(1mg/ml)于37℃消化30分鐘后，以100μg/ml的碘化丙啶(PI)染色20分鐘后上機檢測。結果如圖5所示，表明與對照細胞相比，轉染正義載體pcDNA3-spcmag1-a的細胞株的S期(P＜0.01)和S+G2/M期(P＜0.05)明顯升高；轉染反義載體pcDNA3-apcmag1-a細胞株的S期和S+G2/M期均無明顯變化。圖5中，cv為對照PLA-801CpcDNA3、dv為對照PLA-801DpcDNA3；c1為PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a，d1為PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a。
4、pcmag1-a對細胞MMP-2(明膠酶)轉錄的影響利用PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a和PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a以及轉染空載體的對照細胞PLA-801CpcDNA3和PLA-801DpcDNA3的總RNA和OligodT15引物分別按常規(guī)方法逆轉錄成cDNA后，進行PCR擴增，1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物，結果如圖7。其中，MMP-2上游引物CGCCTTTAACTGGAGCAAAAA，下游引物GGAGCCACTCTCTGGAATCTT；內參照為G3PDH，其上游引物5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。通過圖像分析電泳照片發(fā)現轉染正義載體的細胞株PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a其MMP-2的mRNA含量是空載體對照PLA-801CpcDNA3的2.5倍。圖7中，cv為對照PLA-801CpcDNA3、dv為對照PLA-801DpcDNA3；c1為PLA-801CpcDNA3-spcmag1-a，d1為PLA-801DpcDNA3-apcmag1-a。
大量研究表明，明膠酶在多種惡性腫瘤組織、培養(yǎng)的腫瘤細胞及癌基因轉化細胞中活性增強，體內、外侵襲實驗均證實腫瘤細胞的高侵襲能力與明膠酶的活性增強有關，因而被認為可能是腫瘤侵襲、轉移過程中主要蛋白水解酶。越來越多的研究表明MMP-2在腫瘤細胞介導的細胞外基質降解中起關鍵作用。MMP-2活性和表達的增加與人類多種惡性腫瘤侵襲轉移潛能及預后密切相關(Davies B，Waxman J，Wasan H，et al.Levels of matrix metalloproteinase in bladder cancer correlatewith tumor grade and invasion.Cancer Res，1993，535365-5369.)，而pcmag1-a可能通過增強MMP-2的表達影響腫瘤侵襲和轉移，與腫瘤轉移密切相關。
5、pcmag1-a在臨床標本中的表達檢測取經病理診斷證實有肺內或淋巴結轉移的12個病例的新鮮腫瘤標本和病理診斷尚未發(fā)現轉移的12個病例的新鮮腫瘤標本以及5例癌旁組織標本細胞，按常規(guī)方法提取總RNA，以OligodT15為引物逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增，1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。其中，擴增pcmag1-a的引物為上游引物5-TGTTTAAAAAGGGGAGCTTTG-3，下游引物5-CAACGGCATTATATTGCTGTC-3；內參照為G3PDH，其引物序列同步驟4。結果如圖8A和圖8B所示，表明在已經經病理診斷證實有肺內或淋巴結轉移的12個病例中，pcmag1-a在8例標本中有較強的表達；在病理診斷尚未發(fā)現轉移的12個病例中，pcmag1-a在4例中有較強的表達。此外，在5例癌旁組織標本中，pcmag1-a僅在兩例標本中有微弱表達。圖8A為經病理診斷證實有肺內或淋巴結轉移的12個病例；圖8B為經病理診斷未發(fā)現肺內或淋巴結轉移的12個病例；它們均購自北京醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院標本庫。
實施例3、pcmag1-a表達產物的細胞定位按照常規(guī)方法將pcmag1-a的ORF(自序列1的5’端第34到第402位堿基)插入質粒pDsRed1-N1(美國，Clontech公司)的EcoRI、BamHI兩個限制性內切酶識別位點之間，構建表達pcmag1-a與紅色熒光蛋白融合蛋白的質粒pDsRed1-N1-M1，將其轉染入PLA-801C細胞株中，觀察融合蛋白的亞細胞定位，借此來初步判斷pcmag1-a蛋白產物的亞細胞定位，以空載體pDsRed1-N1為對照。結果如圖6所示，表明融合蛋白定位于細胞漿中，而空載體對照彌散于全細胞中。圖6中，左側圖片為轉染空載體pDsRed1-N1的細胞株，右側圖片為轉染融合表達載體pDsRed1-N1-M1的細胞株。
