本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個(gè)Ghd7基因在調(diào)控水稻劍葉葉綠素含量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葉綠素是高等植物進(jìn)行光合作用的主要色素，包括葉綠素a和葉綠素b，天線色素具有收集和傳遞光能的作用，反應(yīng)中心的特殊葉綠素a分子還可將光能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能。葉綠素位于類囊體膜上，均以非共價(jià)鍵與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合組成色素蛋白復(fù)合體行使其功能，葉綠素b還具有穩(wěn)定捕光色素蛋白復(fù)合體的作用。

水稻是最重要的糧食作物之一，劍葉葉綠素含量與葉片光合作用及產(chǎn)量潛力密切相關(guān)，是水稻育種中非常重要的生理性狀。提高葉綠素含量一直是水稻育種的重要目標(biāo)，如Peng et al.(2008)研究表明，新的高產(chǎn)品種與以往釋放的產(chǎn)量較低的品種相比，葉片光合速率及葉綠素含量更高。但最新學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，在強(qiáng)光照射下，過高的天線色素含量會(huì)導(dǎo)致色素分子過度激發(fā)，誘導(dǎo)非光化淬滅(NPQ)產(chǎn)生，甚至導(dǎo)致光損傷(photo-damage)。過高的天線色素含量還直接攔截了冠層內(nèi)部甚至同一葉片中深層細(xì)胞的光能資源(Zhu et al.,2010)。育種實(shí)踐中應(yīng)通過天線葉綠素含量的最優(yōu)化，從而最大程度上提高光合效率(Ort et al.,2011)。

葉綠素的合成與降解是由許多酶參與的復(fù)雜過程，在模式植物擬南芥中已基本鑒定出參與葉綠素代謝的全部酶類(Beale,2005；Nagata et al.,2005)。葉綠素代謝可分為四個(gè)階段(Masuda and Fujita,2008)：1)由δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合成原卟啉IX(Proto IX)。這階段反應(yīng)為葉綠素、血紅素(Heme)及siroheme生物合成所共有，又稱為“共同路徑”。2)鎂分支。在原卟啉Ⅸ處有兩條分支，一是Mg2+螯合酶催化螯合形成Mg-原卟啉IX(Mg-Proto IX)，即反應(yīng)向合成葉綠素的鎂分支進(jìn)行；另一個(gè)是經(jīng)過Fe2+螯合酶催化螯合形成亞鐵血紅素。3)葉綠素循環(huán)，即葉綠素a與葉綠素b之間的相互轉(zhuǎn)化。4)葉綠素a的降解。葉綠素a最終被降解成非熒光葉綠素代謝物(NCCs)。葉綠素b降解前要先轉(zhuǎn)化為葉綠素a。

水稻中利用葉綠素合成缺陷突變體或非功能性持綠突變體已鑒定出一系列參與葉綠素代謝的基因，如OsChlH(Jung et al.,2003),OsChlD,OsChlI(Zhang et al.,2006),YGL1(Wu et al.,2007),NON-YELLOW COLORING1(NYC1),NYC1-LIKE(NOL)(Kusaba et al.,2007；Sato et al.,2009),STAYGREEN(SGR)(Jianget al.,2007)及NON-YELLOW COLORING4(NYC4)(Yamatani et al.,2013)，但這些基因尚沒有報(bào)道控制葉綠素含量的自然遺傳變異。最近研究表明，NAL1是一個(gè)控制葉綠素含量自然變異的主效位點(diǎn)，該基因還控制著劍葉形狀、葉片維管束結(jié)構(gòu)、光合速率、穗粒數(shù)及產(chǎn)量等眾多性狀，在自然界不同的單倍型間發(fā)現(xiàn)有氨基酸替換及表達(dá)水平上的差異，其轉(zhuǎn)錄本也十分復(fù)雜(Chen et al.,2012；Fujita et al.,2013；Takai et al., 2013；Zhang et al.,2014；Wang et al.,2015)。

Ghd7是一個(gè)控制水稻抽穗期、株高、每穗穎花數(shù)的一因多效基因，位于水稻第7染色體著絲粒附近，其編碼蛋白含有一個(gè)CCT保守結(jié)構(gòu)域。Ghd7受光周期調(diào)控，長日照下會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)量的上升，從而抑制下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致水稻抽穗期推遲，株高增高，產(chǎn)量增加(Xue et al.,2008)。多效性基因Ghd7在還參與了水稻的時(shí)期轉(zhuǎn)換、株型調(diào)控、脅迫反應(yīng)及激素調(diào)控等過程。Ghd7編碼轉(zhuǎn)錄因子且具有轉(zhuǎn)錄抑制活性(Xue et al.,2008；Weng et al.,2014)。

