本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種lncRNA-MSR的抑制劑及其應用。

背景技術(shù)：

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導致靶基因的表達沉默，并產(chǎn)生相應的功能表型缺失的現(xiàn)象。雙鏈RNA進入細胞后，被Dicer酶(RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)結(jié)合并切割，形成長度約為20-25bp的產(chǎn)物，且在每條鏈的3’末端有2個核苷酸的小干擾RNA分子(small interference RNA，siRNA)。siRNA的一條鏈摻入到RNA-誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，與互補RNA的序列配對。RISC首先介導siRNA雙鏈解旋，然后，與RISC耦合的單鏈的siRNA以序列特異的方式與靶mRNA結(jié)合，之后由RISC的催化組分切割靶mRNA。切割的靶mRNA可以抑制其翻譯，并最終抑制該基因的表達?？梢姡瑂iRNA能夠參與調(diào)節(jié)細胞功能，而且已證實其在許多疾病中具有重要的調(diào)控作用，是一種理想的治療靶點和干預手段。

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)軟骨損傷是由外傷或慢性損傷導致的關(guān)節(jié)炎癥反應。在生物力學作用下，軟骨細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13(matrix metalloproteinase-13)和ADAMTS5(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1motif，5)，這些酶尤其會造成軟骨組織中細胞外基質(zhì)的II型膠原(Collagen Type Ⅱ，COL2)和聚集蛋白聚糖(AGGRECAN)的降解，從而使得軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)的水平下降，進一步加大細胞外基質(zhì)的合成難度，導致惡性循環(huán)，引起軟骨組織破壞并造成軟骨損傷?？梢姡浌羌毎募毎饣|(zhì)的降解是軟骨損傷中主要的病理變化。

因此，開發(fā)一種通過抑制軟骨細胞的細胞外基質(zhì)降解，尤其是通過RNA干擾抑制軟骨細胞的細胞外基質(zhì)降解的方法十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題在于，提供了一種lncRNA-MSR的抑制劑及其應用。具體技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種抑制劑，所述抑制劑抑制lncRNA-MSR的表達，以降低所述lncRNA-MSR的表達產(chǎn)物的水平，所述lncRNA-MSR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具體地，作為優(yōu)選，所述抑制劑為siRNA分子，所述siRNA分子的正義鏈的序列如SEQ ID NO:2所示，所述siRNA分子的反義鏈的序列如SEQ ID NO:3所示。

進一步地，所述siRNA分子為被修飾的siRNA分子，所述被修飾的siRNA分子使所述lncRNA-MSR的表達沉默。

具體地，所述修飾為核糖修飾、堿基修飾或磷酸骨架修飾。

進一步地，所述siRNA分子的核苷酸被部分替換或增減，核苷酸被部分替換或增減后的siRNA分子使所述lncRNA-MSR的表達沉默。

第二方面，本發(fā)明實施例提供了一種上述的任意一種抑制劑在制備預防或治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應用。

第二方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于預防或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，所述藥物組合物包括治療有效量的所述的抑制劑。

具體地，作為優(yōu)選，所述藥物組合物還包括與所述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

具體地，所述藥物組合物的劑型選自溶液劑、懸液劑、乳劑、粉劑、控制釋放劑或持續(xù)釋放制劑。

具體地，所述藥物組合物的給藥方式選自注射給藥或灌注給藥。

本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MSR是調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細胞骨架的重要因子，其表達會誘導軟骨細胞骨架結(jié)構(gòu)改變，并促進MMP-13和ADAMTS5的產(chǎn)生，導致軟骨組織中細胞外基質(zhì)降解，進而導致軟骨組織損傷。本發(fā)明實施例通過提供一種能抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑，能夠阻斷由lncRNA-MSR的表達而造成的軟骨組織中細胞外基質(zhì)的降解，對于預防并治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷具有重要的意義。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實施例1提供的實時定量PCR檢測陰性對照軟骨細胞中COL2、Aggrecan、MMP-13、lncRNA-MSR的mRNA表達水平示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1提供的實時定量PCR檢測實驗軟骨細胞中COL2、Aggrecan、MMP-13、ADAMTS5的mRNA表達水平示意圖；