實施例4、PCMAG1及其編碼基因的獲得1、PCMAG1-A的原核表達及抗體制備將pcmag1-a的ORF(自序列1的5’端第34到第402位堿基序列)克隆入原核表達載體pGEX-6p-1(Amersham Biosciences)的限制性內切酶EcoR I和Xho I的識別位點間或pET-28a(+)(Novagen)的限制性內切酶EcoR I和Xho I的識別位點間，經酶切鑒定和PCR鑒定得到的含有GST或6×his的融合蛋白質基因的重組質粒pGEX-6p-1-pcmag1-a和pET-28a(+)-pcmag1-a。將pGEX-6p-1-pcmag1-a或pET-28a(+)-pcmag1-a分別導入宿主菌BL21，經篩選得到含有pGEX-6p-1-pcmag1-a或pET-28a(+)-pcmag1-a的工程菌。37℃，225rpm，1mM IPTG誘導6h表達相應的融合蛋白質。隨即以10000rpm離心收獲細菌，加入1×上樣緩沖液將菌體煮沸裂解，再次以10000rpm離心10min收獲上清液，進行15％SDS-PAGE，結果如圖9所示，表明該工程菌株表達出預期大小的融合蛋白PCMAG1-A-GST(37kDa)和PCMAG1-A-His(16kDa)。圖9中，1為pGEX-6p-1-pcmag1-a未誘導；2為pGEX-6p-1-pcmag1-a誘導；3為pGEX-6p-1未誘導；4為pGEX-6p-1誘導；5為pET-28a(+)-pcmag1-a未誘導；6為pET-28a(+)-pcmag1-a誘導；M為低分子量蛋白質標準，箭頭示目的條帶。
將含pET-28a(+)-pcmag1-a工程菌株誘導后離心收集菌體，超聲破碎后離心取沉淀進行15％SDS-PAGE，用干凈的手術刀片將目的帶切下，用PBS將目的蛋白質溶出，透析濃縮蛋白，作為抗原免疫家兔，按常規(guī)方法得到抗PCMAG1-A多克隆抗體。ELISA方法檢測結果表明，該抗PCMAG1-A多克隆抗體的效價為1∶160000(圖10)。圖10中，1為1∶1000，2為1∶5000，3為1∶10000，4為1∶20000，5為1∶40000，6為1∶80000，7為1∶160000，8為1∶320000，9為1∶640000，10為1∶1280000，11為免疫前血清，12為空白對照。
利用抗His標簽抗體(抗六個連續(xù)組氨酸表位的單克隆抗體，購自Novagen公司)通過免疫印跡方法檢測目的融合蛋白質表達情況。圖11表明在誘導表達和純化后的蛋白中均檢測到PCMAG1-A-His融合蛋白的表達。圖11中，1為未純化蛋白，2為純化后蛋白。
2.pcmag1基因的獲取及其在PLA-801D中表達的確證利用抗PCMAG1-A多克隆抗體，通過免疫印跡方法進行PLA-801D細胞內PCMAG1-A的內源性表達分析時，在分子量約44kDa區(qū)域有明顯的陽性條帶存在，而在預期分子量區(qū)域——9kDa則未能檢測到相應目的蛋白存在。將序列表中SEQ ID №1的DNA序列重新進行同源性檢索后發(fā)現該序列與MGC11324蛋白(GenBank登錄號為NM_032717)基因序列(SEQ ID №4)的3’端具有100％的同源性。MGC11324蛋白是一個日本研究小組在分析肝母細胞瘤的基因表達譜和篩選與正常肝細胞的差異基因中發(fā)現的新蛋白質，并依據其基因序列，推測出其可能編碼434個氨基酸的蛋白質產物。但他們對于MGC11324蛋白并未進行深入研究，亦沒有通過實驗驗證該蛋白質產物的真實存在。
針對MGC11324的基因序列分別設計如下引物，上游引物5-CCGGAATTCGTCATGGAGGGCGCAGAG-3，下游引物5-CCGCTCGAGGCTGAGAGAGCCATTGCCCA-3；內參照G3PDH引物序列上游引物5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，利用PLA-801D的總RNA和OligodT15引物，按常規(guī)方法逆轉錄成cDNA后，進行PCR擴增。擴增參數如下于94℃變性5分鐘之后，再于94℃45秒；54℃45秒；72℃90秒，35個循環(huán)，最后于72℃延伸7分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物。結果如圖12所示，1，2泳道是MGC11324基因的ORF擴增片段長度為1323bp，M為DL2000核酸分子量標準，3為陰性對照。經三博遠志公司測序確認該擴增產物與MGC11324基因的登陸序列完全一致。從而在核酸水平證實MGC11324基因在PLA-801D中的存在。
以抗PCMAG1-A多克隆抗體為第一抗體，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔為二抗(購自中杉公司，系進口分裝)，按常規(guī)方法對PLA-801D和PLA-801C細胞的總蛋白進行western blotting，結果如圖13所示，表明PLA-801D株細胞中44kDa蛋白質的表達顯著高于C株，這與PCMAG1-A基因在兩株細胞中核酸水平上的差異一致。結合PCMAG1-A的功能研究，免疫印跡實驗和同源性比對結果，說明PCMAG1-A與MGC11324是有關聯的，利用抗PCMAG1-A多克隆抗體檢測出約44kDa的蛋白質理論上與MGC11324蛋白的大小一致。通過生物信息學分析，PCMAG1-A是MGC11324蛋白的羧基端。PCMAG1-A本身具有較強的抗原性，由此所制備的抗PCMAG1-A多克隆抗體對于MGC11324產生較強的結合作用而使全長蛋白質得到有效檢出。
3、RNAi方法干涉PCMAG1蛋白表達針對pcmag1-a的基因序列，利用Ambion.Invitrogen.darmacon等網站上的siRNA design tools在線設計，選擇三條在三個網站上預測均相同的序列自序列1的5′端第997-1016位堿基序列，1093-1112位堿基序列，1133-1154位堿基序列，設計如下的siDNA1、siDNA2和siDNA3序列，并且與人類其他基因比對小于或等于三個互補堿基。