本發(fā)明以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室533份測序核心種質(zhì)為關(guān)聯(lián)群體，對種質(zhì)資源劍葉葉綠素含量進(jìn)行了系統(tǒng)考察，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)在第7染色體9.13-9.17 Mb區(qū)間有一顯著的熱點(diǎn)區(qū)域，能重復(fù)檢測到9個(gè)來自不同GWAS分析的極顯著的信號(hào)峰值，該峰值與Ghd7基因位置對應(yīng)。進(jìn)一步利用近等基因系及轉(zhuǎn)基因材料證實(shí)：Ghd7作為一個(gè)主要的位點(diǎn)，通過下調(diào)葉綠素代謝及葉綠體合成等相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控水稻劍葉葉綠素含量。因此，本發(fā)明的研究表明Ghd7基因?qū)τ趦?yōu)化水稻劍葉葉綠素含量具有重要育種價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目在于從水稻中尋找到調(diào)控葉綠素含量的基因，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)穩(wěn)定檢測到第七號(hào)染色體上Ghd7基因附近存在具極顯著效應(yīng)的信號(hào)峰值，利用近等基因系及轉(zhuǎn)基因材料充分證實(shí)了Ghd7的效應(yīng)，并對Ghd7如何在葉綠素代謝相關(guān)路徑中調(diào)控葉綠素含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該基因通過下調(diào)葉綠素代謝及葉綠體合成等相關(guān)基因表達(dá)量從而極顯著降低水稻葉綠素含量，顯然該基因在調(diào)控水稻葉綠素含量中具有重要育種價(jià)值。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

從水稻核心種質(zhì)關(guān)聯(lián)群體中隨機(jī)選取101份材料，檢測了基因表達(dá)量與葉綠素含量間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ghd7表達(dá)量與劍葉葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。

對兩個(gè)近等基因系NIL(mh7)及NIL(zs7)中的葉綠素含量相關(guān)性狀進(jìn)行了系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)攜帶有功能的Ghd7的近等基因系NIL(mh7)中SPAD、chla、chlb及total_chl有較低的表型值，說明Ghd7能夠下調(diào)葉綠素的含量。

對Ghd7超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的T₂代家系抽穗期的葉綠素含量及SPAD值進(jìn)行了系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)OX-Ghd7^ZH11轉(zhuǎn)基因陽性家系較陰性家系而言其SPAD、chla、chlb及total_chl有較低的表型值，再度證實(shí)Ghd7能夠下調(diào)葉綠素的含量。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室翁小煜博士以轉(zhuǎn)基因材料OX-Ghd7^HJ19將明恢63 Ghd7cDNA超量表達(dá)轉(zhuǎn)入合江19(HJ19)，其中HJ19攜帶無功能的Ghd7等位基因，將OX-Ghd7^HJ19及野生型HJ19播種35天后的葉片及0.1cm的幼穗取樣抽提RNA，使用Affymetrix水稻基因芯片進(jìn)行了表達(dá)譜比較分析，OX-Ghd7^HJ19獲得來自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室其制備過程及方法見翁小煜博士的文章(Weng,X.,et al.(2014).Grain number,plant height,and heading date7is a central regulator of growth,development,and stress response.Plant Physiol.164,735-747)。芯片分析結(jié)果顯示，參與葉綠素代謝及葉綠體合成等相關(guān)基因的表達(dá)量中有6個(gè)在幼葉中出現(xiàn)了下調(diào)，有7個(gè)在幼穗中出現(xiàn)了下調(diào)。

對8個(gè)受Ghd7下調(diào)的葉綠素代謝途徑中基因在近等基因系中的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中上述基因的表達(dá)量均極顯著下降。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明首次在水稻中應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法發(fā)現(xiàn)了一個(gè)控制葉綠素含量的主效位點(diǎn)Ghd7，利用近等基因系及轉(zhuǎn)基因材料充分證實(shí)了Ghd7調(diào)控劍葉葉綠素含量，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因通過下調(diào)葉綠素代謝及葉綠體合成等相關(guān)基因表達(dá)量從而極顯著降低水稻葉綠素含量，該基因在水稻高光效育種中具有重要育種價(jià)值；本發(fā)明也為其它作物中克隆相關(guān)基因提供了技術(shù)借鑒。

附圖說明

序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明中涉及到的明恢63的Ghd7基因的編碼區(qū)序列【克隆自NIL(mh7)Ghd7的cds序列】，序列長774bp，編碼257個(gè)氨基酸。

