本發(fā)明涉及一種新基因及其應(yīng)用，特別涉及一種新的光效調(diào)控基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著全球人口數(shù)量的不斷增加，糧食短缺逐漸成為世界性問題之一，提高作物產(chǎn)量迫在眉睫(Food and Agriculture Organization of the United Nations， 2015)。光合作用被稱為地球上最偉大的生化反應(yīng)，它可以利用太陽能把無機物轉(zhuǎn)換為有機物，完成物質(zhì)和能量的雙重轉(zhuǎn)換(Vinyard et al.， 2013)，其效率直接決定著作物產(chǎn)量(Long et al.， 2006a)。據(jù)統(tǒng)計，地球上所有的植物通過光合作用所利用的光能，整體平均不超過0.1％。太陽光能中真正被轉(zhuǎn)化為農(nóng)作物各類物質(zhì)的能量不到轉(zhuǎn)變?yōu)樯锪康奶柲艿?.0％。因此，光合作用效率的有效提高，是增加作物產(chǎn)量的重要途徑，為糧食短缺問題的最終解決提供幫助。

植物對光能利用率是指太陽光中的能量被植物進行光合作用時轉(zhuǎn)化成化學(xué)能而貯存于光合產(chǎn)物中的百分率。越來越多的研究表明，植物光合作用遠未達到其最大理論效率(Long et al.， 2015)。在過去的50年中，科學(xué)家通過生物化學(xué)、遺傳學(xué)以及結(jié)構(gòu)學(xué)等方法對于光合作用的調(diào)控機理的認識有了很大的提高，不僅了解了光合作用的中間過程，而且鑒定了光合作用調(diào)控關(guān)鍵蛋白(Mulo et al.， 2008)，并解析了光合系統(tǒng)復(fù)合物三維結(jié)構(gòu) (Qin et al.， 2015)，為提高光合作用效率提供了理論依據(jù)。另外，超級計算機的快速發(fā)展可以允許科學(xué)家對光合作用過程中的每一個階段進行模擬，確定并改進植物生長中的瓶頸問題(Zhu et al.， 2007a; Zhu et al.， 2013)。由此可見，對于光合作用調(diào)控機理的深入理解，是有效提高光合作用產(chǎn)量的關(guān)鍵。

隨著對于光合作用機理的不斷理解，科學(xué)家通過基因工程方法改變光合作用的關(guān)鍵位點，不斷嘗試著提高植物光合作用效率(Barampuram and Zhang， 2011)。目前，提高光合作用效率的主要策略之一是優(yōu)化植物對于能量和物質(zhì)的有效利用(Ainsworth and Long， 2005; Long et al.， 2006b; Zhu et al.， 2007b)。例如，Blankenship通過擴大光系統(tǒng)廣譜吸收范圍增加了光能利用率(Blankenship and Chen， 2013)；Miyagawa等通過過表達光合作用暗反應(yīng)SBPase酶，有效增加了光合作用暗反應(yīng)速率(Miyagawa et al.， 2001)； Lin等通過基因工程方法向煙草中轉(zhuǎn)入外源藍細菌Rubisco，從而使得光合作用碳固定更加高效(Lin et al.， 2014)。另外，盡量降低光合作用中的能量損失也可以提光合作用效率。例如，Kebeish等通過改變光呼吸途徑減少了光能損耗，有效增加了光合作用效率以及整體生物量(Kebeish et al.， 2007)。盡管如此，目前對于有效提高光合作用效率的可用靶標還是較為有限，系統(tǒng)篩選提高光合作用效率的可用靶標仍是今后的熱點問題。特別是，如何有效調(diào)整光能的吸收以及調(diào)控光能的利用效率，是重要的關(guān)注點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的與光效調(diào)控相關(guān)的基因HPE1。

本發(fā)明的另一個目的在于提供上述基因的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

光效調(diào)控基因HPE1，其序列如SEQ ID NO：1所示或為其同源保守序列。進一步的，其同源保守序列來自人工規(guī)模栽培作物。

作為上述技術(shù)方案的進一步改進，人工規(guī)模栽培作物選自禾本科作物、豆科作物、茄科作物。

一種提高植物光合作用效率的方法，包括將其光效調(diào)控基因HPE1調(diào)降、敲除、干擾其正常表達，或使光效調(diào)控HPE1 蛋白失活。

作為上述技術(shù)方案的進一步改進，植物選自禾本科作物、豆科作物、茄科作物。

一種快速篩查高光合作用效率作物的方法，包括檢測其光效調(diào)控基因HPE1的表達情況，光效調(diào)控基因HPE1活性降低、失活或缺失則判定作物的光合作用效率更高。