siDNA1按自序列1的5′端第997-1016位堿基序列合成兩條DNA鏈正義鏈5’-GATCCATTGGAACCATACATCTTCAAGAGATGTATGGTTCCTCCAATTTTTTTTGGAAA-3’反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAAATTGGAGGAACCATACATCTCTCTTGAAGATGTATGGTTCCTCCAAT-3’siDNA2按自序列1的5′端第1093-1112位堿基序列合成兩條DNA鏈正義鏈5’-GATCCAGCTACCTGCTTCGAATGATTCAAGAGATCATTCGAAGCAGGTAGCTCATTTTTTGGAAA-3’反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAATGAGCTACCTGCGAATGATCTCTTGAATCATTCGAAGCAGGTAGCTG-3’siDNA3按自序列1的5′端第1133-1154位堿基序列合成兩條DNA鏈正義鏈5’-GATCCGGAGAAGATGCAGTCCAGTTTCAAGAGAACTGGACTGCATCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3’反義鏈5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGATGCAGTCCAGTTCTCTTGAAACTGGACTGCATCTTCTCCG-3’兩條DNA鏈分別在退火緩沖液中等摩爾比混合后95℃變性5分鐘，緩慢退火至室溫形成雙鏈DNA。
將質粒U62.1(由陽性對照和陰性對照組成，購自Ambion公司)的陽性對照分別以BamH1以及HindIII限制性內切酶消化后，回收純化，得到線性化載體，分別與退火形成的雙鏈模板DNA連接，轉化感受態(tài)細菌大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板中培養(yǎng)16小時后挑選菌落，測序(上海申能博彩公司)，表明插入序列正確，得到siRNA1、siRNA2和siRNA3表達質粒。采用LIPOFECTAMIN 2000(Invitrogen)轉染試劑，分別將2μg siRNA1、siRNA2和siRNA3表達質粒及質粒U62.1的陰性對照轉染至PLA-801D中。轉染24小時后，傳代并加入G418使終濃度為700μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)15天將絕大部分未轉染的細胞殺死。維持G418濃度為200μg/ml，繼續(xù)進行抗生素壓力篩選直至獲得穩(wěn)定轉染的多克隆細胞簇。分別收集抗性細胞，PBS洗滌，離心棄上清，加入100μl預冷的RIPA細胞裂解液，置冰上40分鐘。4℃，10000g離心15min，收獲上清即為細胞總蛋白。以BCA法進行蛋白質定量，取5μg細胞總蛋白以8％的SDS-PAGE分離，常規(guī)進行免疫印跡檢測。一抗為自制抗PCMAG1-A多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(購自中杉公司，進口分裝)。免疫印跡結果與圖13類似，針對pcmag1-a的基因設計的siRNA序列影響了MGC11324蛋白的表達，如圖14所示，在轉染siRNA1表達質粒的PLA-801D細胞(第一泳道)、siRNA2表達質粒的PLA-801D細胞(第二泳道)和siRNA3表達質粒的PLA-801D細胞(第三泳道)中MGC11324蛋白的表達水平與PLA-801D(第五泳道)相比呈現明顯下降，而陰性對照(轉染質粒U62.1的陰性對照的PLA-801D細胞，第四泳道)則無明顯改變。進一步確證該MGC11324蛋白在PLA-801D細胞中的存在，并且印證了PCMAG1-A與MGC11324蛋白是有關聯的。
上述實驗結果表明PCMAG1-A是MGC11324蛋白的羧基端，針對pcmag1-a設計的siRNA序列影響了MGC11324蛋白的表達，說明MGC11324是腫瘤轉移相關蛋白，PCMAG1-A是其活性片段。將MGC11324蛋白命名為PCMAG1，它具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列，其編碼基因pcmag1具有序列表中序列4的核苷酸序列。
序列表<160>5<210>1<211>1420<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1cttgcaggaa cttgcatcaa caatacttca gtcatgatgt ttaaaaaggg gagctttgaa 60attggaggaa ccatacatcc agttgcaatt aagtataacc ctcagttcgg tgatgcattt 120tggaacagta gtaaatacaa catggtgagc tacctgcttc gaatgatgac cagctgggcc 180atcgtctgtg acgtgtggta catgcccccc atgaccagag aggaaggaga agatgcagtc 240cagtttgcta acagggttaa gtctgctatt