專利名稱：防止抗體變性的精制方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使用蛋白A親和層析色譜法進行精制抗體的方法，具體涉及一種洗脫緩沖液。
背景技術：
抗體作為治療藥品、臨床檢查用試劑、研究用試劑應用極為廣泛，對它的需求也日益增高。來源于微生物的Fc受體的Staphyrococcal Protein A(以下稱為蛋白A)因對多種抗體的Fc區(qū)域具有極高的親和性，因此使用將該蛋白A作為配體固定化的載體的親和層析色譜法(稱為蛋白A親和層析色譜)已成為工業(yè)規(guī)模的抗體制造工藝的核心技術(例如，參照非專利文獻1、非專利文獻2)。蛋白A具有的高親和性可提高單位時間的生產(chǎn)效率，并有助于對來源于原料的雜質進行高度的淘汰去除。但是，使用此蛋白A的親和層析色譜仍殘留有來源于抗體特性的問題，并對抗體制造產(chǎn)生了制約。本發(fā)明解決了有關該抗體特性的問題，并改善了抗體的制造使其更為穩(wěn)定。
因蛋白A在中性pH下表現(xiàn)出對Fc區(qū)域的極高的親和性，將含有抗體的精制原料在中性pH下裝載于裝填有蛋白A固定化載體的柱等等中，使用中性pH的緩沖液進行充分的洗滌將來源于原料的雜質除去后，再使用酸性pH的、具體為不到pH2.5～4的洗脫緩沖液將抗體從柱上洗脫。在酸性pH條件下洗脫的抗體中殘留的來源于原料的雜質僅為數(shù)百ppm的水平，商業(yè)生產(chǎn)上可利用的各種蛋白A固定化載體基本上沒有性能的差別(例如參照非專利文獻3、4)。目前，適用于抗體的商業(yè)生產(chǎn)的蛋白A固定化載體可由AmershamBiosciences公司、Millipore公司、PE Biosystems公司等處購得。但是，使用這些載體進行抗體精制時都存在一個不可避免問題，那就是從載體上洗脫回收的抗體將與高度酸性的緩沖液接觸，該接觸將改變抗體的高級結構，進一步導致頻繁地發(fā)生結合·凝集的情況。對于酸性pH引起的抗體結構的變化進行了很多研究，但仍未提出與構造變化或結合·凝集反應相關的諸多問題的解決方法。與酸性pH接觸后抗體如何產(chǎn)生問題，主要作為實用上的問題有J.M.Sarciax等(參照非專利文獻5)和M.Paborji等(參照非專利文獻6)的報告。酸性pH引起抗體高級結構的改變，已被以Buchner等人進行的幾個研究為代表進行了證明(參照非專利文獻7、8、9)。另外，也有Vlasov等的研究(參照非專利文獻10、11、12)表明，即使抗體與酸性pH環(huán)境接觸一次后不發(fā)生結合·凝集而回到中性pH后，其本來的抗體結構仍不能恢復。因此，從保證抗體的品質進行精制的目的出發(fā)，與酸性pH接觸決不是優(yōu)選的方法，必須有一種不必與酸性pH接觸的新型精制技術。
為解決上述問題，迄今為止進行了很多研究，以下對幾個研究的例子進行概括，同時記載目前技術中的問題。
(1)以中性緩沖液從蛋白A上洗脫抗體的方法R.Bywater等，根據(jù)蛋白A與抗體Fc區(qū)域的結合中有酪氨酸殘基的參與的發(fā)現(xiàn)，使用含有酪氨酸的二肽(0.1M甘氨酰酪氨酸，pH7.0)代替酸性洗脫緩沖液可將抗體從蛋白A結合載體上洗脫回收(參照非專利文獻13、14)。但是，此條件下有只能回收20～35％的抗體的限制，并不被認為是實用的方法。
B.Seed等，根據(jù)蛋白A與抗體Fc區(qū)域的結合中有組氨酸殘基的參與的發(fā)現(xiàn)，使用不是組氨酸本身，但相當于該殘基的咪唑溶液(1～5M、pH 6～9)代替酸性洗脫緩沖液將抗體從蛋白A結合載體上洗脫回收(參照專利文獻1)。但是，此技術需要1～5M(充分的回收需要3M或3M以上)的高濃度的咪唑進行洗脫。咪唑在其他的精制方法中，例如為精制結合有組氨酸標記的融合蛋白的金屬螯合親和層析色譜法中，也作為洗脫緩沖液使用，但咪唑本身對蛋白質具有變性作用是該領域的研究者共知的常識，并不適用于作為精制抗體的洗脫緩沖液。從此方面考慮，并不能認為是實用的方法。
