本發(fā)明屬于生物體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液。本發(fā)明還涉及該固定液的制備和固定方法。
背景技術(shù)：
高質(zhì)量總DNA提取是研究DNA分子在生命代謝的基礎(chǔ)，提取魚卵或仔魚DNA是在魚類產(chǎn)卵季節(jié)，捕獲魚卵或仔魚之后常用的分子生物學(xué)試驗(yàn)。魚卵和仔魚樣本的固定保存是高質(zhì)量DNA提取的保證之一。DNA是屬于堿穩(wěn)定性的物質(zhì)，基本組成成分中的堿基，是DNA所特有的，魚卵或仔魚處在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育初期階段，DNA含量較少，若固定保存方法不當(dāng)，會(huì)很難提取到DNA。常規(guī)保存魚卵或仔魚的方法使用固定液為無水乙醇，需要冷藏保存，保藏條件要求高。無水乙醇呈若酸性，在酸性條件下，DNA的 嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵不穩(wěn)定，當(dāng)在冷藏措施不足時(shí)，例如樣本長(zhǎng)期置常溫下保存時(shí)，容易被水解，很難提取高質(zhì)量DNA，不利于長(zhǎng)期保存。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種便于提取魚卵或仔魚DNA在室內(nèi)常溫保存一年以上的固定液。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題，
一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液，其特征在于，
包括無水乙醇和可溶性強(qiáng)堿溶液；
各組份的體積份數(shù)的組成為：
無水乙醇450-500份；
可溶性強(qiáng)堿溶液3-5份。
為了獲得更好的技術(shù)效果，各組份的體積份數(shù)的組成為：乙醇500份、可溶性強(qiáng)堿溶液3~4份；
為了獲得更好的技術(shù)效果，所述無水乙醇的質(zhì)量濃度不低于99.5%；
為了獲得更好的技術(shù)效果，所述可溶性強(qiáng)堿溶液的質(zhì)量濃度為1~3%；
為了獲得更好的技術(shù)效果，所述可溶性強(qiáng)堿溶液為氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液之一或二者組合；
為了獲得更好的技術(shù)效果，所述固定液pH值為7.5-8.0。
本發(fā)明還提供該固定液的制備方法和固定方法，
一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液的制備方法，其步驟為，
（1）配制質(zhì)量濃度1-3%的可溶性強(qiáng)堿溶液10ml；
（2）準(zhǔn)備無水乙醇500ml；
（3）取配制好的質(zhì)量濃度1-3%可溶性強(qiáng)堿溶液3~5ml加入到450-500ml的無水乙醇中，攪拌均勻，得到混合液；
（4）將上述混合液密封，靜置15分鐘，得到便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液。
一種便于提取單個(gè)魚卵或仔魚DNA的固定液的固定方法，其步驟為，
（1）用小鑷子或常規(guī)滴管將單個(gè)魚卵或仔魚放入5ml的EP管中；
（2）換一根干凈無水的常規(guī)滴管吸取已經(jīng)配制完畢的上述固定液；
（3）用常規(guī)滴管取上述固定液4ml，加入含有上述魚卵或仔魚的EP管中，將魚卵或魚苗完全覆蓋；
（4）用封口膜將上述已經(jīng)固定完畢的EP管密封；
（5）將上述已經(jīng)密封完畢的樣本靜置24小時(shí)；
（6）更換一次上述已經(jīng)靜置完畢EP管中的上述固定液；
（7）再次用封口膜將上述EP管密封，放常溫下保存。
本發(fā)明提供一種固定液用于保存魚卵或仔魚，尤其是適合保存單個(gè)魚卵。使用本發(fā)明固定液在室內(nèi)常溫保存時(shí)間達(dá)一年后，采取常規(guī)提取單個(gè)魚卵或仔魚DNA方法時(shí)，仍可提取到DNA。在長(zhǎng)期野外采樣過程，沒有冷藏措施情況下，本發(fā)明解決了采取常規(guī)總DNA提取方法在魚卵或仔魚等基因組DNA含量較少樣品，樣本無法長(zhǎng)期保存的問題。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1
一種便于提取魚卵或仔魚DNA的固定液，
包括無水乙醇和氫氧化鈉溶液；所述無水乙醇的質(zhì)量濃度99.5%以上；所述氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為3%；
各組份的體積份數(shù)的組成為：
無水乙醇500份；
氫氧化鈉溶液3份；
所述固定液pH值為7.5-8.0。
作為優(yōu)選方案之一，各組份的體積份數(shù)的組成為：乙醇450份、氫氧化鉀溶液5份；所述氫氧化鉀溶液的質(zhì)量濃度為1%；
作為優(yōu)選方案之一，各組份的體積份數(shù)的組成為：乙醇475份、氫氧化鈉和氫氧化鉀混合溶液4份；所述氫氧化鉀溶液的質(zhì)量濃度為1.5%；所述氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為1.5%；所述氫氧化鉀溶液和所述氫氧化鈉溶液按質(zhì)量比1:1混合。