gctatacaag gaggcctgac tgaacttccc 300tgggatggag gactaaagag agcaaaggtg aaggacatct ttaaggaaga gcagcagaaa 360aattacagca agatgattgt gggcaatgga tctctcagct aagaggacgg atgacagcct 420ttagatctag aactagccct tagaaatgga atggcttttt ttgttttgtt ttgttttatt 480gttttgtttt tattattgtt aatcttttct acagaatgat tgtctctacc tctttatgcc 540agaggcagaa cctacaggtg ccctttttgg cttttgttgt tgttgtaaca ttagccccat 600ggattgtaag gtggtttact gagttaaaac agattctgct tttgtaaaat gatggcatca 660ctgtggactg aatgaaatat ttgtatagaa aaaagtgctt gaaaagtgtg gtttggaact 720catcgatagg gtaattctcc aaaaatgccc aaactctttt tctgtaatta gccttgccac 780ttccttcagt cacttaaatg gtgagattac acatcagtgc aagatgacca ttatggttat 840ggtctactgc aaggttgaaa gaaaaaatgg aggattgtat ttaggaaaag ggacaacttt 900gtggccacct gctctgaaag tcaaaaggaa atgtaaatta gtgtcattag tgtgttggaa 960gagaaatact attcagtaac ttcgccaaag aaaagtgagt caaagttaat gtgtgtgcgc1020atttatatgt aggcagctcg tagaccacat tttaaccagc aactggtaac aaagagctta1080gttttccttg tttgaatgct gtagatctgt acctagtacc cctcccatct actgatttgt1140ttgtttttgt aaccaaacac attttcagat agaaggagcc taaaaaaaaa aaaatcacat1200tgagtaactt cagtatgaat gaatgagagt gtgtggagct acccctcacc ctccacccct1260ttgtgctttt tattcccgaa ttttcccagt ctcttaaaca gaaaaatgac tgatataatt1320atcttttgga aactgagcct taattttttt tagaggggga aataagtttt ccccaactca1380
cacagcataa gcaatgtttg acagcaatat aatgccgttg 1420<210>2<211>122<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2Met Met Phe Lys Lys Gly Ser Phe Glu Ile Gly Gly Thr Ile His Pro1 5 10 15Val Ala Ile Lys Tyr Asn Pro Gln Phe Gly Asp Ala Phe Trp Asn Ser20 25 30Ser Lys Tyr Asn Met Val Ser Tyr Leu Leu Arg Met Met Thr Ser Trp35 40 45Ala Ile Val Cys Asp Val Trp Tyr Met Pro Pro Met Thr Arg Glu Glu50 55 60Gly Glu Asp Ala Val Gln Phe Ala Asn Arg Val Lys Ser Ala Ile Ala65 70 75 80Ile Gln Gly Gly Leu Thr Glu Leu Pro Trp Asp Gly Gly Leu Lys Arg85 90 95Ala Lys Val Lys Asp Ile Phe Lys Glu Glu Gln Gln Lys Asn Tyr Ser100 105 110Lys Met Ile Val Gly Asn Gly Ser Leu Ser115 120<210>3<211>346<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>3
gtacccctcc catctactga tttgtttgtt tttgtaacca aacacatttt cagatagaag 60gagccttaaa aaaaaaaatc acattgagta acttcagtat gaatgaatga gagtgtgtgg 120agctacccct caccctccac ccctctgtgc tttttattcc cgaattttcc cagtctctta 180aacagaaaaa tgactgatat aattatcttt tggaaactga gccttaattt tttttagagg 240gggaaataag ttttccccaa ctcacacagc ataagcaatg tttgacagca atataatgcc 300gttgtaaact actgagagta ttgtatctgt tctggtaacc