圖3a是本發(fā)明實施例2提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，COL2、MMP-13的表達水平示意圖；

圖3b是本發(fā)明實施例2提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，COL2蛋白的相對表達水平示意圖；

圖3c是本發(fā)明實施例2提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，MMP-13蛋白的相對表達水平示意圖；

圖4a是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，細胞核和COL2蛋白的免疫熒光染色圖像；

圖4b是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，細胞核和MMP-13蛋白的免疫熒光染色圖像；

圖4c是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，COL2的平均光密度分布示意圖；

圖4d是本發(fā)明實施例3提供的陰性對照軟骨細胞和實驗軟骨細胞中，MMP-13的平均光密度分布示意圖。

具體實施方式

除非另有定義，本發(fā)明實施例所用的所有技術(shù)術(shù)語均具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述之前，對理解本發(fā)明實施例一些術(shù)語給出定義。

(1)本發(fā)明實施例中，所述的“治療有效量”指的是能對人或動物體產(chǎn)生 期望的治療功能或治療活性，且可從生理上能被人或動物所接受的量。

(2)本發(fā)明實施例中，所述的“藥學上可接受的載體和/或輔料”指的是適用于人或動物，且無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的，具有合理的效益/風險比的載體和/或輔料。

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實施方式作進一步地詳細描述。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的發(fā)生和發(fā)展包括幾個重要病理改變：軟骨組織退變、軟骨下骨硬化、滑膜炎癥和骨贅形成。其中，軟骨組織退變是骨關(guān)節(jié)炎中最初產(chǎn)生，目前治療手段無法逆轉(zhuǎn)，也是最重要的病理改變。軟骨組織大部分由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成。軟骨細胞是軟骨組織中唯一的細胞類型，其能夠合成及分解細胞外基質(zhì)。軟骨組織的細胞外基質(zhì)主要由II型膠原(Collagen type II，COL2)和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)組成。軟骨細胞和細胞外基質(zhì)共同維持關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)以及其細胞外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當發(fā)生OA時，這種穩(wěn)態(tài)被打破，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)的降解、軟骨細胞的退變等。OA過程中，軟骨細胞的退變及細胞外基質(zhì)降解主要分兩個階段：生物合成階段和降解階段。在生物合成階段，軟骨細胞嘗試去修復損傷的軟骨細胞外基質(zhì)。但是，由于合成細胞外基質(zhì)的基因表達水平很低，不能有效地合成足夠的細胞外基質(zhì)。在降解階段，在炎性因子的作用下，軟骨細胞產(chǎn)生使細胞外基質(zhì)降解的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13(matrix metalloproteinase-13，或者MMP13)和ADAMTS5(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1motif,5)，引起細胞外基質(zhì)降解。同時，炎性因子還可以引起合成細胞外基質(zhì)的基因表達進一步下降，細胞外基質(zhì)的合成更加不足，導致惡性循環(huán)，引起軟骨組織的急劇破壞。因此，細胞外基質(zhì)合成的不足以及細胞外基質(zhì)的降解是OA軟骨損傷中主要的病理變化。

根據(jù)對OA病理過程的研究，為了減緩OA的癥狀，并有效地逆轉(zhuǎn)或中止骨關(guān)節(jié)炎，本發(fā)明進一步研究了在OA的病理過程中起重要作用的基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA-MSR是一種調(diào)控軟骨細胞骨架的重要因子，其表達會誘導軟骨細胞的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使軟骨細胞產(chǎn)生MMP-13和ADAMTS5，引起細胞外基質(zhì)降解。因此，通過阻斷或抑制lncRNA-MSR的表達將阻斷或減少MMP-13和ADAMTS5的表達并減少軟骨組織中細胞外基質(zhì)的降解。

基于上述，第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種抑制劑，該抑制劑能夠抑制lncRNA-MSR的表達，以降低lncRNA-MSR的表達產(chǎn)物的水平，具體地lncRNA-MSR的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

