本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種驢的miRNA序列、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：微小RNA(MicroRNAs，簡稱miRNA)是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列單鏈RNA，長約22nt。miRNA基因主要單個或成簇地位于基因組的非編碼區(qū)內(nèi)。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA約為數(shù)千個，大部分功能未知。據(jù)目前的研究顯示，miRNA通過不完全堿基互補的方式與mRNA相應(yīng)的區(qū)域結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯；在某些植物中，其還可以降解mRNA。通常一個基因可以被多個miRNA所調(diào)節(jié)，同時一個miRNA也可以調(diào)節(jié)多個mRNA。miRNA表達具有高度的保守性、時序性和組織特異性。研究表明miRNA參與了幾乎所有的生命活動，并起著重要作用，在動物中，包括：細胞發(fā)育、造血、脂肪代謝、器官生成、凋亡、細胞增殖與分化及腫瘤的發(fā)生。此外，在某些病毒中也發(fā)現(xiàn)有miRNA表達。在動物細胞中，轉(zhuǎn)錄形成的miRNA的前體首先折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的動物組織、器官和不同的發(fā)育時期，miRNA的表達譜是不同的，對miRNA表達譜的研究對miRNA生物功能的研究起到巨大的推動作用。盡管目前已經(jīng)在生物體中發(fā)現(xiàn)了一些miRNA，然而這些miRNA僅占生物體存在的miRNA中相當(dāng)少的一部分，并且研究人員對于這些miRNA的功能還了解很少。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新型miRNA，以研究miRNA對生物體的調(diào)節(jié)作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種驢的miRNA序列，這種miRNA能夠特異性結(jié)合到mRNA的相應(yīng)部位，影響相應(yīng)mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，從而影響相應(yīng)基因的表達。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的實施方式提供了一種驢的miRNA序列，該miRNA序列的核苷酸序列為SEQIDNO：1所示的序列。本發(fā)明的實施方式還提供了一種制備上述驢miRNA序列的方法，該方法包含以下步驟：1)取驢各個部位的若干離體組織分別放入若干個容器中，并將溫度調(diào)節(jié)至：-60～-100℃；形成若干個樣品組織1；2)取步驟1中樣品組織1，在液氮環(huán)境中研磨，放置于若干個容器中；并加入1～3ml的總RNA抽提試劑，混合均勻后，調(diào)節(jié)溫度至30～40℃孵育5～15min；調(diào)節(jié)溫度至2～6℃并離心分離5～15min，取上清液加氯仿混合均勻后靜置，形成若干個樣品組織2；3)調(diào)節(jié)步驟2中樣品組織2的溫度至2～6℃，離心分離10～20min，并加入異丙醇，放置15～20min；形成若干個樣品組織3；4)調(diào)節(jié)步驟3中樣品組織3的溫度至2～6℃，離心分離5～15min后去除上清液并洗滌沉淀；形成若干個樣品組織4；5)調(diào)步驟4中樣品組織4的溫度至2～6℃，離心分離1～5min，室溫放置，并加入15～50ul無菌無酶水，混合均勻；形成若干個樣品組織5；6)取適量的步驟5中樣品組織5構(gòu)建MicroRNA文庫；并通過測序平臺測序，將測序得到的序列進行轉(zhuǎn)化、處理后，即得若干個待分析純凈序列數(shù)據(jù)；7)將步驟6中待分析純凈序列數(shù)據(jù)與若干個核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對，去除重復(fù)序列和干擾片段；即得通過比對的miRNA序列；8)將步驟7中通過比對的miRNA序列與數(shù)據(jù)庫中的miRNA前體進行比對篩選；即得未通過比對的miRNA序列；9)將步驟8中未通過比對的miRNA序列與已知的驢基因組序列進行比對，篩選得到若干個miRNA序列；10)對步驟9中的miRNA序列進行靶基因預(yù)測；即得SEQIDNO：1所示的序列。