atgtac346<210>4<211>2534<212>DNA<213>人屬人(Homo sapiens)<400>4gcagaggtga gtgccgggct cggcgctctg ctcctggagc tcccgcggga ctgcctgggg 60acagggactg ctgtggcgct cggccctcca ctgcggacct ctcctgagtg ggtgcgccga120gtcatggagg gcgcagagct ggccgggaag atcctttcca cctggctgac gctggttctc180ggcttcatcc ttttaccttc ggtcttcgga gtgtctctgg gcatctccga gatctacatg240aagatcctag tgaaaacttt agagtgggcc acaatacgaa ttgaaaaagg aaccccaaag300gagtcgattc ttaaaaactc tgcttctgtt ggtattatcc aaagagatga gtcacccatg360gaaaaagggc tctctggtct acgaggaagg gactttgagc tgtctgacgt gttttatttc420tccaagaagg gattggaagc cattgtagaa gatgaagtga cccagaggtt ttcctcagag480gagctagtgt catggaatct cctcacaaga accaatgtaa atttccagta catcagtctg540cggctcacta tggtgtgggt gctgggcgtc atagtgcgct attgtgtcct actgcctctg600agggttacct tggctttcat tgggatcagt ttgctggtta taggaactac actggttggg660cagctgccag acagcagcct caaaaactgg ctgagtgaac tggtccatct gacttgctgc720cggatctgtg tgcgagccct ctctggtacc attcattatc ataacaagca gtacagaccc780cagaagggag gcatttgtgt tgccaaccat acttccccca ttgatgtttt aatcttgaca840acggatggat gttatgctat ggttggccag gttcatggcg gcttgatggg aattattcag900agagctatgg tcaaggcttg tcctcatgtc tggtttgaac gctcagaaat gaaggatcga960cacctggtta ctaagagact aaaagaacat attgctgata agaagaaact acccatacta 1020atttttcctg aaggaacttg catcaacaat acttcagtca tgatgtttaa aaaggggagc 1080tttgaaattg gaggaaccat acatccagtt gcaattaagt ataaccctca gttcggtgat 1140
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1 5 10 15Leu Val Leu Gly Phe Ile Leu Leu Pro Ser Val Phe Gly Val Ser Leu20 25 30Gly Ile Ser Glu Ile Tyr Met Lys Ile Leu Val Lys Thr Leu Glu Trp35 40 45Ala Thr Ile Arg Ile Glu Lys Gly Thr Pro Lys Glu Ser Ile Leu Lys50 55 60Asn Ser Ala Ser Val Gly Ile Ile Gln Arg Asp Glu Ser Pro Met Glu65 70 75 80Lys Gly Leu Ser Gly Leu Arg Gly Arg Asp Phe Glu Leu Ser Asp Val85 90 95Phe Tyr Phe Ser Lys Lys Gly Leu Glu Ala Ile Val Glu Asp Glu Val100 105 110Thr Gln Arg Phe Ser Ser Glu Glu Leu Val Ser Trp Asn Leu Leu Thr115 120 125Arg Thr Asn Val Asn Phe Gln Tyr Ile Ser Leu Arg Leu Thr Met Val130 135 140Trp Val Leu Gly Val Ile Val Arg Tyr Cys Val Leu Leu Pro Leu Arg145 150 155 160Val Thr Leu Ala Phe Ile Gly Ile Ser Leu Leu Val Ile Gly Thr Thr165 170 175Leu Val Gly Gln Leu Pro Asp Ser Ser Leu Lys Asn Trp Leu Ser Glu180 185 190Leu Val His Leu Thr Cys Cys Arg Ile Cys Val Arg Ala Leu Ser Gly195 200 205Thr Ile His Tyr His Asn Lys Gln Tyr Arg Pro Gln Lys Gly Gly Ile210 215 220Cys Val Ala Asn His Thr Ser Pro Ile Asp Val Leu lle Leu Thr Thr225 230 235 240Asp Gly Cys Tyr Ala Met Val Gly Gln Val His Gly Gly Leu Met Gly245 250 255Ile Ile Gln Arg Ala Met Val Lys Ala Cys Pro His Val Trp Phe Glu