具體地，該lncRNA-MSR的核苷酸序列如下：

可見，本發(fā)明實施例通過提供一種能抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑，通過抑制lncRNA-MSR的表達來維持軟骨細胞的骨架形態(tài)，抑制該骨架重構(gòu)，并抑制MMP-13和ADAMTS5的表達，從而阻斷軟骨組織中細胞外基質(zhì)的降解，對于預防并治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷具有重要的意義。

可以理解的是，對于能夠抑制lncRNA-MSR的表達或者能與lncRNA-MSR的表達產(chǎn)物結(jié)合的抑制劑種類沒有特別的限制，只要能實現(xiàn)沉默lncRNA-MSR的表達或者抑制lncRNA-MSR的促進脂質(zhì)生成的功能即可。例如，該能抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑可以包括但不限于小干擾核苷酸、反義寡核苷酸、抗體、活性有機化合物、以及能有抑制lncRNA-MSR表達或者能夠與lncRNA-MSR的表達產(chǎn)物相結(jié)合的其他抑制劑種類。

舉例來說，本發(fā)明實施例中抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑可以為一種或多種反義寡核苷酸，反義寡核苷酸與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中相配對的核苷酸序列具有90％以上的同一性。

進一步舉例來說，本發(fā)明實施例中抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑可以為一種或多種抗體，該抗體可以為單克隆抗體或者多克隆抗體，既可以為鼠源性 抗體也可以為人源化抗體。從結(jié)構(gòu)上來看，既可以是單鏈抗體也可以為其它抗體類似物，例如其可以包括但不限于核酸適配子等。

更進一步舉例來說，本發(fā)明實施例中抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑可以為抑制lncRNA-MSR表達或者能與lncRNA-MSR的表達產(chǎn)物結(jié)合的一種或多種活性化合物。

作為一種優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明實施例中抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑為一種siRNA分子，該siRNA分子的正義鏈的序列如SEQ ID NO:2所示，該siRNA分子的反義鏈的序列如SEQ ID NO:3所示。具體如下所示：

正義鏈(5'-3')5‘AUGAGGCGUGUGCCGUCAA dTdT 3‘

反義鏈(3'-5')3‘dTdT UACUCCGCACACGGCAGUU 5‘

其中，A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，dTdT是siRNA分子的末端懸垂，具有增強siRNA分子穩(wěn)定性的作用。

該siRNA分子的反義鏈能夠特異性地與lncRNA-MSR結(jié)合，對其進行降解，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，降低軟骨組織中細胞外基質(zhì)的降解，保護軟骨細胞骨架，進而抑制MMP-13和ADAMTS5的產(chǎn)生，達到治療軟骨損傷的目的。

進一步地，該siRNA分子為被修飾的siRNA分子，該被修飾的siRNA分子使lncRNA-MSR的表達沉默。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解得是，由于siRNA分子的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)容易被核酸酶降解，不易被組織吸收。所以，本發(fā)明實施例通過對上述siRNA分子進行化學修飾，被修飾后的siRNA分子首先應當使lncRNA-MSR的表達沉默，即具有抑制lncRNA-MSR表達的能力，此外，該被修飾后的siRNA分子具有增加的穩(wěn)定性，更易于體外操作以及體內(nèi)組織吸收。具體地，上述修飾可以為本領(lǐng)域常用的核糖修飾、堿基修飾或磷酸骨架修飾，或者其它方式的修飾。

或者，該siRNA分子的核苷酸被部分替換或增減，核苷酸被部分替換或增減后的siRNA分子使lncRNA-MSR的表達沉默，即具有抑制lncRNA-MSR表達的能力。

第二方面，本發(fā)明實施例提供了上述任意一種抑制劑在制備預防或治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應用。通過將上述任意一種抑制劑用來制備預防或治療骨關(guān)節(jié)炎藥物，能有效預防或改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷癥狀。

第三方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于預防或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合 物，該藥物組合物包括治療有效量的上述任意一種抑制劑。

本發(fā)明實施例提供的藥物組合物中含有治療有效量的上述抑制劑，其能夠抑制lncRNA-MSR的表達，進一步抑制MMP-13和ADAMTS5的表達，從而用來治療骨關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病。