(2)以改變了蛋白A的氨基酸序列的人工配體進行代替使用的方法S.Hober等在蛋白A與抗體Fc結合區(qū)域中，著眼于區(qū)域B，設計制造出改變了此B區(qū)域的一部分氨基酸序列的人工Z區(qū)域。將此Z區(qū)域作為配體固定化的載體可在中性pH條件下與抗體良好的結合，可使用pH4.5的溫和的微酸性緩沖液代替酸性洗脫緩沖液，可有效的回收結合的抗體(參照非專利文獻15)，但是，該Z區(qū)域在中性pH下對于抗體的親和性比蛋白A具有的親和性大幅降低，伴隨抗體結合量的降低將產(chǎn)生生產(chǎn)效率降低的大問題。另外，親和性的降低與原料中的雜質的淘汰去除能力的降低也有關，也留下了產(chǎn)品品質保持方面的問題。從此方面考慮，并不能認為是實用的方法。
M.G.Gore等，根據(jù)蛋白A與抗體Fc區(qū)域的結晶結構解析的結果，設計制造出多種將參加兩分子結合的蛋白A側的疏水性殘基分別置換為組氨酸的變異蛋白A。其中，將蛋白A的21、79位殘基的亮氨酸置換為組氨酸的變異體蛋白A，僅使緩沖液的pH從8降至5，便使其對抗體Fc區(qū)域的親和性降低至原來的1/50。實際上使用pH5的溫和的微酸性緩沖液代替酸性洗脫緩沖液時，可以有效地回收結合在該變異體蛋白A上的抗體(參照非專利文獻16)。但是，此變異體蛋白A在pH8的條件下對抗體Fc區(qū)域的親和性，降低至蛋白A具有的親和性的1/5，與上述Z區(qū)域同樣有生產(chǎn)效率和雜質淘汰率低下的大問題。從此方面考慮，并不能認為是實用的方法。
(3)使用有機化學制造的配體代替蛋白A的方法E.Boschettir等，設計了一種與蛋白A無關、伴隨pH的變化改變疏水性的化合物，該化合物對于Fc區(qū)域表現(xiàn)出pH依存性的變化的親和性，并開發(fā)出將該化合物作為配體進行結合的精制抗體用載體(參照非專利文獻17)。此載體可作為MEP HYPERCEL從BIOSEPRA公司購得。該載體中，可使用更溫和的微酸性緩沖液(pH4～5)代替酸性洗脫緩沖液回收結合在其上的抗體，但是其pH依存性的親和性變化沒有蛋白A那么激烈，不能以濃縮的形式對抗體進行洗脫和回收。另外，結合的選擇性比蛋白A大大降低，不能對來源于原料的雜質進行高度的去除。雖然設定適合精制原料的特別洗滌條件(使用有機酸等)可以改善精制效果，但即便如此，與蛋白A的精制效果相比還是相去甚遠，因此并沒有在工業(yè)生產(chǎn)上使用其來代替蛋白A。
L.R.Dowd等設計了一種模仿蛋白A對抗體Fc區(qū)域的結合部分的肽，并發(fā)展此結構，制造了一種可完全以有機化學方法合成的蛋白A模仿配體(Mabsorbent；參照非專利文獻18)。結合與此合成配體的抗體，通常在10mM檸檬酸鈉、pH 3.0的條件下進行洗脫和回收，但在聚乙二醇的共存下也可以使用中性緩沖液。但是，由于它的結合選擇性比蛋白A大大降低，對來源于原料的雜質的淘汰能力完全比不上蛋白A。與上述MEP Hypercel同樣，由于這些配體的首要目的是以不使用蛋白性質配體的蛋白A進行開發(fā)的，因此不可避免其精制效率、雜質淘汰能力的低下。這些合成的配體在工業(yè)生產(chǎn)上仍未代替蛋白A進行使用，也不是作為解決酸性洗脫緩沖液帶來的問題的合適的手段。
(4)使用蛋白A和酸性緩沖液，并穩(wěn)定抗體的方法如上所述，提出有效替代蛋白A和酸性洗脫緩沖液的精制抗體的方法并不容易，因此，提出了防止與酸性洗脫溶液接觸后產(chǎn)生的抗體變性(結構變化或結合·凝集反應)的方法。
Higuchi等提出了在使用酸性洗脫緩沖液回收結合在蛋白A上的抗體后，直接在其中加入聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、或乙二醇等多元醇化合物作為穩(wěn)定劑，可抑制結合·凝集反應的發(fā)生(參照專利文獻2)的方法。通過此方法，雖可在與酸性緩沖液接觸后在盡量短的時間內加入穩(wěn)定劑以抑制結合·凝集的發(fā)生，但并不能抑制在上述酸性pH下產(chǎn)生的結構本身的變化。另外，對于pH的變化引起的蛋白質的變性的對策，通常認為比起通過由Higuchi等提出的一類以多元醇等穩(wěn)定劑進行防止的策略，更應該防止pH的變化本身(參照非專利文獻19)。因此，此技術并不能成為解決酸性洗脫緩沖液帶來的問題的根本方法。
R.W.Rosenstein等提出了一種在充填了結合了蛋白A的載體的柱的后端直線連接緩沖液置換用柱，使從蛋白A上洗脫的抗體的緩沖液在極短的待機時間中被中性pH緩沖液置換的方法(參照專利文獻3)。此方法雖然使接觸時間變得極短，但并不能抑制抗體結構本身的變化，與上述Higuchi等的方法相同，并不能成為解決酸性洗脫緩沖液帶來的問題的根本方法。