260 265 270Arg Ser Glu Met Lys Asp Arg His Leu Val Thr Lys Arg Leu Lys Glu275 280 285His Ile Ala Asp Lys Lys Lys Leu Pro Ile Leu Ile Phe Pro Glu Gly290 295 300Thr Cys Ile Asn Asn Thr Ser Val Met Met Phe Lys Lys Gly Ser Phe305 310 315 320Glu Ile Gly Gly Thr Ile His Pro Val Ala Ile Lys Tyr Asn Pro Gln325 330 335Phe Gly Asp Ala Phe Trp Asn Ser Ser Lys Tyr Asn Met Val Ser Tyr340 345 350Leu Leu Arg Met Met Thr Ser Trp Ala Ile Val Cys Asp Val Trp Tyr355 360 365Met Pro Pro Met Thr Arg Glu Glu Gly Glu Asp Ala Val Gln Phe Ala370 375 380Asn Arg Val Lys Ser Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Leu Thr Glu Leu385 390 395 400Pro Trp Asp Gly Gly Leu Lys Arg Ala Lys Val Lys Asp Ile Phe Lys405 410 415Glu Glu Gln Gln Lys Asn Tyr Ser Lys Met Ile Val Gly Asn Gly Ser420 425 430Leu Ser
權利要求
1.腫瘤轉移相關蛋白，是具有序列表中SEQ ID №5氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №5的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與腫瘤轉移相關的由SEQ ID №5衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述腫瘤轉移相關蛋白的活性片段，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多肽，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與腫瘤轉移相關的由SEQ ID №2衍生的多肽。
3.權利要求1所述腫瘤轉移相關蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述腫瘤轉移相關蛋白的編碼基因具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №5蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.權利要求2所述腫瘤轉移相關蛋白活性片段的編碼基因。
6.根據權利要求5所述的基因，其特征在于所述腫瘤轉移相關蛋白活性片段的編碼基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
7.含有權利要求3或4所述腫瘤轉移相關蛋白的編碼基因的表達載體、細胞系和宿主菌。
8.含有權利要求5或6所述腫瘤轉移相關蛋白活性片段的編碼基因的表達載體、細胞系和宿主菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腫瘤轉移相關蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的腫瘤轉移相關蛋白，是具有序列表中SEQ ID №5氨基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №5的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與腫瘤轉移相關的由SEQ ID №5衍生的蛋白質。該腫瘤轉移相關蛋白的活性片段，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的多肽，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與腫瘤轉移相關的由SEQ ID №2衍生的多肽。本發(fā)明的腫瘤轉移相關蛋白及其編碼基因為進一步研究腫瘤轉移發(fā)生的分子機制提供了線索，并具有潛在的臨床應用價值。
文檔編號C12N15/63GK1680439SQ200510005260
公開日2005年10月12日 申請日期2005年2月3日 優(yōu)先權日2004年2月11日
發(fā)明者陸應麟, 張金強, 藺合云, 王妍, 譚曉剛, 陳惠華, 徐元基, 杜芝燕 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所