專利名稱：云南紅梨PybHLH基因及其原核表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種云南紅梨花青素生物合成、毛狀體發(fā)生發(fā)育及鹽脅迫調(diào)控蛋白基因及其原核表達(dá)和原核表達(dá)載體在制備PybHLH蛋白和特異性抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅色果皮是梨分子育種的重要性狀指標(biāo)。云南省因其獨(dú)特的地理和氣候條件而擁有較多的紅皮梨種質(zhì)資源，1986年以來先后已選育出早白蜜、美人酥、滿天紅和云紅梨I號四個栽培品種。但生產(chǎn)中除云紅梨I號外，其它3個品種都會因氣候變化而導(dǎo)致著色較差甚至不著色，因此需要研究紅梨果皮的著色機(jī)理。已有研究表明植物花青素的合成是由轉(zhuǎn)錄復(fù)合物MYB/bHLH/ WD40調(diào)控的。前人對MYB研究較多，而對植物中的bHLH和WD40蛋白研究較少。在擬南芥中LDOX基因啟動子直接包括EGL3和TT8在內(nèi)的不同的MYB-BHLH-TTG1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的調(diào)控，egl3、tt8和egl3 tt8功能缺失突變體試驗(yàn)也表明了 egl3和tt8是擬南芥幼苗花青素累積的必要條件。在擬南芥中JAZ( Jasmonate ZIM-domain)蛋白與WD-repeat/bHLH/MYB 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的 bHLH (Transparent Testa8, Glabra3 [GL3]和 Enhancer ofGlabra3 [EGL3])和R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子(MYB75和Glabral)互作，抑制了 JA調(diào)控的花青素的累積和毛狀體的發(fā)生，而JA誘導(dǎo)的JAZ蛋白的降解能夠解除這種抑制。在大麗花(DahI iavariabilis)中，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 DvIVS 通過調(diào)控 DvCHSl, DvF3H, DvDFR 和 DvANS 的轉(zhuǎn)錄來參與其花青素的生物合成。在葡萄中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYCAl可能通過調(diào)控ANR和UFGT基因的表達(dá)來調(diào)控其花青素的生物合成。在龍膽花(G.triflora)中，GtMYB3和GtbHLH參與花青素的生物合成。Zhang等人通過酵母雙雜交和植物過表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGL3、GL3能夠與TTGl (WD40)和 MYB 蛋白(GLl, PAPl、PAP2、CPC、TRY)組合，形成 MYB/bHLH/WD40 復(fù)合物進(jìn)行包括花青素生物合成和毛狀體形 成的多功能的調(diào)控。Baudry等人通過遺傳和分子的方法發(fā)現(xiàn)TT2 (MYB)、TT8 (bHLH)和TTGl (WDR)能夠形成四元復(fù)合物直接調(diào)控BAN在植物中的表達(dá)。Payne等通過酵母雙雜交證實(shí)了在擬南芥中GL3/GL1/TTG1復(fù)合物調(diào)控毛狀體的發(fā)育。Bouyer通過克隆分析、誤表達(dá)和微注射試驗(yàn)提出了毛狀體形成的捕獲_耗盡機(jī)制:在高濃度的毛狀體促進(jìn)蛋白GL3細(xì)胞中，GL3通過結(jié)合毛狀體形成蛋白TTGl來耗盡臨近細(xì)胞中的TTGl，從而導(dǎo)致毛狀體形成，而周圍的細(xì)胞因TTGl的減少而不能形成毛狀體。而Zhao等人通過離子轟擊試驗(yàn)證明了 TTGl，GL3，GLl和GL2并不在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，而R3-MYB，CPC則可在鄰近細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，提出TTGl復(fù)合物直接調(diào)節(jié)激活子和抑制子，而抑制子的運(yùn)動影響擬南芥葉上毛狀體的類型。另外，植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子也參與植物抗逆性機(jī)制，擬南芥中過表達(dá)0rbHLH2或OrbHLHOOl基因增強(qiáng)擬南芥的抗鹽和抗冷的特性。在云南紅梨著色機(jī)理研究方面，本實(shí)驗(yàn)室研究了光照對云南紅梨著色的影響、構(gòu)建了光誘導(dǎo)果皮差異表達(dá)基因的SSH文庫，進(jìn)行了著色相關(guān)基因的分離和表達(dá)分析。前期研究結(jié)果表明云南紅梨果皮花青素的生物合成是由MYB/bHLH/WD40調(diào)控的。