作為上述技術(shù)方案的進一步改進，作物選自禾本科作物、豆科作物、茄科作物。

一種獲得高光合作用效率作物的轉(zhuǎn)基因方法，包括將作物的光效調(diào)控基因HPE1敲除。

作為上述技術(shù)方案的進一步改進，作物選自禾本科作物、豆科作物、茄科作物。

本發(fā)明的有益效果是：

發(fā)明人從擬南芥突變體庫中篩選到一個高光效突變體HPE1，通過分子鑒定，克隆到了一個編碼含RRM結(jié)構(gòu)域葉綠體蛋白的基因HPE1 (AT1G70200)，并證實了HPE1參與擬南芥光效調(diào)控，是一種重要的調(diào)控植物光合效率的功能基因。利用正向遺傳學(xué)方法，獲得兩個HPE1的純合缺失突變體株系，發(fā)現(xiàn)HPE1基因的功能缺失可有效優(yōu)化捕光系統(tǒng)，提高植物光合作用效率，增加有機物積累和植株整體生物量。

HPE1基因（蛋白）在其他作物中具有序列保守性，提示HPE1在其他作物中的功能可能存在保守性，可以預(yù)見，HPE1基因是一種重要的調(diào)控植物光合效率的功能基因，利用該基因有望獲得光合作用效率更高的作物。

附圖說明

圖1是HPE1基因缺失提高擬南芥光合作用光反應(yīng)活性圖；

圖2是HPE1基因缺失降低擬南芥光能損失與光抑制效率圖；

圖3是HPE1基因缺失增加擬南芥有機物及生物量積累圖；

圖4是HPE1蛋白特異性定位于葉綠體圖；

圖5是HPE1蛋白序列在作物中的保守性分析圖。

具體實施方式

發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，HPE1基因位于擬南芥1號染色體上，基因座位號為LOC_AT1G70200（TAIR登錄號）。其全長基因組序列約為2104bp，包括4個外顯子，3個內(nèi)含子。其cDNA全長1883 bp（SEQ ID NO：2），編碼538個氨基酸。

HPE1編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：3所示，存在有葉綠體信號肽（Chloroplast Transit Peptide, CTP）結(jié)構(gòu)域和RNA識別結(jié)構(gòu)域（RNA Recognition Motif, RRM）。

發(fā)明人通過實驗證實，HPE1參與擬南芥光效調(diào)控，是一種重要的調(diào)控植物光合效率的功能基因。利用正向遺傳學(xué)方法，獲得兩個HPE1的純合缺失突變體株系，發(fā)現(xiàn)HPE1基因的功能缺失可有效優(yōu)化捕光系統(tǒng)，提高植物光合作用效率，增加有機物積累和植株整體生物量。

鑒于HPE1基因在植物中具有較高的保守性，可以預(yù)見在其他被子植物中同樣具有相同或相近的功能。因此，通過對HPE1基因進行處理，有望獲得高光效的作物，如禾本科作物、豆科作物、茄科作物、薔薇科作物、十字花科作物等作物，包括但不限于水稻、小麥、高粱、玉米、大豆、馬鈴薯、菠菜等。

下面結(jié)合實驗，進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

一．?dāng)M南芥HPE1突變體中HPE1基因表達分析

1．?dāng)M南芥總RNA的提?。?/p>

取三周齡擬南芥野生型（Col-0）和HPE1（hpe1-1，hpe1-2）突變體嫩葉，在1.5mL EP中管中用液氮冷凍并研磨成粉狀，轉(zhuǎn)入塑料離心管，并按照每0.1g材料加入1mL提取試劑的比例加入Trizol試劑（Invitrogen公司產(chǎn)RNA專用提取試劑），混合均勻；再按照每0.1g材料加入200uL 氯仿的比例加入氯仿，混合均勻，10 000g，4℃離心15m，棄去中間層及下層有機相，收集上層水相轉(zhuǎn)到新的離心管內(nèi)；加入600uL 異丙醇，混合均勻，室溫靜置20m；10 000g，4℃離心15m，收集沉淀，待異丙醇揮發(fā)后溶于無RNA酶的超純水中，-80℃凍存。