本發(fā)明的實施方式還提供了一種將驢的miRNA序列用于制備抑制目的基因表達的組合物。本發(fā)明實施方式相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，通過特異性結(jié)合到mRNA的相應(yīng)部位，影響相應(yīng)mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，從而影響ACADVL基因的表達。進一步地，步驟1中取驢的心、肝、脾、肺、腎、腦、骨髓以及肌肉的離體組織。進一步地，步驟2中調(diào)節(jié)溫度至4℃，離心分離器的轉(zhuǎn)速為：12000r/分鐘，離心時間：10分鐘。進一步地，步驟2中的總RNA抽提試劑為Trizol試劑，每加入1ml的Trizol試劑相應(yīng)加入0.2ml的氯仿，渦旋混勻15秒靜置。進一步地，步驟4中用75％乙醇進行洗滌沉淀，其中，每使用1mlTrizol試劑至少使用1ml75％的乙醇。進一步地，步驟5中調(diào)節(jié)步驟4中樣品組織4的溫度至2～4℃，離心分離2～4min，室溫放置2～3min。進一步地，步驟6中的各個樣品組織5等量混合后RNA分子完整數(shù)大于7、濃度不小于100ng/ul、總量大于10ug。進一步地，步驟6中的測序平臺為Hiseq2000測序平臺。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細節(jié)和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護的技術(shù)方案。本發(fā)明的第一實施方式涉及一種驢的miRNA序列，該miRNA序列的核苷酸序列為SEQIDNO：1所示的序列。在本實施方式中，制備該miRNA序列的詳細步驟如下：1.樣品采集我們采取了一頭驢的8個組織樣：心、肝、脾、肺、腎、腦、骨髓、肌肉。將所取的組織放入無核糖核酸酶(RNase)的Eppendorf管中，立即投入液氮中，帶回實驗室后轉(zhuǎn)移保存在-80℃冰箱，用于提取TotalRNA與后續(xù)分析。2.TotalRNA的提取與質(zhì)量評估1)在經(jīng)過液氮預(yù)冷的研缽里加入100mg組織樣品，同時加入少許液氮，并迅速將樣品研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管；2)加入1mlTrizol(一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA)并混勻做勻漿處理，為了讓核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物徹底分離，室溫孵育10min；3)4攝氏度12000r/分鐘離心10分鐘，取上清；4)每加入1mlTrizol相應(yīng)加入0.2ml氯仿，渦旋混勻15秒，室溫靜置3分鐘；5)調(diào)節(jié)溫度至4攝氏度，離心，調(diào)節(jié)離心的轉(zhuǎn)速：12000r/分鐘，離心15分鐘分層后，(由于RNA主要集中在水層，取上層無色水相)并轉(zhuǎn)移到新管中；6)在水相中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置15-20分鐘；7)調(diào)節(jié)溫度至4攝氏度，離心，調(diào)節(jié)離心的轉(zhuǎn)速：12000r/分鐘，離心10分鐘，去除上清液；8)加入1ml75％乙醇洗滌沉淀，每使用1mlTrizol使用1ml75％乙醇；9)調(diào)節(jié)溫度至4攝氏度，離心，調(diào)節(jié)離心的轉(zhuǎn)速：12000r/分鐘，離心3分鐘，倒出液體，剩余少量液體，短暫離心，吸出液體。室溫放置2-3分鐘，加入15-50ul無菌無酶水，混勻，溶解RNA；10)用1％的瓊脂糖凝膠電泳,檢驗總RNA的完整性。具體步驟如下：取5μL總RNA與上樣緩沖液(LoadingBuffer)充分混勻后用1％的瓊脂糖凝膠電泳在140V恒壓電泳進行檢測，高壓快速電泳，在較短的時間內(nèi)(20分鐘切斷電源)使RNA電泳完畢，防止RNA降解，由此來檢驗總RNA的完整性。結(jié)果顯示，28S和18S兩條亮帶比較清晰，5s條帶非常模糊，說明提取的樣品RNA降解率較低，完整性較好，質(zhì)量也較好。利用紫外光分光光度儀分別測定樣品在260nm和280nm的光密度及RNA的純度和濃度，各樣品測定結(jié)果如表1所示，均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(純度檢測標(biāo)準(zhǔn)為，如果OD值260/280在1.8-2.0之間,260/230的值大于2.0，則說明沒有DNA和蛋白的污染)。