前期分離克隆的基因的部分片段(Λ構(gòu)建的原核表達(dá)載體，由于該載體只含有PybHLH基因的一段序列而不是全長序列，獲得的PybHHL抗體特異性不是很理想，不能準(zhǔn)確的用于分離與PybHLH蛋白相互作用的蛋白質(zhì)和DNA片段；在前人研究基礎(chǔ)上，針對云南紅梨栽培品種早白蜜、滿天紅、美人酥著色不穩(wěn)定、在國內(nèi)外尚未見有關(guān)云南紅梨果皮紅色著色機(jī)理方面研究報(bào)道，本研究選擇著色最好且穩(wěn)定的‘云紅梨I號’作為實(shí)驗(yàn)材料，克隆了 ‘云紅梨I號’中基因的全長序列，并且進(jìn)行了序列分析、原核表達(dá)和蛋白純化抗體制備的研究，這將為研究云南紅梨轉(zhuǎn)錄因子PybHLH的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)，并為作物花卉育種提供有利的科學(xué)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種云南紅梨基因，該基因主要是對云南紅梨花青素生物合成、毛狀體發(fā)生發(fā)育及鹽脅迫調(diào)控蛋白起作用，/>況￡//基因來源于云紅梨I號，云南紅梨基因含有兩個相連的基本亞區(qū)，即富含堿性氨基酸BASIC區(qū)域及其下游的HLH區(qū)域，其中堿性氨基酸基序與DNA的結(jié)合有關(guān)，對基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用。本發(fā)明另一目的是提供云南紅梨/基因的原核表達(dá)載體V從奶-PybHLH,該載體含有基因，上游有Ptac啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，Ptac啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，基因的N端含有GST標(biāo)簽。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備云南紅梨色素合成特異性調(diào)控蛋白 PybHLH 中。本發(fā)明另一目的是將原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備PybHLH特異性抗體中，PybHLH特異性抗體應(yīng)用在檢測其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)情況、PybHLH蛋白的亞細(xì)胞定位檢測、PybHLH蛋白的純化并且在蛋白相互作用分析以及用于Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建
(I)根據(jù)蘋果MdbHLH33基因(GenBank登錄號為DQ266451.1)編碼框，設(shè)計(jì)I對特異引物 PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3 和 PybHLH-R:3’:CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc,在上下游引物的5'端分別加入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。以云紅梨I號總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R進(jìn)行擴(kuò)增；
基因全長片段的回收；
基因的T/A克隆和測序；
(4)/>從^7基因的生物信息學(xué)分析及GenBank登錄號的獲得；
(5)構(gòu)建原核表達(dá)載體:使用BamHI和XhoI對pMD-lST-Zy/yK"質(zhì)粒和pGEX_4T_l進(jìn)行雙酶切，分別獲得5’和3’末端帶有分別帶有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的/基因片段和PGEX-4T-1載體，瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收，然后在16°C連接16 h，獲得原核表達(dá)載體認(rèn)^l-M-PybHLH ；
2、PybHLH基因的原核表達(dá)
使用熱刺激法將pGEX-4T-/^^yZ"質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta (DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下摸索最佳表達(dá)條件，在最適條件下進(jìn)行大量表達(dá)；3、PybHLH蛋白純化及抗體制備
收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，過GST瓊脂糖親和層吸柱進(jìn)行純化，收集純化后的蛋白，純化后的蛋白用于制備PybHLH蛋白特異性抗體、PybHLH蛋白表達(dá)檢測。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明獲得了基因的全長序列以及重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-/y^K仏通過