序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明中涉及到的明恢63的Ghd7基因編碼的蛋白質(zhì)的序列【克隆自NIL(mh7)Ghd7】。

序列表SEQ ID NO:3是本發(fā)明克隆自HJ19的Ghd7基因的cds序列，由于核苷酸的突變導(dǎo)致翻譯提前終止，該基因的編碼序列長159bp，編碼52個(gè)氨基酸。

序列表SEQ ID NO:4是本發(fā)明克隆自HJ19的Ghd7基因編碼的蛋白質(zhì)的序列。

圖1.LOC_Os01g52240在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

圖2.LOC_Os04g58200在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

圖3.LOC_Os08g33820在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

圖4.LOC_Os07g37550在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

圖5.LOC_Os02g10390在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著 下降。

圖6.LOC_Os07g37240在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

圖7.LOC_Os03g36540在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

圖8.LOC_Os08g12780在NIL(mh7)及NIL(zs7)中的表達(dá)量水平，與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中該基因的表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下降。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)并證明Ghd7是控制水稻劍葉葉綠素含量自然變異的主效基因。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。

實(shí)施例1：全基因組關(guān)聯(lián)分析在Ghd7基因區(qū)段檢測到控制葉綠素含量的極顯著效應(yīng)位點(diǎn)

以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室533份測序核心種質(zhì)為關(guān)聯(lián)群體，于2012及2013年對劍葉葉綠素含量進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查，使用線性混合模型(LMM)和多位點(diǎn)混合模型(MLMM)在整個(gè)關(guān)聯(lián)群體及各亞群中對葉綠素含量相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)，在第7染色體9.13-9.17Mb區(qū)間有一顯著的熱點(diǎn)區(qū)域，能重復(fù)檢測到9個(gè)來自不同GWAS分析的極顯著的信號(hào)峰值，該峰值與Ghd7基因位置對應(yīng)。

核心種質(zhì)葉綠素含量考察方法：待水稻抽穗后3天左右，取健康的葉片立即放入裝冰的泡沫盒中，用黑布裹好后立即帶回實(shí)驗(yàn)室中。用分析天平精確稱重，剪碎，加入丙酮：乙醇：水(4.5：4.5：1)的混合抽提液，4℃避光抽提，期間每隔一段時(shí)間搖勻樣品，待樣品完全脫色后于分光光度計(jì)上測量其吸光度值，其后按照Arnon法修正公式計(jì)算葉綠素含量。

全基因組關(guān)聯(lián)分析按文獻(xiàn)(Chen W,et al.Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism.Nat Genet,2014,46,714-721)所述方法進(jìn)行。

實(shí)施例2：核心種質(zhì)材料中Ghd7表達(dá)量與葉綠素含量間的關(guān)系

從核心種質(zhì)關(guān)聯(lián)群體中隨機(jī)選取101份材料，檢測了基因表達(dá)量與葉綠素含量間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ghd7表達(dá)量與12chla,12chlb及12total_chl呈極顯著負(fù)相關(guān)(表2)。

表2 Ghd7表達(dá)量與葉綠素含量相關(guān)性狀間的關(guān)系

實(shí)施例3：利用近等基因系及轉(zhuǎn)基因材料證實(shí)Ghd7對劍葉葉綠素含量的調(diào)控效應(yīng)

本發(fā)明用到的材料NIL(mh7)及NIL(zs7)為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的以珍汕97為遺傳背景的一對近等基因系(該近等基因系的原始命名為自交系RIL50，參見：公開號(hào)CN101148674的專利說明書第3頁《具體實(shí)施方式》段落中第2行，該材料原始來源參見：邢永忠等，水稻株高和抽穗期基因的定位和分離，植物學(xué)報(bào)，2001，43(7):721-726Weiya)，利用該近等基因系薛為亞博士進(jìn)行了Ghd7基因的圖位克隆(Weiya Xue.,et al.Natural variation in Ghd7is an important regulator of heading date and yield potential in rice.2008，Nat Genet 40:761–767)，相關(guān)專利文獻(xiàn)可參考：邢永忠、張啟發(fā)、薛為亞的授權(quán)專利《一種控制水稻谷粒產(chǎn)量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd7的克隆及應(yīng)用》，專利號(hào)ZL2007100531994(授權(quán)公告日2009-10-28)公開號(hào)CN101148674的文獻(xiàn)中公開了供該材料的完整制備過程。NIL(mh7)和NIL(zs7)主要區(qū)別在于Ghd7基因區(qū)段，NIL(mh7)攜帶來自明恢63具完全功能的等位基因，而NIL(zs7)則完全缺失。

