本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及鑒定簇毛麥3V染色體的分子標(biāo)記引物及其PCR方法。
背景技術(shù)：
一年生二倍體簇毛麥(2n＝14,VV)是小麥重要的近緣種屬，其1V-7V染色體上都攜帶多種抗性基因(De Pace C 2011)。其中，3V染色體上具有抗小麥全蝕病及眼斑病基因(De Pace C 2011)。普通小麥中國春(CS)-一年生二倍體簇毛麥3V附加系具有優(yōu)異的小麥條銹病抗性。為將簇毛麥3V染色體轉(zhuǎn)移到小麥遺傳背景中，并進一步在小麥遺傳改良中利用簇毛麥3V染色體的優(yōu)異抗性，簇毛麥3V染色體的準(zhǔn)確鑒定與追蹤成為重要工作。目前，一年生簇毛麥V基因組的特異標(biāo)記已見大量報道(Liu et al,2003；Zhang et al,2013)，而簇毛麥3V染色體的特異分子標(biāo)記還未見報道。簇毛麥V組特異只能檢測簇毛麥遺傳物質(zhì)，并不能識別這些遺傳物質(zhì)來源于哪條染色體。因此，迫切需要開發(fā)簇毛麥3V特異標(biāo)記，以使3V染色體上的優(yōu)良性狀能應(yīng)用于小麥育種中。
建立分子標(biāo)記是鑒定、追蹤小麥近緣物種遺傳物質(zhì)的最為有效的方法。因此，建立簇毛麥3V染色體特異分子標(biāo)記的主要技術(shù)為：根據(jù)麥類植物基因組共線性原理，查找前人報道的已定位于小麥第三同源群的基因及克隆該基因的引物，使用這些引物在簇毛麥中進行擴增，對在簇毛麥中擴增的片段進行克隆測序，并與小麥中的該基因相應(yīng)區(qū)域進行比對。根據(jù)比對結(jié)果，明確該序列與小麥序列的低同源區(qū)域，根據(jù)低同源區(qū)的堿基序列設(shè)計SCAR引物。通過將此SCAR引物在小麥、簇毛麥、小麥-簇毛麥附加系及部分小麥近緣物種中進行擴增，以驗證該SCAR引物對簇毛麥3V染色體的特異性。
由于基因在染色體上一般為單拷貝，因此，基于基因序列設(shè)計的引物只能檢測染色體上該基因所在的特定區(qū)域，并不能檢測染色體的全部區(qū)域。
SCAR，指特定序列擴增。SCAR標(biāo)記是將特異標(biāo)記片斷從凝膠上回收并進行克隆和測序，根據(jù)其堿基序列設(shè)計一對特異引物(18-24堿基)，可特異擴增目標(biāo)區(qū)域。
參考文獻：
De Pace C,Vaccino P,Cionini P G,Pasquini M,Bizzarri M,Qualset C O.Dasypyrum.Kole C(eds)Wild crop relatives:genomic and breeding resources[C].Springer-Verlag,Berlin,German.2011,pp:185-291
Liu SB,Tang ZH,You MS,Li BY,Song JM,Liu GT.Development and application of a genome-specific PCR marker for Haynaldia villosa.Acta Genet.Sin.2003,30,350–356.