表達(dá)獲得純化蛋白，制備特異性較強(qiáng)的PybHLH抗體，與前期制備的抗體相比，本次發(fā)明獲得載體與抗體的優(yōu)勢更強(qiáng)，減少了在GST pull down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的非特異性條帶，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精 確，并且得出更好的結(jié)論。本發(fā)明制備的抗體可用于檢測PybHLH蛋白，彌補(bǔ)了目前沒有專門檢測PybHLH蛋白、蛋白相互作用分析的缺陷，另外，本發(fā)明的抗體還含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽,該抗體還可用于GST pull down>Far Western Blot和免疫沉淀(IP)及染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)中，研究與PybHLH蛋白相互作用的蛋白質(zhì)和DNA片段，并且，該抗體含有的GST標(biāo)簽，也方便了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。


圖1為本發(fā)明中云紅梨I號的總RNA電泳示意 圖2為本發(fā)明/基因的PCR結(jié)果示意圖，圖中:1是DNA MarkerIII ;2和3為PybHLH纖PCR的結(jié)果；
圖3為本發(fā)明中原核表達(dá)載體pMD18T-/y^K#的酶切結(jié)果示意圖；圖中:1是DNAMarkerIII ;2、4、6 為 pMD18T_/y^K"質(zhì)粒；3、5、7 分別為泳道 2、4、6 中 pMD18T_PybHLH質(zhì)粒的BamHI和XhoI雙酶切結(jié)果；
圖4為本發(fā)明中PybHLH蛋白在16°C、IPTG終濃度為I mM條件誘導(dǎo)下的表達(dá)情況示意圖，圖中:1是轉(zhuǎn)化PGEX-4T-1空載體的Rosetta菌體總蛋白；2_6是工程菌在16°C、IPTG終濃度為I mM條件下誘導(dǎo)0、2、4、6和8 h后的表達(dá)情況；M是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0431 ;7_8是工程菌在16°C、IPTG終濃度為I mM條件下誘導(dǎo)8 h，總蛋白破碎后目的蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況；
圖5為本發(fā)明中PybHLH蛋白的割膠純化示意圖，圖中:I的割膠回收后的PybHLH蛋白樣品；2是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)M0441 ；
圖6為本發(fā)明中PybHLH蛋白的Western Blot檢測結(jié)果示意圖；圖中:1是是PybHLH蛋白，2是GST蛋白負(fù)對照；
圖7為本發(fā)明中使用PybHLH抗體檢測35S::轉(zhuǎn)基因煙草葉片PybHLH蛋白表
達(dá)結(jié)果示意圖，圖中:1，2，3，4是轉(zhuǎn)基因株系，5是野生型對照；
圖8為本發(fā)明中免疫共沉淀分析結(jié)果示意圖，圖中:1-3是免疫沉淀的PybHLH蛋白；4是用ant1-GST進(jìn)行免疫沉淀的負(fù)對照；
圖9為本發(fā)明中Far Western blotting分析結(jié)果示意圖，圖中:1和3是PybHLH蛋白，2是GST為負(fù)對照；
圖10為原核表達(dá)載體pGEX-4T-/y^K"的構(gòu)建策略示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。實(shí)施例中使用的試劑主要為分子生物學(xué)試驗(yàn)試劑:各種限制性內(nèi)切酶、Pfu DNA聚合酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連，Takara)產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶購于Promaga公司的，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌辦Miia (DE3)菌株和大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞為北京Transgene公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。使用的儀器為GST瓊脂糖凝膠柱子，其它儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。所有引物序列合成在上海杰瑞生物科技股份有限公司進(jìn)行，所有基因測序在北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行。實(shí)施例1:本發(fā)明云南紅梨/基因的克隆、原核表達(dá)、純化和抗體制備，具體步驟如下:
(1)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)蘋果MdbHLH33基因(GenBank登錄號為DQ266451.1)編碼框，設(shè)計(jì)I對特異引物PybHLH-F:5’ -GGATCCatggctcagaatcatgagagggtg-3’ 和 PybHLH-R:5，-CTCGAGgcacttaccagcaattttccaaagc-3’，在上下游引物的5'端分別加入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線部分為酶切位點(diǎn))。(2)總RNA的提取