具體地，作為優(yōu)選，該藥物組合物還包括與上述抑制劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

當上述藥物組合物用于預防或治療骨關(guān)節(jié)炎時，其可以單獨使用，也可以與其他可配伍的藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料配合使用。其中，所使用的載體或者輔料為本領(lǐng)域常見的現(xiàn)有技術(shù)。舉例來說，該載體可以為納米顆粒、脂質(zhì)體、膽固醇、殼聚糖及病毒等，而輔料可以為保護劑、賦形劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等。對載體或者輔料的用量沒有特別的限制，只要能夠使藥物組合物能夠維持和/或增強其預防或治療骨關(guān)節(jié)炎的效果即可。

進一步地，該藥物組合物的劑型可以為本領(lǐng)域常用的各種藥物劑型，只要適合于相應疾病的給藥，并且恰當?shù)乇３謑ncRNA-MSR抑制劑，尤其是上述抑制lncRNA-MSR表達的siRNA分子的活性即可。舉例來說，藥物組合物的劑型可以為溶液劑、懸液劑、乳劑、粉劑(例如凍干粉)、控制釋放劑或持續(xù)釋放制劑。

相應地，藥物組合物的給藥方式也可以為本領(lǐng)域常用的施藥方式，舉例來說，其可以選自注射給藥(例如，靜脈注射、關(guān)節(jié)腔局部注射或肌肉注射等)或灌注給藥，或者也可以經(jīng)口給藥等。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明實施例中所述的骨關(guān)節(jié)炎可以包括原發(fā)性關(guān)節(jié)炎、繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎、組織工程軟骨或者軟骨細胞移植治療關(guān)節(jié)軟骨缺損遠期發(fā)生的骨關(guān)節(jié)炎、或者其它與軟骨損傷相關(guān)的疾病，本發(fā)明實施例在此不作具體的限定。

以下將通過具體實施例進一步地描述本發(fā)明。

在以下具體實施例中，所涉及的操作未注明條件者，均按照常規(guī)條件或者制造商建議的條件進行。所用原料未注明生產(chǎn)廠商及規(guī)格者均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

其中，以下實施例中，Trizol試劑購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；5×M-MLV Buffer購自Promega公司；TaqDNA聚合酶購 自Promega公司；RNA酶抑制劑(RNasin)購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；dNTP購自Promega公司；Realtime PCR Mater Mix購自TOYOBO公司。

實施例1

步驟1、培養(yǎng)軟骨細胞

在無菌條件下，用剪刀將軟骨組織剪碎至小于1cm³大小，并利用含雙抗的PBS緩沖液反復沖洗。然后，利用10倍于軟骨組織質(zhì)量的量的胰酶在37℃下消化半小時，吸棄酶液。然后利用10倍于軟骨組織質(zhì)量的量的濃度為0.2％(g/ml)Ⅱ型膠原酶的PBS緩沖液在37℃下繼續(xù)攪拌消化4小時，篩網(wǎng)過濾去雜質(zhì)后，將處理后的軟骨組織碎片種植于底面面積為10cm²的新培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為低糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、含5％體積濃度的CO₂飽和濕度的CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

步驟2、siRNA分子的體外轉(zhuǎn)染

陰性對照siRNA：所選用的陰性對照siRNA為廣州市銳博生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品號的siN05815122147-1-5的siRNA分子。

實驗siRNA：采用siCatch^TM siRNA design智能設(shè)計靶向lncRNA-MSR的siRNA序列，其序列如下：

正義鏈(5'-3')5‘AUGAGGCGUGUGCCGUCAA dTdT 3‘

反義鏈(3'-5')3‘dTdT UACUCCGCACACGGCAGUU 5‘

2.1、轉(zhuǎn)染前一天，接種2×10⁵個步驟1中培養(yǎng)的軟骨細胞至6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到80％的融合度。