表1：其中，OD260/OD280、OD260/OD230代表RNA質(zhì)檢參數(shù)，260、280、320、230nm下的吸光度分別代表了核酸、蛋白質(zhì)、鹽濃度和有機溶劑的值。3.MicroRNA文庫制備與測序每個組織樣品取3μgtotalRNA等量混合后構(gòu)建MicroRNA(miRNA)文庫，動物組織樣品構(gòu)建MiRNA文庫之前，所有樣品等量混合后的RNA分子完整數(shù)(RNAintegritynumber)要保證至少為7，濃度≥100ng/ul，且總量大于10ug，滿足所有要求之后才可以構(gòu)建文庫。值得注意的，在本實施方式中，構(gòu)建MicroRNA文庫的步驟如下：首先利用miRNA3′端羥基的特點加3′端接頭，終止反應(yīng)后，再加5′端接頭，使用反轉(zhuǎn)錄隨機引物與反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，然后用引物做12個PCR擴增循環(huán)，電泳之后切膠回收PCR產(chǎn)物并純化，利用Agilent2100精確檢測文庫濃度和質(zhì)量。檢測合格后，在cBot上生成簇(Cluster)，通過Hiseq2000測序平臺得到50bp的單端測序reads。4.測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)basecalling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，稱之為rawdata或rawreads。隨后對這些rawreads進行質(zhì)量控制，得到純凈序列，稱為cleanreads。利用IIIuminaHiseq2000對上述驢的miRNA文庫測序，一共得到了45,947,065條rawreads。對原始序列進行去除低質(zhì)量reads，5’接頭及3’接頭等過濾，得到44,033,167條cleanreads。cleanreads所占的比例分別為95.83％，反映了本實驗的測序質(zhì)量較高。對miRNA數(shù)據(jù)庫樣品的純凈序列進行了長度統(tǒng)計。結(jié)果顯示，測序所得序列長度主要集中在21-23nt左右，占純凈序列總量90％以上，符合Dicer酶切割產(chǎn)物的長度。5.參考序列比對通過將上述實驗樣品中的cleanreads與miRNA、Genbank、Rfam等數(shù)據(jù)庫比對，去除樣品中的重復(fù)序列、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA及mRNA外顯子內(nèi)含子等干擾片段。將得到的miRNA與miRBase19.0中的miRNA前體進行了比對，能夠比對上的序列有20,203,532。6.各樣品中新miRNA預(yù)測統(tǒng)計值得注意的是，在本實施方式中，并非所有的片段都能比對到數(shù)據(jù)庫中，有一些片段，在數(shù)據(jù)庫中沒有記錄，同時又具有一定的結(jié)構(gòu)功能，這樣的miRNA片段稱之為新的miRNA。應(yīng)用mireap程序，在已知家驢基因組的輔助下，從測序所得的序列中預(yù)測miRNA，篩選出新的miRNA。我們一共鑒定出了133個新型的miRNA。7.miRNA靶基因預(yù)測為了獲取這些miRNA的生物學(xué)功能，對所獲得的新的miRNA進行了靶基因預(yù)測。應(yīng)用軟件miranda程序，以驢基因組為目標(biāo)序列進行靶基因預(yù)測。得到其中一個miRNA序列即為SEQIDNO：1所示的序列，將其命名為序列eas-m0041-3p。本發(fā)明的第二實施方式涉及一種驢的miRNA序列具有抑制目的基因表達的功能，在本實施方式中，該目的基因為ACADVL，具體實驗步驟如下：1.合成eas-m0041-3p的模擬物(miRNAmimics)成熟的eas-m0041-3p模擬物(miRNAmimics)可以自己合成也可以從市面上購買獲取。使用前用滅菌的RNase-freeH2O或者滅菌的ddH2O，配制成20μM溶液。2.轉(zhuǎn)染1)細胞培養(yǎng)：取家驢的耳尖皮膚組織，清洗消毒后，用眼科剪剪成1mm3左右的小塊，在卡氏瓶中貼壁培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細胞鋪滿瓶子的底部時，用胰酶消化法傳代培養(yǎng)；2)轉(zhuǎn)染前一天，接種適當(dāng)數(shù)量的細胞至24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到30～50％(不同細胞生長速度不一樣，因此，接種細胞的數(shù)量需要根據(jù)細胞培養(yǎng)的經(jīng)驗)。