a、用液氮將0.1 g云紅梨I號紅色果皮充分研磨成粉末以后，加入1 ml RNA提取緩沖液(4 M異硫氰酸胍，25 mM檸檬酸鈉，0.5 % (w/v)十二烷基肌氨酸鈉，2 %(w/v) PVP,β-巰基乙醇)，轉(zhuǎn)入2 ml離心管中，再研磨均勻后，再加入1/10體積2 M醋酸鈉(pH 4.2)；
b、顛倒離心管數(shù)次，混勻之后，接著加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動5 min,冰上靜置15 min后，4°C離心15 min (12000 g/min)；
C、離心結(jié)束后取上清于新離心管中，加入等體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動5min,冰上靜置 15 min 后,4 °C離心 15 min (12000 g/min)；
d、取上清，加入等體積異丙醇，在_20°C沉淀RNA30 min，再次4°C離心15 min (12 000g/min),讓RNA沉淀在管壁；
e、RNA沉淀經(jīng)75%乙醇清洗兩次后抽真空干燥，然后加入20μ l無RNase的DEPC處理水徹底溶解RNA ；
f、使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA (見圖1)。(3) RT-PCR
以云紅梨I號總RNA為模板,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,具體步驟如下:
a、在EP管中加入以下組分:總RNA2 μ g ;oligo (dT) 18 0.5 μ g ;無RNase的水補(bǔ)足15
μ l ;
b、70°C5 min后，迅速冰上靜置2 min ；
C、離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集離心底部；
d、再向離心管中加入以下組分:5XM-MLV反應(yīng)緩沖液5 μ 1、dNTP (IOmM)U.25 μ 1RNase 抑制劑 0.5 μ 1、RTase M-MLV(200 U) 1 μ 1，無 RNase 的水補(bǔ)足 25 μ 1 ;e、42°C保溫60 min, -20 1:保存?zhèn)溆茫?br> 以反轉(zhuǎn)錄合成的云紅梨I號cDNA后使用PybHLH-F和PybHLH-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下:
反應(yīng)體系:ddH20 17.8 μ I, Taq Plus DNA Polymerase IOXBuffer 2.5 μ 1,10 mMdNTP 0.4μ 1，10μΜ 的 5’ 引物 1μ 1，10 μΜ 的 3’ 引物 I yl，cDNA 模板 2 μ 1,5 U/μ I的 Taq Plus DNA Polymerase 0.3 μ I ;反應(yīng)條件為:94 °C 2 min, (94°C 30 s’ 59°C 30s，72°C 2 min) 30 個循環(huán)，72°C 10 min (見圖 2)。基因片段的回收:對PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段；使用膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書對目的片段進(jìn)行回收?；虻腡/A克隆和測序；將回收的PCR產(chǎn)物，按照pMD18T說明書，進(jìn)行T/A克??；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α后，涂固體LB + Amp平板，挑取白色菌落，接種到液體LB + Amp培養(yǎng)基中，37°C、200 rpm搖床過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切檢測，然后送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。基因測序和生物信息學(xué)分析及GenBank登錄號的獲得:PybHLH基因的讀碼框?yàn)?947 bp，該基因編碼648個氨基酸，分子量為72925.8 Da，等電點(diǎn)為5.5LDNAMAN比對結(jié)果表明，PybHLH與蘋果、矮牽牛、擬南芥和玉米等調(diào)控花青素生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有很高的同源性，尤其是與蘋果中的MdbHLH33在同一進(jìn)化枝，故將該序列命名為PybHLH 荖里。 (7 )原核表達(dá)載體的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1O ):使用BamHI和Xho I對pMD \m~PybHLH和載體pGEX-4T-l按照說明書進(jìn)行雙酶切(見圖3)，分別獲得5’端帶有BamHI和3’端帶有XhoI的/基因片段和PGEX-4T-1載體，跑電泳后分別進(jìn)行膠回收，按照摩爾比目的基因:載體=3:1加樣,然 后加入Ligation Solution I,16°C連接16 h ;將感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5 α 100 μ I加入6 μ I連接體系中混勻；混合液冰浴30 min, 42°C熱刺激45s后，冰浴2 1^11;加入90(^1液體培養(yǎng)基30(:，371:搖床200 rpm 60min使菌體復(fù)蘇；培養(yǎng)結(jié)束后，常溫8000 rpm離心I min收集菌體；在超凈臺上吸去上清，剩余約0.1 ml時(shí)，使用移液槍混勻，接入帶有Amp抗性的LB固體平板上，用無菌三角棒涂布均勻；37°C過夜培養(yǎng)；挑取白色菌落，接種于LB液體+ Amp的培養(yǎng)基，37°C、180 rpm培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒；進(jìn)行酶切驗(yàn)證后，再送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序進(jìn)行測序驗(yàn)證插入基因的正確性，最后獲得原核表達(dá)載體認(rèn)&\-M_PybHLH。(8)PybHLH蛋白的原核表達(dá):使用熱刺激法將重組質(zhì)粒ρ6ΕΧ_4Τ-/>/ ^7轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB+Amp固體平板，挑取V-M-PybHLH的重組菌落于LB + Amp液體培養(yǎng)基中37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按1:100的比例接種于相同的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8，加IPTG至終濃度為I禮，在16°C下培養(yǎng)0、2、4、6和8 h后收集菌液用于分析總蛋白；4°C、12 000 rpm離心I min,棄上清液,沉淀用100 μ ISDS 凝膠加樣緩沖液(Tris-HCl 50 mM,pH 6.8 ；SDS 2 % ；DTT 100 mM ;溴酚藍(lán) 0.1 % ;甘油10 %)重懸，煮沸5 min后，12 000 rpm離心I min，取20 μ I上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(0.1 %考馬斯亮藍(lán)R-250，40 %甲醇，10 %冰乙酸)染色，脫色液(25 %甲醇，6 %冰乙酸)進(jìn)行脫色后，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照；結(jié)果顯示插入有外源片段的重組質(zhì)粒pGEX-4T-PybHLH經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)期的蛋白分子量約98.9 kD (包括載體上GST蛋白)左右有I條蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒和PGEX-4T-1對照質(zhì)粒未出現(xiàn)這條蛋白帶(見圖4),表明重組質(zhì)粒pGEX-4T_PybHLH在大腸桿菌Rosetta (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)了 PybHLH蛋白，超聲破碎后，SDS-PAGE檢測后，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要在包涵體表達(dá)。(9) PybHLH蛋白純化:包涵體蛋白的割膠純化，具體內(nèi)容如下:
1、重組蛋白的大量表達(dá)及包涵體的洗滌
a、最優(yōu)條件大量表達(dá)重組蛋白，超聲波破碎；
b、離心12000rpm,4°C,30分鐘，收集沉淀；
c、3M尿素洗滌沉淀，離心12000rpm，4°C，20分鐘，加入適量8M尿素冰上溶解沉淀。2、透析袋電洗脫法純化蛋白
a、透析袋的預(yù)處理:剪取適當(dāng)長度(10-20cm)的透析袋(截留范圍為8 000-12 000Da);置于大體積的2 %(ff/V)碳酸氫鈉和I mM EDTA(pH8.0)中，煮沸10 min ;蒸餾水徹底清洗透析袋；置于ImM EDTA(pH8.0)溶液中再次煮沸10 min ;冷卻后4 °C保存；
b、取已溶解的蛋白沉淀，加1/5體積5X蛋白上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳；
C、電泳結(jié)束后將膠放在0.25 M預(yù)冷的KCl中，4°C浸泡5分鐘使蛋白顯白色，蒸餾水沖洗蛋白膠，用刀片從SDS-PAGE電泳凝膠上切下目的蛋白，切成I mm X I mm X I mm的碎片，放入預(yù)處理好的透析袋中，注入2 ml SDS-PAGE電泳緩沖液，將透析袋前后封口 ；
d、電泳回收:在水平核酸電泳槽中加入適量SDS-PAGE電泳緩沖液，將裝有凝膠的透析袋置入其中，100 V電壓，4 °C電泳4-5 h，直至凝膠變透明，說明目的蛋白從凝膠中洗脫出來；