2.2、對于每個轉(zhuǎn)染樣品，按如下步驟準備質(zhì)粒-lipo2000混合液：

2.2.1、稀釋實驗siRNA和陰性對照siRNA：利用250μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋的上述各siRNA，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，得到質(zhì)粒稀釋液。其中，每250μl Opti-MEM培養(yǎng)基所稀釋的siRNA的量是100pmol。

2.2.2、稀釋lipo2000：利用250μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋10μl的lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5分鐘，得到lipo2000稀釋液。

2.2.3、將2.2.1得到的質(zhì)粒稀釋液和2.2.2得到的lipo2000稀釋液輕輕混勻，得到混合液并室溫孵育20分鐘(溶液可能會有渾濁，但不會影響轉(zhuǎn)染)。

2.2.4、將2.2.3得到的混合液加入含有步驟1中培養(yǎng)的軟骨細胞以及培養(yǎng)液的培養(yǎng)板各孔中，輕輕混勻。

2.2.5、將2.2.4得到的培養(yǎng)板置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24小時(培養(yǎng)4-6小時后，將孔里的培養(yǎng)基移去，更換完全培養(yǎng)基)，得到轉(zhuǎn)染后的實驗軟骨細胞(轉(zhuǎn)染有實驗siRNA)和陰性對照軟骨細胞(轉(zhuǎn)染有陰性對照siRNA)。

步驟3、軟骨細胞的RNA的提取

實驗中所用離心管及移液器槍頭經(jīng)高壓處理，烤干后使用；所用水經(jīng)去RNase(核糖核酸酶)處理(加入質(zhì)量濃度為0.1％DEPC處理水劇烈振搖使充分混勻，37℃反應，次日高壓除去DEPC(diethypyrocarbonate，焦炭酸二乙酯)；質(zhì)量濃度為75％的乙醇用DEPC處理后的水配制。其余參照Trizol試劑盒說明書操作，具體步驟如下：

3.1、裂解軟骨細胞：分別將培養(yǎng)的實驗軟骨細胞(轉(zhuǎn)染有實驗siRNA)和陰性對照軟骨細胞(轉(zhuǎn)染有陰性對照siRNA)置于60mm規(guī)格的培養(yǎng)皿中，并分別向培養(yǎng)皿中加入1ml的Trizol試劑，用移液器槍頭反復抽吸后，4℃下靜置20分鐘，得到核蛋白解離的軟骨細胞。

3.2、液相分離：繼續(xù)向培養(yǎng)皿中加入0.2ml氯仿，搖勻，室溫靜置18分鐘后，于4℃下以12000g的相對離心力離心15分鐘。

3.3、沉淀RNA：將3.1.2中得到的上層水相移入新管，并加入0.5ml的異丙醇，靜置15分鐘。然后于4℃下以12000g的相對離心力離心10分鐘。

3.4、棄去3.3中得到的上清液，并向沉淀中加入1ml質(zhì)量濃度為75％的乙醇，搖勻，于4℃下以10000g的相對離心力離心5分鐘。

3.5、經(jīng)3.4得到的產(chǎn)物放入通風櫥中干燥10分鐘，加入適量經(jīng)DEPC處理后的水溶解，得到提取的RNA。

3.6、RNA電泳可見5s、18s及28s的3條帶，且28s帶的亮度是18s帶的1倍，說明所提取的RNA純度較高。

3.7、紫外分光光度計定量：從所提取的RNA中吸取1μl，稀釋至100μl后，利用紫外分光光度計分別測定其在260nm的吸光度(OD260)和280nm波長處的吸光度(OD280)，進而檢測得到RNA濃度。結(jié)果顯示，OD260/OD280的比值大于1.8，這說明所提取的RNA較純，無蛋白質(zhì)和DNA殘余。將提取的RNA于80℃下保存。

步驟4、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

4.1、RT–PCR(reverse transcription-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR)反應體系1

反應體系為1，包括2μl的隨機引物、2μg的步驟3所提取的RNA、經(jīng)DEPC處理后的水補足至11μl。以上各成分在EP管中混合均勻，然后對EP管進行輕度離心，并放入70℃的水浴鍋中10分鐘。其中，隨機引物購自Promega公司，目錄號為C1181。