實(shí)施例2
一種便于提取魚卵或仔魚DNA固定液的制備方法，其步驟為，
（1）配制質(zhì)量濃度2%的氫氧化鈉溶液10ml；
（2）準(zhǔn)備質(zhì)量濃度99.5%以上的無水乙醇500ml；
（3）取配制好的質(zhì)量濃度2%的氫氧化鈉溶液3~5ml加入到無水乙醇中，攪拌均勻，得到混合液；
（4）將上述混合液密封，靜置15分鐘，得到本發(fā)明實(shí)施例1所述便于提取單個(gè)魚卵或仔魚DNA的固定液。
實(shí)施例3
一種便于提取魚卵或仔魚DNA固定液的固定方法，其步驟為，
（1）用小鑷子或常規(guī)滴管將單個(gè)草魚魚卵放入5ml的EP管中；
（2）換一根干凈無水的常規(guī)滴管吸取已經(jīng)配制完備的固定液；
（3）用常規(guī)滴管固定液將加入上述含有單個(gè)草魚魚卵的EP管中；
（4）用封口膜將上述已經(jīng)固定完畢的EP管密封；
（5）將上述已經(jīng)密封完畢的樣本靜置24小時(shí)；
（6）更換一次上述已經(jīng)靜置完畢EP管中的固定液；
（7）再次用封口膜將上述EP管密封，放常溫下保存。
實(shí)施例4
將本發(fā)明方法（試驗(yàn)組1）與現(xiàn)有的兩種不同固定方法（對(duì)比組1、對(duì)比組2）做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，選同一批次魚卵分別用3種不同的方法進(jìn)行固定保存，固定時(shí)間依次為0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月時(shí)，取不同固定方法的魚卵提取魚卵總DNA并電泳檢測(cè)DNA提取效果，方法如下：沖洗去除固定液后，加入DNA提取緩沖液和細(xì)胞裂解緩沖液，將單個(gè)魚卵或仔魚剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，溫育消化。用高濃度NaCl溶液沉淀蛋白質(zhì)，加入異丙醇沉淀DNA，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌沉淀去除鹽離子，12000r/min離心5min，棄去上清，敞蓋待乙醇揮發(fā)后加入超純水或TE溶液溶解。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)比較魚卵總DNA效果，結(jié)果見表1，百分比數(shù)字表示DNA電泳檢出率。
實(shí)驗(yàn)說明：試驗(yàn)組1用本發(fā)明固定液按實(shí)施例3所述方法處理固定，放室溫（20℃）下保存；對(duì)比組1用無水乙醇替換本發(fā)明固定液按實(shí)施例3所述方法處理固定單個(gè)魚卵或仔魚后，放入-20℃環(huán)境中冷藏保存；對(duì)比組2用無水乙醇替換本發(fā)明固定液按實(shí)施例3所述方法處理固定單個(gè)魚卵或仔魚后，放入室溫（20℃）下保存。
。
實(shí)施例5
將本發(fā)明方法（試驗(yàn)組2）與現(xiàn)有固定方法（對(duì)比組3）做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，模擬同樣在高溫下保存效果，選同一批次魚卵分別用2種不同的方法固定保存，然后同時(shí)放入溫度為35℃的烘箱下保存15天，依次在保存時(shí)間為1天、3天、7天、10天、15天分別提取魚卵總DNA并電泳檢測(cè)DNA提取效果，方法如下：沖洗去除固定液后，加入DNA提取緩沖液和細(xì)胞裂解緩沖液，將魚卵或仔魚剪碎后再加入蛋白酶K和RNA酶，溫育消化。用高濃度NaCl溶液沉淀蛋白質(zhì)，加入異丙醇沉淀DNA，用70%乙醇洗滌沉淀去除鹽離子，12000 r/min離心5min，棄去上清，敞蓋待乙醇揮發(fā)后加入超純水或TE溶液溶解。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)比較魚卵總DNA效果，結(jié)果見表2，百分比數(shù)字表示DNA電泳檢出率。
實(shí)驗(yàn)說明：試驗(yàn)組2用本發(fā)明固定液按實(shí)施例3所述方法處理固定，放入溫度為35℃的烘箱下保存15天；對(duì)比組3用無水乙醇替換本發(fā)明固定液按實(shí)施例3所述方法處理固定單個(gè)魚卵或仔魚后，放入溫度為35℃的烘箱下保存15天。
。
此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實(shí)施例，其配比、工藝所取名稱等可以不同。凡依本發(fā)明專利構(gòu)思所述的構(gòu)造、特征及原理所做的等效或簡(jiǎn)單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結(jié)構(gòu)或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
雖然本發(fā)明已以實(shí)施例公開如上，但并非用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，任何熟悉該項(xiàng)技術(shù)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)所作的更動(dòng)與潤(rùn)飾，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。