[專利文獻1]WO 94/07912[專利文獻2]特開平2-273194[專利文獻3]特開平1-135798[非專利文獻1]The Production of Monoclonal Antibodies.In Birch，J.R.and Lennox，E.S.(ed.)[非專利文獻2]Monoclonal Antibodies，Principles andApplications.，p.231-265，Londoniley Liss，Inc.，1995[非專利文獻3]R.L.Fahrmer，D.H.Whitney，M.Vandertaan，G.Blank，Biotech.Appl.Biochem(1999)30，121-128[非專利文獻4]R.Hahn，R.Schlegel，A.Jungbauer，J.Chromatogr.B.，(2003)790，35-51[非專利文獻5]Journal of Pharmaceutical Sciences，88(1999)，1354-1361[非專利文獻6]Pharmaceutical Research，11(1994)，764-771[非專利文獻7]Biochemistry，30(1991)，6922-6929[非專利文獻8]Biophysical Journal 78(2000)，394-404[非專利文獻9]Biochimica et Biophysica Acta，1431(1999)，120-131[非專利文獻10]Biochemistry(Moscow)，61(1996)，155-171[非專利文獻11]Immunology Letters，43(1994)，149-152[非專利文獻12]FEBS Letters，361(1995)，173-175[非專利文獻13]Chromatogr.Synth.Biol.Polym.，[Lect.Chem.Soc.Int.Symp.]1978，[非專利文獻14]1976 Meeting Proceedings，Volume 2，337-340[非專利文獻15]J.Chromatogr.76(2000)233-244[非專利文獻16]Molecular Biotechnology 10(1998)，9-16[非專利文獻17]Trends Biotechnol.20(2002)，333-337[非專利文獻18]Mabsorbentnature biotechnology16(1998)，190-195[非專利文獻19]John Carpenter et al.PharmaceuticalResearch 14(1997)，969-975發(fā)明內容基于以上現(xiàn)有技術，為解決酸性洗脫緩沖液所帶來的問題的方法概括如下。
為活用蛋白A與抗體Fc區(qū)域的高親和性，使用蛋白A本身作為與抗體結合的配體。結合抗體后，在不會使抗體發(fā)生變性、結合·凝集反應的溫和的微酸性、或中性pH緩沖液中，添加用于使蛋白A和抗體Fc之間的親和性充分降低的抗體脫離促進劑。
即，本發(fā)明提供了一種抗體的精制方法，其中，在使用蛋白A親和層析色譜精制抗體時，使用pH調整至4.0～5.0的含有精氨酸或/及精氨酸衍生物的微酸性緩沖液，洗脫抗體并防止回收的抗體變性。
本發(fā)明還提供了一種精制抗體的制造方法，其包含以下工序將抗體裝載于蛋白A親和層析色譜柱的工序；使裝載于該柱上的抗體，與pH調整至4.0～5.0的含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的緩沖液接觸，使該抗體從柱上洗脫的工序；以及回收精制抗體的工序。
本發(fā)明使抗體從蛋白A固定化載體上的洗脫·回收可以在pH4.0～5.0的微酸性精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液中進行，此采用精氨酸和/或精氨酸衍生物作為洗脫促進劑的技術，完全不會影響對于中性條件下的蛋白A的抗體的親和性，因此完全保留了蛋白A具有的高精制效率和對雜質的淘汰能力。
在洗脫中使用的精氨酸和/或精氨酸衍生物不會引起抗體高級結構的不穩(wěn)定，因此，可以防止抗體變性的發(fā)生。另外，精氨酸和/或精氨酸衍生物可通過脫鹽等操作容易的與抗體分離。


表1(實驗條件1～4)的回收抗體的凝膠過濾HPLC以表1的實驗條件1～4回收的抗體(18μg)以文中的條件進行凝膠過濾HPLC分析。橫軸表示保留時間(分)。實驗條件2的下方表示僅分析洗脫緩沖液的分析結果(空白對照)。在保留時間24分鐘附近的峰是因洗脫緩沖液引起的。