2．HPE1基因的RT-PCR表達分析：

1．第一鏈cDNA的合成

1)取出-80℃保存的水稻愈傷組織總RNA 3 μL，加入2 μL的Oligo (dT)16 (10 mM)，混勻后置于70℃中水浴5 min；

2)冰上放置5 min后，于冰上向EP管中先后加入dNTP Mixture (10 mM) 2μL、5×RT Buffer 4 μL、Rnase抑制劑 1 μL(10 U/μL)、Rnase-free ddH2O 8 μL、ReverTra Ace 1 μL；

3)將EP管置于PCR儀中，按30℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min程序后瞬時離心，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈的單鏈cDNA，于-20℃冰箱保存。

2．cDNA為模板的PCR

設(shè)計如下兩條引物：

HPE1-F：5'- TCTAGAATGAACGGAGCTTCGCTCT-3'；（SEQ ID NO：4）

HPE1-R：5'- GGTACCTTCATCATTGTTTGAGGTTG-3'（SEQ ID NO：5）。

PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2μL、引物HPE1-F 0.5 μL、引物HPE1-R 0.5 μL、dNTP 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、H₂O 18 μL、TaKaRa LA Taq酶 0.25 μL。

擴增條件為：94℃變性 5 min；94℃ 30 s， 60℃ 30 s，72℃120 s 28個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠中分離并拍照，對照組野生型擬南芥可以擴增出HPE1基因，而hpe1突變體中擴增不出HPE1基因（圖1B)。

二．?dāng)M南芥HPE1突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析

植株暗適應(yīng)20 min 后，利用M 系列葉綠素?zé)晒鈨xIMAGING-PAM MAXI版（Heinz-Walz），測定響應(yīng)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

（1）最小熒光（F0）、最大熒光（Fm）以及最大光合作用效率（Fv/Fm）的測定：

打開葉綠素?zé)晒鈨xIMAGING-PAM飽和脈沖（2800 μmol photons m^-2 s^-1）測定F₀、F_m以及F_v/F_m，突變體最大光合作用效率F_v/F_m高于野生型擬南芥植株（圖1C)。

（2）光響應(yīng)曲線測定：

F₀和F_m測定后，設(shè)置光強參數(shù)以及時間間隔，測定實際光合作用效率（ФPSII）和電子傳遞速率（ETR）和1-qL的光相應(yīng)曲線。光強設(shè)置為0，81，145，186，281，335，461，701，以及 926 μmol photons m^-2 s^-1。每隔3 min 打開飽和脈沖（2800μmol photons m^-2 s^-1）記錄一次數(shù)值（圖1D)。

（3）光抑制實驗

高光（～1200 μmol photons m^-2 s^-1）處理植株0 h、3 h、6 h后，將植株暗適應(yīng)20 min，測定Fv/Fm，比較植株的光抑制程度，結(jié)果表明hpe1突變體中光抑制程度較野生型輕（圖2C)。

三．?dāng)M南芥HPE1突變體碳水化合物及生物量分析

1．?dāng)M南芥HPE1突變體碳水化合物分析

擬南芥代謝物（可溶性糖和脯氨酸）含量測定采用GC-MS檢測并定量。具體步驟如下：

1)取4-6片長勢一致的5周齡大小的擬南芥葉片，用液氮研磨成粉末狀，稱取100 mg左右的樣品加入到含有1400 μL的甲醇（-20℃預(yù)冷)的2 mL離心管種；

2)加入60 μL ribitol （0.2mg/mL）作為內(nèi)標，震蕩10 S混勻，70℃水浴10 min，11000 g離心10 min；

3)將上清轉(zhuǎn)移到10 mL的玻璃離心管中，加入750 uL氯仿（-20℃預(yù)冷)和1500 μL超純水-4℃預(yù)冷)，震蕩10 S混勻，2200 g離心15 min；

4)轉(zhuǎn)移200 uL上清液到新的1.5 mL離心管中，真空干燥的樣品加入40 uL METHOXYAMINATION試劑（20 mg/mL，溶于吡啶），37℃震蕩孵育2 h；加入70 uL硅烷化試劑MSTFA，37℃震蕩孵育30 min；