e、透析:洗脫完畢，吸出透析袋內(nèi)溶液，SDS-PAGE檢測(以10μ I的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量)電泳結(jié)果(見圖5)，鑒定后正確的蛋白溶液裝入干凈的透析袋中，用預(yù)冷的IXPBS溶液(I X PBS (IL)KCl 0.2 g、NaCl 8 g、Na2HP04 1.42 g、KH2P04 0.27 g)添加尿素8M(96 g)、6 M(72 g)、4 M(48 g)、2 M(24 g)、0 Μ于 4 °C下分別透析 3-5 h，其間換透析液2-3次；純化后的蛋白溶液送抗體制備公司制備PybHLH蛋白特異性抗體，可用于PybHLH蛋白表達(dá)水平檢測及進(jìn)行免疫沉淀(IP)、Far Western blotting和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試驗(yàn)。實(shí)施例2 =PybHLH蛋白特異性抗體的Western blotting和轉(zhuǎn)基因煙草的檢測 為檢測PybHLH蛋白特異性抗體的有效性，使用PybHLH蛋白抗體檢測誘導(dǎo)的PybHLH原
核表達(dá)蛋白和轉(zhuǎn)基因煙草，具體過程如下:
本實(shí)施例使用的儀器為垂直蛋白電泳儀、PVDF膜(millipore), Sem1-Dry TransferCell(BIO-RAD)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)；
試劑為丙烯酰胺、二甲叉丙烯酰胺，10 %APS，TEMED, I X甘氨酸Buffer，I XPBS,I XPBT,脫脂奶粉，Whitman 3MM濾紙等SDS-PAGE和Western試驗(yàn)試劑。、
A、PybHLH原核表達(dá)蛋白的Western blotting檢測
蛋白樣品制備:蛋白樣品和1/5體積5X蛋白上樣緩沖液(Tris-Cl (pH 6.8)250 mM,SDS 10 %，溴酚藍(lán)0.5 %，甘油50 %，β-巰基乙醇5 %)，95°C加熱5 min后置于冰上5_10min,常溫，13 000 rpm 離心 I min ；
一、SDS-PAGE
1、75 %酒精清洗玻璃膠板，組裝電泳裝置；按表I配制分離膠和濃縮膠，倒膠，小心用正丁醇或異丙醇覆蓋；
表1:分離膠和濃縮膠的配方
權(quán)利要求
1.云南紅梨/基因，其特征在于基因的核苷酸序列如SEQID N0:3所示或編碼如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述云南紅梨基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-/^^yZ仏其特征在于:該載體含有/基因，上游有Ptac啟動子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，Ptac啟動子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，基因的N端含有GST標(biāo)簽。
3.權(quán)利要求2的所述云南紅梨基因的原核表達(dá)載體在制備云南紅梨色素合成特異性調(diào)控蛋白PybHLH中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2的所述云南紅梨PybHLH基因的原核表達(dá)載體在制備PybHLH特異性抗體中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種云南紅梨花青素生物合成、毛狀體發(fā)生發(fā)育及鹽脅迫調(diào)控蛋白PybHLH基因及其原核表達(dá)載體，本發(fā)明利用RT-PCR技術(shù)從云南紅梨云紅梨1號紅色果皮中克隆PybHLH基因，然后構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-PybHLH，pGEX-4T-PybHLH載體在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行表達(dá)PybHLH蛋白，純化后，獲得云南紅梨PybHLH純化蛋白，本發(fā)明還將PybHLH基因原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備PybHLH特異性抗體中，獲得的PybHLH特異性抗體還用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用以及對PybHLH轉(zhuǎn)基因植物的檢測，本發(fā)明獲得的PybHLH特異性抗體中含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，獲得的PybHLH特異性抗體運(yùn)用于FarWesternblotting和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究蛋白質(zhì)相互作用以及準(zhǔn)確分離獲得與PybHLH相互作用的蛋白質(zhì)和DNA片段。
文檔編號C07K16/16GK103146709SQ20131008570
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者李昆志, 崔道雷, 張曉東, 樊磊, 陳麗梅, 舒群, 蘇俊 申請人:昆明理工大學(xué)