4.2、逆轉(zhuǎn)錄PCR反應體系2

將5μl的M-MLV 5×buffer、2μl的dNTP(10Mm)、0.5μl的RNasin(20-40u/ml)以及0.5μl的M-MLV酶混合均勻，以上各成分在EP管中混合均勻，然后對EP管進行輕度離心，并放入42℃的水浴鍋中60分鐘，70℃的水浴鍋中10min。于4℃下放置或貯放在-20℃下備用。

步驟5、Real-time PCR(實時PCR)反應

5.1、實時PCR反應體系

采用TOYOBO公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒在MX3005P型定量PCR儀上進行實時PCR反應。

15μL的總反應體系，包括1μl的cDNA模板、7.5μl的SYBR Green Real-time PCR Master Mix、引物1μl、余量為滅菌水。

其中，該引物的序列如下：

forward：5'-ACTACTGACAACGAAGGCCG-3，

reverse：5'-TTTCACTGTTGTCCCACCCC-3'。

5.2、實時PCR反應條件

94℃下變性5分鐘，然后進行變性、退火、延伸循環(huán)，條件為94℃下3分鐘變性，94℃下45秒，60℃下30秒，72℃下45秒，共40個循環(huán)，72℃下延伸8分鐘。該實時PCR反應在實時定量聚合酶鏈反應儀中進行。

5.3、計算

實時PCR反應結(jié)束后讀數(shù)，計算。用2-ΔΔCt方法分析基因表達差異。具體方法如下：測定各個樣品Ct(Cycle threshold)值，通過計算2-ΔΔCt來比較不同樣品之間特定基因的表達差異。檢測COL2、MMP-13、ADAMTS5、Aggrecan的表達，內(nèi)參為GAPDH。為了減少系統(tǒng)誤差和樣品誤差，每個樣品均設(shè)定三個平行復孔，同時做目的基因和內(nèi)參基因的PCR；此三個復孔的平均值作為該樣 品的Ct值，然后根據(jù)下面的公式計算出2-ΔΔCt。實驗至少重復三次，以平均值±標準差的形式在柱狀圖中表示實驗結(jié)果。

其中，ΔCt實驗組＝Ct實驗組基因－Ct實驗組內(nèi)參照

ΔCt對照組＝Ct對照組基因－Ct對照組內(nèi)參照

ΔΔCt＝ΔCt實驗組－ΔCt對照組

2-ΔΔCt＝2－(ΔCt實驗組－ΔCt對照組)。

實驗結(jié)果如圖1和圖2所示，由圖1可知，隨著力學刺激時間的變長，陰性對照軟骨細胞中l(wèi)ncRNA-MSR的表達逐漸升高，相應地MMP-13的表達也隨之升高，而細胞外基質(zhì)中COL2和Aggrecan的表達則隨之顯著減少。這表明了lncRNA-MSR的表達不利于軟骨組織中細胞外基質(zhì)的合成，更容易造成細胞外基質(zhì)的降解，造成骨關(guān)節(jié)炎癥狀加重。可見，本發(fā)明實施例提供的能夠抑制lncRNA-MSR表達的抑制劑對于預防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎具有重要的意義。

由圖2可知，本實施例提供的實驗軟骨細胞中，由于其轉(zhuǎn)染了本發(fā)明期望的沉默表達lncRNA-MSR的siRNA分子，有效抑制了lncRNA-MSR的表達，從而也抑制了MMP-13和ADAMTS5的表達，使其含量降低，同時相應地促進了COL2和Aggrecan的表達，使其含量升高，這更利于軟骨組織中細胞外基質(zhì)的合成并抑制該細胞外基質(zhì)的降解?？梢姡景l(fā)明實施例提供的具有上述序列的siRNA分子能夠用來預防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷等疾病。

實施例2

本實施例利用Western Blot(蛋白質(zhì)印跡法)檢測實驗軟骨細胞和陰性對照軟骨細胞中各個蛋白的表達水平，具體步驟如下：

步驟1、制備實驗軟骨細胞和陰性對照軟骨細胞，其中該實驗軟骨細胞和陰性對照軟骨細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染均與實施例1相同。