值得注意的是：轉(zhuǎn)染時，細胞密度是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一，細胞生長過度會削弱細胞活力，從而降低細胞的轉(zhuǎn)染效率。3)在24孔板中，設(shè)置兩組對照。一組用于轉(zhuǎn)染，另一組不轉(zhuǎn)染。每組各有6個平行對照；4)稀釋miRNAmimics：a.用50μl不含血清培養(yǎng)基Ⅰ(v2)稀釋25pmolmiRNAmimics(加入細胞中的RNA總濃度為50nM)，輕輕混勻，室溫孵育5min；b.稀釋lipo2000：用50μl不含血清培養(yǎng)基Ⅰ(v2)稀釋1μllipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5min；c.將a與b輕輕混勻，室溫孵育20min(溶液可能會有渾濁，但不會影響轉(zhuǎn)染)；5)將miRNAmimics與lipo2000的混合液加入含有細胞以及培養(yǎng)液(v1)(即上述步驟2)中的培養(yǎng)基)的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻；6)將培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～96h。培養(yǎng)4～6h后，可以將孔里含有mimics-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基。3.定量1)引物設(shè)計選取GAPDH用作相對定量PCR的看家基因。利用Primer3.0設(shè)計ACADVL基因的特異性引物。2)總RNA的提取按照RNApreppure微量樣品總RNA提取試劑盒說明書進行操作。吸取2μL總RNA利用酶標(biāo)儀檢測質(zhì)量和濃度。3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈取提取的總RNA，在PCR管中配制cDNA第一條鏈合成反應(yīng)混合液，具體反應(yīng)體系如表2所示。表2：輕輕混勻，調(diào)節(jié)溫度至37℃，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min；再次調(diào)節(jié)溫度至85℃，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5s；產(chǎn)物在-20℃保存?zhèn)溆谩?)Real-timePCR體系的建立按照表3中所示組分配制PCR反應(yīng)液，同時配制陰性對照。每個樣品做3個重復(fù)：表3：成分加樣量(μL)SYBRPremixExTaqTM(2×)10μlPCRForwardPrimer(10μM)0.4μlPCRReversePrimer(10μM)0.4μlcDNA模版1.0μlddH20(滅菌雙蒸水)8.2μl總計20μl按照如表4中所示的反應(yīng)條件，采用三步法PCR擴增程序：表4：上面PCR運行結(jié)束后，立即運行如下程序：94℃30s，55℃30s至95℃30s連續(xù)掃描，以0.5℃作為一個梯度，掃描0.06s，繪制熔解曲線。各基因熔解曲線均只有單一的尖峰，表明擴增產(chǎn)物單一，無非特異性擴增干擾。5)結(jié)果與分析實時熒光定量RT-PCR獲取基因轉(zhuǎn)染前后達到熒光閾值所對應(yīng)的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參基因，2△Ct計算出ACADVL基因轉(zhuǎn)染前后的相對表達量。結(jié)果如表5所示：表5：序號轉(zhuǎn)染不轉(zhuǎn)染10.0060.0320.0070.03230.0060.04440.00430.04150.0040.05160.00520.063結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組與對照組相比，轉(zhuǎn)染組的ACADVL的表達量有顯著的下降。說明eas-m0041-3p能夠抑制ACADVL的表達。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實施方式是實現(xiàn)本發(fā)明的具體實施例，而在實際應(yīng)用中，可以在形式上和細節(jié)上對其作各種改變，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3