精制抗體標準品色譜圖上粗箭頭所示的峰為抗體。而細箭頭所示位置為抗體的結合·凝集體洗脫的位置。
表2的精氨酸洗脫緩沖液中使用的抗體的蛋白A親和層析色譜以表2的實驗編號1、2的條件在箭頭所示的位置洗脫抗體。峰下方的橫線部分作為抗體組份回收，并供分析用。
表2(實驗編號1、2)的回收抗體的凝膠過濾HPLC以表2的實驗編號1、2回收的抗體(18μg)以文中的條件進行凝膠過濾HPLC分析。橫軸表示保留時間(分)。空白對照的結果如上所知，在保留時間24分鐘附近的峰是因洗脫緩沖液引起的。
實驗編號1的色譜圖上粗箭頭所示的峰為抗體。而細箭頭所示位置為抗體的結合·凝集體洗脫的位置。
表3(實驗編號1、2)的回收抗體的凝膠過濾HPLC以表3的實驗編號1、2回收的抗體(約2.5μg)以文中的條件進行凝膠過濾HPLC分析。橫軸表示保留時間(分)。實線的箭頭表示的峰為抗體。虛線的箭頭所示的位置為抗體結合物洗脫的位置。
表4(實驗編號1、2)的回收抗體的凝膠過濾HPLC以表4的實驗編號1、2、3回收的抗體(約2.5μg)以文中的條件進行凝膠過濾HPLC分析。橫軸表示保留時間(分)。箭頭表示的峰為抗體。實線的箭頭表示的峰為抗體。虛線的箭頭所示的位置為抗體結合物洗脫的位置。
參考例將1000ml與實施例3和4同樣的培養(yǎng)上清液裝載于蛋白A層析柱上，使用與實施例3和4同樣的方法對以表3(實驗編號1)的洗脫條件(0.1M檸檬酸鈉，pH2.9)回收的抗體進行凝膠過濾HPLC分析。實線的箭頭所示的峰為抗體，虛線的箭頭所示的峰為抗體結合物。
具體實施例方式
本發(fā)明中使用的抗體脫離促進劑為作為天然氨基酸中的1種的精氨酸和/或對精氨酸進行化學修飾的精氨酸衍生物。精氨酸衍生物為除了精氨酸以外，乙酰精氨酸、N-丁酰精氨酸、N-新戊酰精氨酸等?；彼幔ヴ然碾一“?，導入羥基代替α-氨基的精氨酸等。它們可以與酸成鹽的形態(tài)進行使用。作為可與它們成鹽的酸有鹽酸、硫酸等。作為抗體脫離促進劑，優(yōu)選精氨酸衍生物，更優(yōu)選酰化精氨酸，尤其優(yōu)選N-丁酰精氨酸、N-新戊酰精氨酸。使用這樣的抗體脫離促進劑，可以極度降低抗體發(fā)生變性、結合·凝集的危險性，因此尤其優(yōu)選。
另外，含有本發(fā)明使用的精氨酸和/或精氨酸衍生物的溶液為pH4.0～5.0，優(yōu)選為pH4.3～4.7的微酸性緩沖液，并可添加磷酸緩沖液等。通過使用此pH范圍內的緩沖液，可以極度降低抗體發(fā)生變性、結合·凝集的危險性，因此優(yōu)選。另外，pH的調節(jié)可使用鹽酸或硫酸等無機酸、醋酸等有機酸等進行。
并且，精氨酸或/及精氨酸衍生物的濃度為，表現(xiàn)出與作為抗體的酸性洗脫緩沖液被廣泛使用的pH3.5的檸檬酸鈉緩沖液同樣的抗體回收率、并且不會引起抗體發(fā)生結合·凝集的濃度即可，例如0.1～4.0M，優(yōu)選為0.3～3.0M，更優(yōu)選為1～2M精氨酸或/及精氨酸衍生物的濃度。
當然，該緩沖液中也可含有精氨酸或/及精氨酸衍生物以外的物質，只要不會阻害使用蛋白A親和層析色譜的抗體精制即可。此類物質可舉出例如氯化鈉等。
另外，蛋白A層析柱可使用市售的產(chǎn)品，例如HiTrapr-ProteinAFF(Amersham Biosciences制)等。
另外，作為本發(fā)明使用的抗體，只要是已知可適用于蛋白A的抗體，不管其型(class)/亞型(sub class)皆可適用，結合有這些Fc區(qū)域的抗體關聯(lián)蛋白質也同樣可以適用。另外，無論精制原料的純度怎樣，都可以適用。例如，天然的人抗體或以基因重組法制備的人源化抗體或人類型抗體，鼠的單克隆抗體等，更具體可舉出Muramomab(商品名Orthclone OKT3)、Rituximab(商品名Ritaxan)、Basiliximab(商品名Simulect)、Daclizumab(商品名Zenapax)、Palivizumab(商品名Synagis)、Infliximab(商品名Remicade)、Gemtuzumab zogamion(商品名Mylotarg)、Alemtuzumab(商品名Mabcampath)、Adalimumab(商品名Humira)、Omalizumab(商品名Xolair)、Vevacizumab(商品名Avastin)、Cetuximab(商品名Erbitux)等。產(chǎn)業(yè)上最為有用的人源化或人類型抗體，已知它們對蛋白A的親和性更高，從蛋白A柱上進行洗脫需要比小鼠單克隆抗體時所要求的酸性更強的緩沖液。因此，本發(fā)明對人源化或人類型抗體可以發(fā)揮其最大的價值。