Zhang J,Long H,Pan Zhifen,Liang JJ,Yu SY,Deng GB,Yu MQ.Characterization of a genome-specific Gypsy-like retrotransposon sequence and development of a molecular marker specific for Dasypyrum villosum(L.).Journal of Genetics.92(2):103-108
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的包括：
提供一種特異性的分子標(biāo)記引物；
提供一對針對簇毛麥3V染色體的分子標(biāo)記引物，即特異SCAR標(biāo)記引物；
提供該SCAR引物的用途，如鑒定小麥-簇毛麥異源材料中是否含有3V染色體的用途。
提供一種基于上述SCAR引物的PCR方法；以及該方法用于鑒定簇毛麥3V染色體的用途；
提供一種使用上述SCAR引物，鑒定簇毛麥3V染色體的PCR方法等。
本發(fā)明提供的簇毛麥3V染色體的分子標(biāo)記引物，又稱簇毛麥3V染色體的特異性分子標(biāo)記引物或SCAR引物；該SCAR引物由引物1和引物2組成，其中引物1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；序列表所示的核苷酸序列均從5‘端向3’端延伸。
本發(fā)明還提供了上述SCAR引物用于檢測一年生二倍體簇毛麥3v染色體的用途；如鑒定小麥-簇毛麥異源材料中是否含有3V染色體的用途。
本發(fā)明SCAR引物的一種應(yīng)用是，基于該SCAR引物的檢測簇毛麥3V染色體的PCR方法，其反應(yīng)體系包括：待檢樣品DNA、dNTPs、權(quán)利要求1所述的引物1和引物2、Taq plus聚合酶、10×PCR緩沖液、鎂離子和雙蒸水；
擴增程序包括：
步驟(1)94℃保持4分鐘；
步驟(2)94℃保持1秒；
步驟(3)58℃保持30秒；
步驟(4)72℃保持30秒；
步驟(5)重復(fù)步驟(2)至步驟(4)35個循環(huán)；
步驟(6)72℃保持10分鐘。
優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系為：待檢樣品DNA 100-150ng、dNTPs 100μM、權(quán)利要求1所述的引物1 5pmol、權(quán)利要求1所述的引物2 5pmol、Taq plus聚合酶1U、10×PCR緩沖液2.5μL、鎂離子1.5mM，加雙蒸水加至終體積25μL。
有益效果
采用本發(fā)明公開的分子標(biāo)記引物，可利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，有效區(qū)分普通小麥、黑麥、簇毛麥1-2V、4-7V與簇毛麥的3V染色體。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可用于在分子標(biāo)記輔助選擇育種過程中，快速、有效地追蹤簇毛麥的3V染色體，有利于加快簇毛麥3V染色體上所攜帶的優(yōu)良性狀向受體品種的轉(zhuǎn)移與利用，加速育種進程，提高新品質(zhì)選育的效率。
附圖說明
圖1.基于簇毛麥3V染色體特異SCAR標(biāo)記引物TaGS5-C-1的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖
圖中，箭頭所指部分為特異的目標(biāo)片段；
M.marker(Trans2k)；
1.簇毛麥；
2中國春-簇毛麥1V附加系；
3.中國春-簇毛麥2V附加系
4.中國春-簇毛麥3V附加系
5.中國春-簇毛麥4V附加系
6.中國春-簇毛麥5V附加系
7.中國春-簇毛麥6V附加系
8.中國春-簇毛麥7V附加系
9.中國春；
10.小麥品種川麥49；
11.小麥品種川麥50；
12.小麥品種川麥60；
13.荊州黑麥
具體實施方式
實施例一、簇毛麥3V染色體特異SCAR標(biāo)記引物的合成
簇毛麥3V染色體特異SCAR標(biāo)記引物TaGS5-C-1，由以下兩條引物組成：F:5′-AGTTCCGAATCAAAACATAGTC-3′，即引物1,，如序列表SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示；
R:5′-AAATCACAATCCTTCTTTATGC-3′，即引物2，如序列表SEQ ID NO.2的核苷酸序列所示。
可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法合成，或由引物合成公司合成。
實施例二、檢測簇毛麥3V染色體的PCR方法
檢測簇毛麥3V染色體的方法包括如下步驟：
(1)、采用CTAB法提取待檢測植株基因組DNA，提取步驟如下：
1)取2g新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細粉后加預(yù)熱至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)15ml，混勻。
2)65℃水浴30-45min，其間輕搖混勻。冷卻至室溫后加等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕混勻至上清液呈牛奶狀，4000rpm離心10min。
3)取上清液，加等體積異丙醇，置于冰浴沉淀DNA。
4)勾出DNA，用70％酒精洗2次，無水乙醇洗一次氣干DNA，溶于適量pH 8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至終濃度100μg/μl。
5)100V恒定電壓下，1％瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，檢測DNA濃度及質(zhì)量。
(2)、PCR擴增：
反應(yīng)體系如下：
PCR反應(yīng)在PTC-200型PCR儀(MJ Research,U.S.A.)中進行。引物TaGS5-C-1擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分離，100V恒定電壓電泳40分鐘后，EB染色檢測。結(jié)果如圖1所示。由圖可知，簇毛麥和小麥-簇毛麥3V附加系中能擴增出750bp的特異片段，而在普通小麥、小麥-簇毛麥1V、2V、4V-7V附加系及黑麥中則不能擴增出該片段。