5)將衍生完全的樣品轉(zhuǎn)移到內(nèi)襯管中，并置于2 mL GC-MS進樣瓶，1uL衍生后的代謝物樣品通過Trace GC Untra氣相色譜儀（Thermo Fisher）在DSQ II單四級桿質(zhì)譜儀（Thermo Fisher）上檢測并分析；

6)數(shù)據(jù)通過Xcalibur（Thermo Fisher）軟件分析和定量，結(jié)果表明hpe1突變體中碳水化合物葡萄糖和果糖，以及脯氨酸含量較野生型顯著提高（圖3A-3C)。

2．?dāng)M南芥HPE1生物量分析

對五周齡野生型、hpe1-1和hpe1-2突變體擬南芥植株進行鮮重、干重統(tǒng)計（圖3D-3F)。從圖中可以看出，與野生型相比，hpe1-1和hpe1-2突變體擬南芥植株的鮮重、干重都有顯著提高。

四．HPE1蛋白亞細胞定位分析

1．HPE1基因的克隆

設(shè)計如下兩條引物：

HPE1-F：5'- TCTAGAATGAACGGAGCTTCGCTCT-3'；

HPE1-R：5'- GGTACCTTCATCATTGTTTGAGGTTG-3'。

PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2μL、引物HPE1-F 0.5 μL、引物HPE1-R 0.5 μL、dNTP 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、H₂O 18 μL、TaKaRa LA Taq酶 0.25 μL。

擴增條件為：94℃變性 5 min；94℃ 30 s， 60℃ 30 s，72℃120 s 30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖膠中分離并拍照。

2．HPE1-GFP融合蛋白表達載體的構(gòu)建

以Columbia-0（Col-0）cDNA為模板，PCR得到的DNA片段先連接至pMD 18-T 載體中，送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。本實驗室利用pBluescript載體構(gòu)建了pRiActin中間載體，在此基礎(chǔ)上將測序正確的OsLYP4基因的編碼序列連接入pRiActin載體后，將經(jīng)鑒定正確的HPE1過表達目的基因片段克隆用XbaI和Kpn I雙酶切；原生質(zhì)體瞬時表達載體pUC-GFP分別用XbaI和Kpn I雙酶切，回收并純化。將回收得到的過表達基因片段用T₄ DNA連接酶連接入原生質(zhì)體瞬時表達載體pUC-GFP的相應(yīng)位點中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，同時將瞬時表達載體pUC-GFP酶切回收后的產(chǎn)物也轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，作為對照；挑選陽性克隆提取質(zhì)粒DNA，進行酶切鑒定，最后得到在35S啟動子驅(qū)動下的HPE1-GFP融合蛋白表達載體。