另外，目前采用的使用蛋白A精制抗體的操作條件，除上述以外，也可直接使用采用本發(fā)明的精氨酸和/或精氨酸衍生物的抗體洗脫法。
例如，將小鼠單克隆抗體溶解于含有3M NaCl的20mM甘氨酸/NaOH緩沖溶液中，或以此溶液稀釋至10倍。將其裝載于以相同緩沖液平衡的蛋白A層析柱中(例如HiTrap r-Protein AFF；AmershamBiosciences制)。裝載可以通過使該緩沖液流過蛋白A層析柱來進行，也可使流過層析柱的該緩沖液再度流過層析柱，使層析柱上該抗體的負載量增多。使用相同緩沖液充分過柱清洗，將來源于原料的抗體以外的雜質洗掉后，以調整至pH4.0～5.0(優(yōu)選為pH4.3～4.7)的0.1～3M(優(yōu)選為0.3～3M，更優(yōu)選為1～2M)的精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液進行過柱，回收洗脫的抗體。另外，通過本發(fā)明的方法，將回收的抗體以凝膠過濾層析色譜進行分析，得到了與天然狀態(tài)的抗體相同的保留時間和相同的峰的形狀的洗脫結果，并未發(fā)生抗體的高級結構變化或結合·凝集的情況。
另外，如上所述，對于本發(fā)明使用的抗體，除上述的單克隆抗體以外，天然人類抗體，或以基因重組法制備的人源化、或人類型抗體(以上總稱為人抗體)的精制同樣可以使用精氨酸和/或精氨酸衍生物進行實施。將溶解于磷酸緩沖液等中性pH緩沖液的，或以該溶液稀釋至10倍的人抗體的溶液裝載于以相同緩沖液平衡的蛋白A層析柱中(例如HiTrap r-Prote in AFF；Amersham Biosciences制)。使用相同緩沖液充分過柱清洗，將來源于原料的抗體以外的雜質洗掉后，和上述小鼠單克隆抗體的精制方法同樣，以調整至pH4.0～5.0(優(yōu)選為pH4.3～4.7)的0.1～3M(優(yōu)選為0.3～3M，更優(yōu)選為1～2M)的精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液進行過柱，回收洗脫的抗體。將回收的抗體以凝膠過濾層析色譜進行分析，得到了與天然狀態(tài)的抗體相同的保留時間和相同的峰的形狀的洗脫結果，并未發(fā)生抗體的高級結構變化或結合·凝集的情況。另外，有報道說可保持抗體的高級結構的pH下限為4左右。
另外，普遍知道使用酸性pH的檸檬酸緩沖液等進行洗脫·回收的抗體溶液在短時間內很容易發(fā)生結合·凝集，因此建議在洗脫后立即將溶液的pH調整至中性。但是，在大規(guī)模的抗體制造中調整pH是困難的，而且也應充分預料pH調整引起的pH的急劇變化反而導致的抗體變性的危險。本發(fā)明的使用pH4.0～5.0的精氨酸和/或精氨酸衍生物溶液進行抗體洗脫·回收，可解決以上酸性緩沖液具有的問題。
使用本發(fā)明的方法得到的精制抗體，可以得到癌、免疫疾病、生活習慣病等各種疾患的治療藥物、臨床檢查用試劑、研究用試劑。這些醫(yī)藥組合物可以加入至以本發(fā)明的方法得到的精制抗體中，也可含有賦形劑或載體等。
以下以實施例對本發(fā)明進行具體的說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
在溶解于等滲磷酸鈉緩沖液中的精制后的抗血管性假血友病因子單克隆抗體(小鼠抗體，亞型IgG1WO96/17078)5.28mg/ml的0.57ml(抗體3mg)中，添加6.43ml含有3M NaCl的20mM甘氨酸/NaOH緩沖液，將pH調整至8.9，合計添加7ml。將此溶液以0.5ml/min的流速裝載于以相同緩沖液平衡的HiTrap r-Protein AFF、1ml大小(Amersham Biosciences制)柱上，以相同緩沖液5ml過柱洗凈，進行再平衡。以表1所示的洗脫緩沖液以0.5ml/min裝載于此柱，脫離·洗脫的抗體以波長280nm的紫外吸收為指標進行回收。測定得到的抗體溶液的紫外吸收，1mg/ml的抗體溶液所示的吸光度為1.4，計算出蛋白質的濃度，求得本層析色譜中回收的抗體量。所有操作均在5℃下進行。