步驟2、細胞總蛋白濃度測定及Western Blot實驗，其中，將從培養(yǎng)的軟骨細胞中提取的蛋白作為蛋白樣品。通過采用PBS緩沖液沖洗軟骨細胞中的培養(yǎng)基2次，然后在六孔板中每孔加入200ul質(zhì)量濃度為2％的SDS的蛋白裂解液，即得到蛋白樣品。

2.1、細胞總蛋白濃度測定

牛血清白蛋白BSA標準品制備及蛋白樣品濃度測定參照Pierce試劑盒(BCA Protein Assay Reagent Kit)說明書，具體步驟如下：

2.1.1、取BSA標準品20ul和蛋白樣品溶液20ul(18ul PBS緩沖液+2ul蛋白樣品)加入96孔板，每個BSA標準品及蛋白樣品溶液均平行重復3孔。

2.1.2、將試劑盒中A試劑與B試劑按50:1混合，得到混合液。

2.1.3、將2.1.2中的混合液分別加入各BSA標準品及蛋白樣品溶液中，每孔200μl，混勻。

2.1.4、37℃下孵育30分鐘。

2.1.5、以酶標儀在562nm測定BSA標準品和蛋白樣品溶液的吸光度值。

2.1.6、作出標準曲線，得到蛋白樣品中的蛋白濃度，分裝凍存。

2.2、Western Blot實驗步驟

2.2.1、制膠：安裝垂直電泳板，先后灌注分離膠和濃縮膠，膠配方如表1所示：

表1

其中，以上各成分中，Tris-HCl(Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTris-HCl)為三(羥甲基)氨基甲烷；SDS(sodium dodecyl sulfate,sodium salt)是十二烷基硫酸鈉；TEMED(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)是N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

2.2.2、樣品處理：取蛋白樣品20μg(根據(jù)測出的蛋白濃度計算上樣量)，與1/4上樣量的5×上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘。

2.2.3、上樣：將樣品和蛋白預染Marker(6μl)依次加入上樣孔，每孔上樣體積均應相同，空孔以1×上樣緩沖液補齊體積。

2.2.4、電泳：在濃縮膠以穩(wěn)壓80V進行電泳，30-45分鐘，進入分離膠后保持恒壓120V，1小時，直到溴酚蘭染料前沿至膠底。

2.2.5、電轉(zhuǎn)：將凝膠移入電轉(zhuǎn)槽，使其處于陰極，PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)處于陽極，凝膠和PVDF膜的兩側(cè)分別是濾紙及海綿，夾緊之后注入電轉(zhuǎn)緩沖液，在冰上以200mA電轉(zhuǎn)2小時。

2.2.6、根據(jù)蛋白預染Marker觀察電轉(zhuǎn)是否完全。

2.2.7、封閉：將PVDF膜轉(zhuǎn)入質(zhì)量濃度5％脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時。

2.2.8、以1:1000的比例，一抗孵育PVDF膜，4℃孵育過夜或室溫3-4小時。

2.2.9、以1:2000的比例，二抗孵育PVDF膜：以TBST洗滌緩沖液洗膜，10分鐘×3次；然后加入二抗孵育，室溫1.5小時。

2.2.10、化學發(fā)光：以TBST洗滌緩沖液洗PVDF膜，10分鐘×3次；將ECL化學發(fā)光劑的A液、B液混合，滴加于PVDF膜上孵育1分鐘，然后用保鮮膜裹好，凝膠成像系統(tǒng)進行曝光或明場曝光。

結(jié)果圖3a、3b和3c所示，可見，與陰性對照軟骨細胞相比，本發(fā)明實施例提供實驗軟骨細胞中由于轉(zhuǎn)染了抑制lncRNA-MSR表達的siRNA分子，該siRNA分子能夠促進COL2的表達(參見圖3a和圖3b)，使其含量升高，同時抑制MMP-13的表達(參見圖3a和圖3c)，使其含量降低。這進一步說明了本發(fā)明實施例提供的具有如下序列的siRNA分子(其正義鏈(5'-3')5‘AUGAGGCGUGUGCCGUCAA dTdT 3‘；反義鏈(3'-5')3‘dTdTUACUCCGCACACGGCAGUU 5‘)能夠有效用于預防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎，即能用于制備預防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