3．利用擬南芥原生質(zhì)體系統(tǒng)瞬時表達HPE1-GFP融合蛋白

（1）試劑配置

1．母液（所有試劑均購于sigma）

以下所有溶液均由母液配制。

2．酶液

將上述溶液混勻，55℃孵育10min；冷卻到室溫后加入200μl 1M CaCl₂和200μl 10% BSA，并用0.45μm 濾網(wǎng)過濾。

5～10ml酶液能酶解10～20片葉子，最終能分離出（0.5～1）×10⁶個原生質(zhì)體，每個樣品需要（1～2）×10⁴個原生質(zhì)體

3．

4．

5．

6．

（2）原生質(zhì)體分離

選取3～4周齡、充分伸展的擬南芥葉片（葉位：2、3、4對）

方法：

1)將酶液用0.45μm的濾器過濾至一個15cm的平皿中；

2)用刀片將葉片切成0.5～1mm的細條（比較麻煩，注意勤換刀片），及時放入酶液，用鑷子小心翻動葉片細條，使它們浸沒在酶液中；

3)10mm汞柱抽真空30min；

4)黑暗靜置酶解約3h；

5)輕輕晃動平皿，釋放原生質(zhì)體，此時，酶液應(yīng)該變綠；

6)加入等體積的W5溶液，輕輕晃動平皿，充分釋放原生質(zhì)體；

7)用55μm的尼龍網(wǎng)過濾原生質(zhì)體，收集至15ml圓底塑料試管中；

8)800rmp離心1～2min；

9)用預(yù)冷的W5溶液清洗一次；

10)冰上靜置30min；

11)鏡檢原生質(zhì)體（擬南芥原生質(zhì)體的大小約為30～50μm），計數(shù)；

12)從冰上取出原生質(zhì)體，800rmp離心1min；

13)去上清，用MMg溶液重懸原生質(zhì)體，定量至（1-2）×10⁵個/ml。

（3）PEG轉(zhuǎn)化

1)在一個2ml的圓底EP管加入10 μl DNA（5 kb大小的質(zhì)粒DNA 10～20μg）；

2)加入100μl原生質(zhì)體（2 ×10⁴個原生質(zhì)體），混勻；

3)加入110μl PEG/Ca溶液，混勻；

4)從第一個開始計時，黑暗放置15min；

5)用440μl W5溶液稀釋，并輕輕混勻；

6)800rmp離心2min，去上清；

7)加入一定體積的WI溶液，分散原生質(zhì)體，平鋪于6/12/24孔板中培養(yǎng)；

8)過夜培養(yǎng)。

4．激光共聚焦觀察HPE1-GFP融合蛋白

熒光蛋白標記的目的蛋白在原生質(zhì)體細胞中表達后，利用激光掃描共聚焦顯微鏡進行觀察。GFP使用433 nm激發(fā)，并使用500-530 nm波長收集GFP信號；葉綠素自發(fā)熒光用488或514 nm波長的激光激發(fā)，并用650-750 nm收集（圖4B)。

從圖中可以清楚地看出，HPE1蛋白特異性定位于葉綠體中。

五．HPE1 的生物信息學(xué)分析

利用ClustalX 進行擬南芥HPE1 蛋白在其他陸生植物中的同源性分析(www. clustal.org)，包括煙草、大豆、菠菜、玉米、高粱、水稻等，發(fā)現(xiàn)HPE1蛋白序列在其他作物中有較高的保守性（圖5），可以預(yù)見，HPE1基因在其他作物極有可能存在相同的作用，通過調(diào)控HPE1基因，可以獲得相應(yīng)的高光效作物。

<110> 中山大學(xué)

<120> 光效調(diào)控基因HPE1及其應(yīng)用

<130> HPE1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2104

<212> DNA

<213> 擬南芥

<400> 1

agtttcttctccggcgaagaagaggataacgaaaagaaaacacatagctatgaacggagcttcgctctgcaactccgttttgcttcattctcattctctctctcgttttcagtcatcctcttcttcttgttctgtgtatctgatttcttctgcgcgtactacgtctaagtatatctcaatttctcatagaattcgacagagctttcgagaagttattgaaaaaaggagtaatgggttttgttcattcgctgtaaacaagcgtagaagtggcgattccgttattgtggagtcagacgatgatgatgaagaagatgatgaagattggggtgaatttgatggagaagatgaaggagaagaagaagaagaagatgaaggagagttcttaccaatggataagatgaagaaatggttagagaaaaagcctcgtggatttggtttaggtaaaaagtacgaaactttaattgaagataagttgctcgacgaaattgagcaaagttggaaagctcaagctgctaatctcaataagcttaagaatgatcctctcaagtctcaacagcttaagcgtgacgataatctcctcaaaggtttcgtcttttcttcttttttttgttaattgagttatagtttggaatcttatttagctttgttgtgttgtaaaggaactggagaaactcaaattgggtttcgtgttcgtgtgactaatcttcctaagaagaagaatgttcatagagatcttaaggttgcgtttaaagaagtaagtggcgttttgagtataacaccagctgtgtctgggaataagaagactaaggatcctgtgtgtaaaggatttgctcatgttgatttcaaaactgagattgatgcaaacaggtatgagacttgtggtgtttatagttaagtggtaatgaggcaaagttttgatttttttctcttaggtttgtgaaacagttcacgggacagagcttagcatttgggaaggttataaagcaaatcaaatgtcaggttgtggagtttacttctgatgattctgtatcgaaggaagtgtacttagataacggtttcaaggtgcagaagcttccgtattctggtcttgaaggagattctagtgctgatgttgttgaagaagaggttttgttgggttcaggggaagaatcggatgattcagaagaagaggtagatgaaagagaagtggaagacgatgagcggaatcatatctctagtagcatagaatcttctcccattgaaatgacacgtgattcgaataccaagttaaagtttgagaaacaagttgtgaagcgagagataagagaacatgaggaactagagacacctttagtttcattccaggtgaataaatctgaggaagctgcagcggaaacacacttggatgatgaacaatctgaggaagctgtagcagaaacactcttgaatgatgaacttgatggggatgatgaagaagaagttgctgaagacaatcttgaacctctgaacagttcattgtcatcctcagaagaaaatagagtagatagaatccgtaggctagagcaaaagcttctcggtaaagaaaaactcttgggtggaggagttggctttgataaaccagaagcaaaacccgctagagttgaaggaaagaagaaggagaaaaagaagaagacaaagattcttgtgaaaggccaagccaaaaaggggacaaagatagaaatccctggatcatcaaagaggtaaagagcatacagcaatttttgctaatcaatgtagaatctctactcaaattgattgatttcgacaattatgattcacaggttaaaggtgaaggagaaggctctattaactggcgtcttagtcaagtatgcggctaaagttgcttcaacctcaaacaatgatgaatgatatcattaacaagtgatcaaattttgatataatctttcatcaactgctagtagtgagccatcttcgatttgtttttataaaagtgttacatgaataggtgataacgttacgtggggaaatgctattttttctttctacatcttcatcaatttgtggagacagcaacgttcataaactacattttcagacttaaaaattgaaacttggcaggtaatac