采用精氨酸或精氨酸衍生物的小鼠單克隆抗體的洗脫·回收結果，以作為抗體的酸性洗脫緩沖液常用的0.1M檸檬酸鈉、pH 3.5下的洗脫·回收作為比較對照，在表1中總結表示。各實驗的回收率以相對于作為原料負載3mg抗體的回收組份中的抗體量的比率來表示。
如使用0.36M以上的精氨酸(L-Arginine，味之素制)，在pH4.30或pH4.30以上的微酸性pH條件下，其對小鼠單克隆抗體的回收效率完全不遜色于使用目前的酸性洗脫緩沖液。
以精氨酸洗脫·回收的單克隆抗體以凝膠過濾層析色譜(柱，Superdex 75HR 10/30，Amersham Biosciences制；洗脫液，0.2M磷酸鈉緩沖液，pH4.0)分析的結果在圖1中表示。僅確認精制抗體標準品的色譜圖上粗箭頭所示的與天然狀態(tài)的抗體完全一致的峰，未發(fā)現(xiàn)超出分析法的檢測下限(1％)的結合·凝集體(在精制抗體標準品的色譜圖上細箭頭所示的位置洗脫)，因此可以確認沒有結構變化或結合·凝集的發(fā)生。尤其是以2M的精氨酸、pH4.7的條件下可回收小鼠單克隆抗體，意味著可以完全解決因接觸酸性緩沖液伴隨的結構變化的問題，并可得出這是一種極為有效的精制手段這一結論。在冷藏保存使用0.1M檸檬酸鈉、pH3.5進行洗脫·回收的抗體(表1，實驗編號11)，結果溶液漸漸白濁，殘留于上清液的抗體量降為剛洗脫后的1/5。而另一方面，使用1M精氨酸pH4.30(表1，實驗編號1)，及2M精氨酸pH4.67(表1，實驗編號2)洗脫·回收的抗體即使同樣的冷藏保存也不會發(fā)生白濁的現(xiàn)象，抗體量也無變化。這表明使用精氨酸進行抗體的洗脫·回收，其洗脫·回收后的抗體比使用檸檬酸等現(xiàn)有的緩沖液得到的抗體的保存性高。
與上述精氨酸的洗脫相同，使用0.36M的乙酰精氨酸(Nα-Acetyl-L-Arginine，Sigma-Aldrich制)即使在pH4.35下也可以有效地回收小鼠單克隆抗體。而使用1M缺少羧基的精氨酸的胍基丁胺(Agmatine，味之素制)在pH4.32下也可以有效地回收小鼠單克隆抗體。以乙酰精氨酸、或胍基丁胺回收的單克隆抗體使用上述凝膠過濾層析色譜分析時，僅確認了與天然狀態(tài)的抗體完全一致的峰，并未發(fā)現(xiàn)超出分析法的檢測下限(1％)的結合·凝集體。綜上所述，可以確認與精氨酸一樣，使用精氨酸的衍生物進行抗體的洗脫·回收時，也沒有發(fā)現(xiàn)抗體的結構變化或結合·凝集的發(fā)生。
表1.采用精氨酸、及精氨酸衍生物進行的小鼠單克隆抗體的洗脫
將來源于小鼠骨髓瘤的細胞于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周，得到含雜質的培養(yǎng)上清液60ml。將其以0.5ml/min的流速裝載于使用等滲磷酸鈉緩沖液平衡的HiTrap r-Protein AFF、1ml大小(AmershamBiosciences制)柱上，得到60ml連續(xù)組份?？蓪⒋诉B續(xù)組份作為完全不含有細胞產(chǎn)生的抗體的模型培養(yǎng)上清液進行操作。在60ml此模型培養(yǎng)上清液中添加10.5g NaCl，在5℃下靜置攪拌·溶解。接著在5℃下放置30分鐘，確認氣泡消失后，添加3mg與實施例1中使用的同樣的精制小鼠單克隆抗體(5.28mg/ml，0.57ml)，再加入1.2ml pH8.7的1M Tris HCl，靜靜攪拌后使用0.5M NaOH調整至pH8.9。將其以0.5ml/min的流速裝載于使用10ml緩沖液(20mMGly/NaOH，3MNaCl，pH8.9)平衡的HiTrap r-Protein AFF、1ml大小(Amersham Biosciences制)柱上，使用相同緩沖液洗柱直至基線恢復。然后使用表2所示的洗脫緩沖液進行洗脫，確認以實施例1同樣的方法進行的單克隆抗體的回收率。從回收組分的吸光度計算出AJvW-2濃度、回收率。全部操作均在5℃下進行。
表2示出回收的結果，圖2示出實際的色譜圖，圖3示出回收的單克隆抗體的凝膠過濾層析色譜的分析結果。各實驗中的回收率以相對于作為原料負載的3mg抗體的回收組分中的抗體量的比率表示。蛋白A層析柱上裝載含雜質的的抗體溶液時，也可與實施例1同樣的使用含精氨酸的微酸性緩沖液進行有效的回收。如圖3所示，實驗編號1及2的兩者中，回收的抗體組分中僅確認了實驗編號1的色譜圖上粗箭頭所示的與天然狀態(tài)的抗體完全一致的峰(參照圖1、精制抗體標準品的色譜圖)，沒有檢測出超過分析法敏感度的結合·凝集體(在實驗編號1的色譜圖上細箭頭所示的位置洗脫)，完全避免了與酸性緩沖洗脫液接觸時引起的結構變化的危險性，是極為有效的抗體精制手段。