實施例3

步驟1、制備實驗軟骨細胞和陰性對照軟骨細胞，其中該實驗軟骨細胞和陰性對照軟骨細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染均與實施例1相同。

步驟2、軟骨細胞骨架的免疫熒光染色

2.1、室溫(約25℃)下，將培養(yǎng)的軟骨細胞爬片(即蓋玻片)于質(zhì)量濃度為4％的多聚甲醛溶液中固定10-15分鐘。

2.2、然后利用PBS緩沖液漂洗軟骨細胞3次，每次5分鐘。

2.3、利用質(zhì)量濃度為2％的BSA溶液37℃下孵育軟骨細胞30分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點。

2.4、加入質(zhì)量濃度為2％的BSA溶液稀釋的特異性一抗(1:200稀釋)，然后于4℃下孵育過夜。

2.5、加入質(zhì)量濃度為2％的BSA溶液稀釋的熒光素標記二抗(1:200稀釋)，濕盒內(nèi)避光孵育30min。

2.6、利用PBS緩沖液漂洗軟骨細胞3次，每次5分鐘。

2.7、利用1g/ml的Hoechst 33342進行核復染色5分鐘，然后利用PBS緩沖液漂洗軟骨細胞3次，每次5分鐘。

2.8、熒光封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。

步驟3、免疫組化與免疫熒光圖片的分析方法

免疫組化與免疫熒光圖片的分析均采用Image Pro Plus 6.0軟件進行。原理是根據(jù)染色染料顏色的深淺及分布面積大小來確定目標蛋白的量。這是因為染色區(qū)域分布面積與目標蛋白量成正比。染色的顏色深淺與目標蛋白量的定量關(guān)系符合朗伯-比爾定律，是對數(shù)關(guān)系。因此，通過定量測量免疫組化與免疫熒光圖片上的光密度來確定目標蛋白的表達量。將圖片上各點的光密度值累加起來，得到IOD(Integrated option density)。此值與目標蛋白的總量成正比。IOD值除以有效目標分布區(qū)域的面積，得到平均密度(Mean density)值，此值反映了目標物質(zhì)的單位面積濃度。對樣品照片進行數(shù)字圖像分析比較時，就是比較它們之間的平均光密度值的大小。對于免疫熒光圖片分析，因為整張圖片都是待測區(qū)域，可以在照片上隨機選取數(shù)個區(qū)域，測量其光密度值。計算其平均值作為整張照片的光密度值。對于免疫組化圖片的分析，照片上很大一部分區(qū)域不是待測區(qū)域，因此我們在照片上準確選擇被染上染料的特定顏色的區(qū)域，計算這些區(qū)域的累積光密度值(IOD)，進而計算統(tǒng)計區(qū)域的平均光密度值。

具體方法如下：

(1)選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域(AOI)。

(2)測量該區(qū)域的IOD。

(3)選擇并測量有效統(tǒng)計區(qū)域的面積

(4)計算光密度平均值IOD/area(mean density)

(5)計算同一實驗組切片各照片的平均及標準差。

(6)用統(tǒng)計學方法分析各實驗組的平均mean density之間是否有顯著性差異。

實驗結(jié)果如圖4a、圖4b、圖4c和圖4d所示，可見，與陰性對照軟骨細胞相比，本發(fā)明實施例提供實驗軟骨細胞中由于轉(zhuǎn)染了抑制lncRNA-MSR表達的siRNA分子，其中所含COL2的熒光強度更強(參見圖4a和圖4c)，而MMP-13的熒光強度更低(參見圖4b和圖4d)，這說明了本發(fā)明實施例提供的抑制lncRNA-MSR表達的siRNA分子更利于軟骨組織的修復，能夠用來預防和/或治療骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病。

僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。