<210> 2

<211> 1883

<212> DNA

<213> 擬南芥

<400> 2

agtttcttctccggcgaagaagaggataacgaaaagaaaacacatagctatgaacggagcttcgctctgcaactccgttttgcttcattctcattctctctctcgttttcagtcatcctcttcttcttgttctgtgtatctgatttcttctgcgcgtactacgtctaagtatatctcaatttctcatagaattcgacagagctttcgagaagttattgaaaaaaggagtaatgggttttgttcattcgctgtaaacaagcgtagaagtggcgattccgttattgtggagtcagacgatgatgatgaagaagatgatgaagattggggtgaatttgatggagaagatgaaggagaagaagaagaagaagatgaaggagagttcttaccaatggataagatgaagaaatggttagagaaaaagcctcgtggatttggtttaggtaaaaagtacgaaactttaattgaagataagttgctcgacgaaattgagcaaagttggaaagctcaagctgctaatctcaataagcttaagaatgatcctctcaagtctcaacagcttaagcgtgacgataatctcctcaaaggaactggagaaactcaaattgggtttcgtgttcgtgtgactaatcttcctaagaagaagaatgttcatagagatcttaaggttgcgtttaaagaagtaagtggcgttttgagtataacaccagctgtgtctgggaataagaagactaaggatcctgtgtgtaaaggatttgctcatgttgatttcaaaactgagattgatgcaaacaggtttgtgaaacagttcacgggacagagcttagcatttgggaaggttataaagcaaatcaaatgtcaggttgtggagtttacttctgatgattctgtatcgaaggaagtgtacttagataacggtttcaaggtgcagaagcttccgtattctggtcttgaaggagattctagtgctgatgttgttgaagaagaggttttgttgggttcaggggaagaatcggatgattcagaagaagaggtagatgaaagagaagtggaagacgatgagcggaatcatatctctagtagcatagaatcttctcccattgaaatgacacgtgattcgaataccaagttaaagtttgagaaacaagttgtgaagcgagagataagagaacatgaggaactagagacacctttagtttcattccaggtgaataaatctgaggaagctgcagcggaaacacacttggatgatgaacaatctgaggaagctgtagcagaaacactcttgaatgatgaacttgatggggatgatgaagaagaagttgctgaagacaatcttgaacctctgaacagttcattgtcatcctcagaagaaaatagagtagatagaatccgtaggctagagcaaaagcttctcggtaaagaaaaactcttgggtggaggagttggctttgataaaccagaagcaaaacccgctagagttgaaggaaagaagaaggagaaaaagaagaagacaaagattcttgtgaaaggccaagccaaaaaggggacaaagatagaaatccctggatcatcaaagaggttaaaggtgaaggagaaggctctattaactggcgtcttagtcaagtatgcggctaaagttgcttcaacctcaaacaatgatgaatgatatcattaacaagtgatcaaattttgatataatctttcatcaactgctagtagtgagccatcttcgatttgtttttataaaagtgttacatgaataggtgataacgttacgtggggaaatgctattttttctttctacatcttcatcaatttgtggagacagcaacgttcataaactacattttcagacttaaaaattgaaacttggcaggtaatac