表2.使用精氨酸從含有雜質的原料中洗脫小鼠單克隆抗體
將產(chǎn)生人CD18(integrin β2subunit)對應的人源化抗體6E6的基因重組CHO細胞(US 5854070；ATCC Number CRL-11398)，在添加了10％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的培養(yǎng)基(αMEM)中，使用培養(yǎng)轉瓶在37℃下培養(yǎng)4天，得到足夠高的細胞密度。然后交換至添加了2％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的新鮮培養(yǎng)基(味之素，ASF104)中，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)3天，得到含抗體的培養(yǎng)上清液。在32ml此培養(yǎng)上清液中添加1M pH8.5 TrisHCl將pH調整至7.5后，以0.4ml/min的流速裝載于使用等滲磷酸緩沖液平衡的r-Protein AFF柱上(0.5cm直徑×1cm長，0.2ml大小Amersham Biosciences公司)。使用相同緩沖液洗柱直至UV吸收的基線恢復后，使用表3所示的洗脫緩沖液進行洗脫。全部操作均在5℃下進行。分別在80μl回收的組份中添加20μl pH8.5的1M TrisHCl進行中和，將其中的80μl注入凝膠過濾層析色譜柱中(柱，TSK G3000SWXLTOSOH制洗脫液，0.1M磷酸鈉，pH6.8)。得到的結果在表3和圖4中表示。如表3所示，使用檸檬酸鈉緩沖液和精氨酸鹽酸鹽緩沖液回收的人源化抗體的量大致相同。因為不清楚原料的培養(yǎng)上清液中含有的人源化抗體6E6的量，因此本實驗不能計算出正確的回收率，但已知兩種洗脫條件具有大致相同的能力。如圖4所示，以兩種洗脫條件得到的組份中的抗體純度(實線箭頭所示部分為抗體)大致相等，兩個峰的柱保留時間完全一致。另外，虛線箭頭所示的位置為抗體結合物的洗脫位置。以蛋白A層析柱的抗體負載量少的此次為例，檸檬酸鈉和精氨酸鹽酸鹽的雙方都未產(chǎn)生相對于抗體的量的5％或5％以上的抗體結合物，僅在檸檬酸鈉(實驗編號1)中發(fā)現(xiàn)極少的抗體結合物峰(虛線的箭頭)。以上的結果表明，使用微酸性精氨酸緩沖液可從蛋白A上有效的洗脫回收人源化抗體。
表3.通過檸檬酸鈉和精氨酸的緩沖液洗脫人源化抗體
三種精氨酸衍生物通過以下方法制備。
N-丁酰精氨酸(Nα-Butyroyl-L-Arginine)將精氨酸溶解于水/2-丙醇后，將反應系統(tǒng)調整至pH11、10～15℃。在氫氧化鈉水溶液中保持pH和溫度，滴加丁酰氯進行反應。反應結束后，使用陽離子交換樹脂進行精制，得到白色固體。使用反相HPLC、1H-NMR確認結構和純度。
N-新戊酰精氨酸(Nα-Pivaloyl-Arginine)將精氨酸溶解于水/2-丙醇后，將反應系統(tǒng)調整至pH 11，10～15℃。在氫氧化鈉水溶液中保持pH和溫度，滴加新戊酰氯進行反應。反應結束后，使用陽離子交換樹脂進行精制，得到白色固體。使用反相HPLC、1H-NMR確認結構和純度。
精氨酸(L-Arginic acid)將L-精氨酸鹽酸鹽溶解于濃硝酸/濃鹽酸(1∶2)后，60℃下加熱30分鐘后放冷。濾取析出的固體，溶解于水后，加熱回流至原料完全消失。濃縮反應體系，對析出的固體以水進行反復的重結晶得到白色固體。使用反相HPLC、1H-NMR確認結構和純度。
將產(chǎn)生人CD18(integrin β2subunit)對應的人源化抗體6E6的基因重組CHO細胞(US 5854070；ATCC Number CRL-11398)，在添加了10％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的培養(yǎng)基(αMEM)中，使用培養(yǎng)轉瓶在37℃下培養(yǎng)4天，得到足夠高的細胞密度。然后交換至添加了2％胎牛血清(Invitrogen FBS，Ultra-Low IgG型)的新鮮培養(yǎng)基(味之素，ASF104)中，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)3天，得到含抗體的培養(yǎng)上清液。