本發(fā)明用到的另一材料OX-Ghd7^ZH11為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育的超量表達(dá)Ghd7的轉(zhuǎn)基因材料，以中花11(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所惠贈(zèng))為轉(zhuǎn)化受體，超量表達(dá)的序列來自明恢63的Ghd7cDNA(已知中花11攜帶功能較弱的等位基因)該轉(zhuǎn)基因材料的制備方法及過程可見華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室翁小煜博士發(fā)表的文章(Weng,X.,et al.(2014).Grain number,plant height,and heading date7is a central regulator of growth,development,and stress response.Plant Physiol.164,735-747)。為使不同基因型材料在同一時(shí)間抽穗，以便比較抽穗期劍葉葉綠素含量，對播種期進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，攜帶有功能的Ghd7的近等基因系NIL(mh7)葉綠素含量極顯著低于該基因區(qū)段缺失的NIL(zs7)。對超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株T₂代選取了兩個(gè)陽性家系(OX-Ghd7^ZH11(+)-1及OX-Ghd7^ZH11(+)-3，其T₀代為獨(dú)立轉(zhuǎn)化子)及一個(gè)陰性家系(OX-Ghd7^ZH11(-))，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性家系劍葉葉綠素含量極顯著低于陰性家系。這些結(jié)果充分證明Ghd7能夠下調(diào)水稻劍葉葉綠素含量。

表2攜帶不同Ghd7等位基因的近等基因系及超表達(dá)家系之間的葉綠素含量比較

^a與NIL(zs7)比較，^b與OX-Ghd7^ZH11(-)比較，說明：*或**表示0.05或0.01顯著水平

實(shí)施例4：受Ghd7調(diào)控的參與葉綠素代謝及葉綠體合成等相關(guān)基因的表達(dá)分析

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室翁小煜博士以轉(zhuǎn)基因材料OX-Ghd7^HJ19將明恢63 Ghd7cDNA超量表達(dá)轉(zhuǎn)入合江19(HJ19)，其中HJ19攜帶無功能的Ghd7等位基因及野生型HJ19播種35天后的葉片及0.1cm的幼穗取樣抽提RNA，使用Affymetrix水稻基因芯片進(jìn)行了表達(dá)譜比較分析(Weng,X.,et al.(2014).Grain number,plant height,and heading date7is a central regulator of growth,development,and stress response.Plant Physiol.164,735-747)。根據(jù)該芯片數(shù)據(jù)，Ghd7超表達(dá)的材料中編碼鎂離子螯合酶亞基chlI、葉綠素a/b結(jié)合蛋白(Lhcb1.1)、葉綠體包被膜蛋白及原葉綠素酯還原酶a的基因在葉片中表達(dá)量下降，另有5個(gè)編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因(Lhca3,Lhca4,Lhcb1.2,Lhcb3及Lhcb4.1)在幼穗中表達(dá)量下降，未發(fā)現(xiàn)該類型基因出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)情況(表3)。

表3芯片分析檢測到的受Ghd7調(diào)控的參與葉綠素代謝及葉綠體合成的基因

與芯片結(jié)果相似，對近等基因系NIL(mh7)及NIL(zs7)播種35天后的葉片取樣抽提RNA進(jìn)行了表達(dá)量檢測，發(fā)現(xiàn)與Ghd7基因區(qū)段缺失的材料NIL(zs7)比較，在攜帶具正常功能的Ghd7等位基因的材料NIL(mh7)中上述基因的表達(dá)量均顯著下降(圖1-8)，其qRT-PCR的引物見表4。

表4本發(fā)明中用于qRT-PCR的引物

表達(dá)量檢測主要通過RT-PCR的方法(方法參見：J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)。具體操作步驟如下：

(1)葉片RNA抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)；

(2)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的步驟如下：①配制混合液1：總RNA 3μg，DNaseI 2U,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑)處理水(0.01％DEPC)到10μl，混勻后將混合液1在37℃放置15分鐘以除去DNA，②加入10μlEDTA混合后置于65℃水浴中溫浴10分鐘以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，1μl 10μg/ml的dNTP混合后置于65℃水浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后立刻置于冰上5分鐘，④配制7μl混合液2：5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巰基乙醇)2μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，混勻后將混合液37℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時(shí)，⑤反應(yīng)結(jié)束后將混合液置于70℃滅活15分鐘，⑥-20℃保存反應(yīng)最終產(chǎn)物。