<210> 3

<211> 538

<212> PRT

<213> 擬南芥

<400> 3

Met Asn Gly Ala Ser Leu Cys Asn Ser Val Leu Leu His Ser His Ser

1 5 10 15

Leu Ser Arg Phe Gln Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser Val Tyr Leu Ile

20 25 30

Ser Ser Ala Arg Thr Thr Ser Lys Tyr Ile Ser Ile Ser His Arg Ile

35 40 45

Arg Gln Ser Phe Arg Glu Val Ile Glu Lys Arg Ser Asn Gly Phe Cys

50 55 60

Ser Phe Ala Val Asn Lys Arg Arg Ser Gly Asp Ser Val Ile Val Glu

65 70 75 80

Ser Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Glu Asp Trp Gly Glu Phe Asp

85 90 95

Gly Glu Asp Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Gly Glu Phe Leu

100 105 110

Pro Met Asp Lys Met Lys Lys Trp Leu Glu Lys Lys Pro Arg Gly Phe

115 120 125

Gly Leu Gly Lys Lys Tyr Glu Thr Leu Ile Glu Asp Lys Leu Leu Asp

130 135 140

Glu Ile Glu Gln Ser Trp Lys Ala Gln Ala Ala Asn Leu Asn Lys Leu

145 150 155 160

Lys Asn Asp Pro Leu Lys Ser Gln Gln Leu Lys Arg Asp Asp Asn Leu

165 170 175

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Thr Gln Ile Gly Phe Arg Val Arg Val Thr

180 185 190

Asn Leu Pro Lys Lys Lys Asn Val His Arg Asp Leu Lys Val Ala Phe

195 200 205

Lys Glu Val Ser Gly Val Leu Ser Ile Thr Pro Ala Val Ser Gly Asn

210 215 220

Lys Lys Thr Lys Asp Pro Val Cys Lys Gly Phe Ala His Val Asp Phe

225 230 235 240

Lys Thr Glu Ile Asp Ala Asn Arg Phe Val Lys Gln Phe Thr Gly Gln

245 250 255

Ser Leu Ala Phe Gly Lys Val Ile Lys Gln Ile Lys Cys Gln Val Val

260 265 270

Glu Phe Thr Ser Asp Asp Ser Val Ser Lys Glu Val Tyr Leu Asp Asn

275 280 285

Gly Phe Lys Val Gln Lys Leu Pro Tyr Ser Gly Leu Glu Gly Asp Ser

290 295 300

Ser Ala Asp Val Val Glu Glu Glu Val Leu Leu Gly Ser Gly Glu Glu

305 310 315 320

Ser Asp Asp Ser Glu Glu Glu Val Asp Glu Arg Glu Val Glu Asp Asp

325 330 335

Glu Arg Asn His Ile Ser Ser Ser Ile Glu Ser Ser Pro Ile Glu Met

340 345 350

Thr Arg Asp Ser Asn Thr Lys Leu Lys Phe Glu Lys Gln Val Val Lys

355 360 365

Arg Glu Ile Arg Glu His Glu Glu Leu Glu Thr Pro Leu Val Ser Phe

370 375 380

Gln Val Asn Lys Ser Glu Glu Ala Ala Ala Glu Thr His Leu Asp Asp

385 390 395 400

Glu Gln Ser Glu Glu Ala Val Ala Glu Thr Leu Leu Asn Asp Glu Leu

405 410 415

Asp Gly Asp Asp Glu Glu Glu Val Ala Glu Asp Asn Leu Glu Pro Leu

420 425 430

Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Asn Arg Val Asp Arg Ile Arg

435 440 445

Arg Leu Glu Gln Lys Leu Leu Gly Lys Glu Lys Leu Leu Gly Gly Gly

450 455 460

Val Gly Phe Asp Lys Pro Glu Ala Lys Pro Ala Arg Val Glu Gly Lys

465 470 475 480

Lys Lys Glu Lys Lys Lys Lys Thr Lys Ile Leu Val Lys Gly Gln Ala

485 490 495

Lys Lys Gly Thr Lys Ile Glu Ile Pro Gly Ser Ser Lys Arg Leu Lys

500 505 510

Val Lys Glu Lys Ala Leu Leu Thr Gly Val Leu Val Lys Tyr Ala Ala

515 520 525

Lys Val Ala Ser Thr Ser Asn Asn Asp Glu

530 535

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

tctagaatga acggagcttc gctct 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

ggtaccttca tcattgtttg aggttg 26