在48ml此培養(yǎng)上清液中添加1M pH8.5 TrisHCl將pH調整至7.5后，以0.4ml/min的流速裝載于使用等滲磷酸緩沖液平衡的r-Protein AFF柱上(0.5cm直徑×1cm長，0.2ml大小Amersham Biosciences公司)。使用相同緩沖液洗柱直至UV吸收的基線恢復后，將流速變更為0.2ml/min，使用表4所示的洗脫緩沖液進行洗脫。全部操作均在5℃下進行。分別在80μl回收的組份中添加20μl pH8.5的1M TrisHCl進行中和，將其中的80μl注入凝膠過濾層析色譜柱中(柱，TSK G3000SWXLTOSOH制洗脫液，0.1M磷酸鈉，pH6.8)。得到的結果在表4和圖5中表示。
表4.采用精氨酸衍生物的人源化抗體的洗脫

如表4所示，使用3種精氨酸衍生物回收的人源化抗體的量大致相同，因此證明這些精氨酸衍生物具有大致相同的洗脫能力。如圖5所示，3種精氨酸衍生物得到的組份中的抗體純度(實線箭頭所示部分為抗體)大致相等，每個峰的抗體峰保留時間與實施例3的檸檬酸鈉洗脫峰完全一致。另外，虛線箭頭所示的位置為抗體結合物的洗脫位置，但此次3種條件中的任意一種，都未產(chǎn)生相對于抗體的量的5％或5％以上的抗體結合物。以上的結果表明，使用微酸性精氨酸衍生物可從蛋白A上有效的洗脫回收人源化抗體。
另外，作為參考例，使用1000ml實施例3及4中使用的相同的培養(yǎng)上清液裝載于HiTrap r-Protein AFF、1ml大小(AmershamBiosciences公司)，以等滲磷酸緩沖液充分洗凈后，以表3實驗編號1同樣的方法以pH2.9的0.1M檸檬酸鈉進行洗脫。柱上負載的抗體量達到了實施例3、4的各條件的20倍以上。將得到的抗體組分以實施例3相同的方法進行滴定中和后，注入凝膠過濾HPLC，其結果在圖6中表示。實線箭頭所示為抗體，虛線箭頭所示為抗體的結合物，表明因酸性緩沖液(檸檬酸鈉)的影響產(chǎn)生了抗體結合物。
權利要求
1.一種抗體的精制方法，其中，在使用蛋白A親和層析色譜精制抗體的時候，使用pH調整至4.0～5.0的含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的微酸性緩沖液，洗脫抗體并進行回收。
2.如權利要求1所述的抗體的精制方法，其中，精氨酸和/或精氨酸衍生物的濃度為，可表現(xiàn)出與pH3.5的檸檬酸鈉緩沖液同樣的抗體回收率，并且不會引起抗體的結合·凝集的濃度。
3.一種精制抗體的制造方法，其包含以下工序將抗體裝載于蛋白A親和層析色譜柱的工序；使裝載于該柱上的抗體，與pH調整至4.0～5.0的含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的緩沖液接觸，使該抗體從柱上洗脫的工序；以及回收精制抗體的工序。
4.如權利要求3所述的精制抗體的制造方法，其中，緩沖液的pH為4.3～4.7。
5.如權利要求3或4所述的精制抗體的制造方法，其中，精氨酸衍生物為?；木彼?。
6.如權利要求5所述的精制抗體的制造方法，其中，?；木彼釣镹-丁酰精氨酸或N-新戊酰精氨酸。
7.如權利要求3～6中任意一項所述的精制抗體的制造方法，其中，緩沖液中的精氨酸和/或精氨酸衍生物的濃度為0.1～4.0M。
8.如權利要求3～7中任意一項所述的精制抗體的制造方法，其中，抗體為人源化抗體或人類型抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種使用蛋白A親和層析色譜法的抗體的精制方法，具體而言，涉及提供一種抗體的回收率良好、并且不會發(fā)生變性的洗脫緩沖液的技術。其解決手段為，在使用蛋白A親和層析色譜精制抗體的時候，使用pH調整至4.0～5.0的含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的微酸性緩沖液，洗脫抗體并防止回收的抗體發(fā)生變性的精制方法。
文檔編號C12P21/04GK1680426SQ200510004669
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月21日 優(yōu)先權日2004年1月21日
發(fā)明者弓岡良輔, 江島大輔, 荒川力 申請人:味之素株式會社