本發(fā)明涉及與尿酸水平異常相關的病癥治療的新型化合物及其可藥用鹽、其制備方法和含有該化合物的藥物組合物，以及其作為urat1抑制劑用于治療痛風、治療高尿酸血癥和降低血清尿酸等用途。
背景技術：
痛風(gout)是人體內長期嘌吟代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所引起的一組異質性、代謝性疾病，分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥(hyperuricemia)和尿酸鹽結晶沉積，導致反復發(fā)作的關節(jié)炎、痛風性腎病、痛風凝結物沉積、尿酸性泌尿系統(tǒng)凝結物生成等(醫(yī)藥導報.2006,25(8):803-806)。高尿酸血癥是血清中尿酸含量超過正常值，一般男性超過417μmol/l(7.0mg/dl)，女性超過357μmol/l(6.0mg/dl)。當血尿酸濃度過飽和，就有尿酸單鈉鹽結晶產生，沉積在滑膜液、外周關節(jié)的軟骨，耳朵的耳廓和手肘的鷹嘴囊等處(thececiltextbookofmedicine.23rded.2008:2069-2075.；lancet.2010,375(9711):318-328.；conn’scurrenttherapy2010,1sted.2008:588-591.)，出現(xiàn)此類癥狀，可診斷為痛風。
痛風與高尿酸血癥的發(fā)生不僅受年齡、性別、地域、種族、遺傳、環(huán)境等因素影響，還與其它代謝綜合征(metabolicsyndrome)如肥胖、高血壓、高血脂、冠心病、胰島素抵抗及糖尿病密切相關(circj2005,69(8):928-933.；metabolism.2008,57(1)71-76.；curropinrheumatol.2005,17(3):341-345.)。研究表明，高尿酸血癥和高血壓作為代謝綜合征的主要成因，存在相互影響機制，可加劇心血管病的危險系數(koreanjgastroenterol,2008,49(3)：173-176.)。同時，也有文獻報道，二型糖尿病患者的血尿酸水平明顯高于正常人群，高尿酸血癥對二型糖尿病患者糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展起到了加速作用(eurjclininvest,2001,31(4):318-321.)。近年來，多項危險因素干預試驗也表明，高尿酸血癥是心肌梗死的一項獨立危險因素(bmcpublichealth,2011,11:832.)。因此，痛風、高尿酸血癥與糖尿病一樣，是危害人類健康的一種嚴重的代謝疾病。
隨著中國近30年來社會經濟的發(fā)展和生活方式的改變，中國痛風發(fā)病率直線上升， 2009年上海地區(qū)高尿酸血癥患病率為10.0％；北京市1120例受試者高尿酸血癥患病率為17.86％；廣州地區(qū)患病率居全國首位，男性27.9％，女性12.4％，總患病率高達21.81％。西方發(fā)達國家痛風患病率也較高，其中美國大約有610萬人罹患痛風(partii.arthritisrheum.2008,58(1):26-35.)。
尿酸在腎臟的轉運可直接調控血尿酸水平的高低，大約有85％的痛風是由于尿酸排泄減少所致(curropinnephrolhypertens,2009,18(5):428-432.)。生理學和藥理學的研究定義腎臟尿酸轉運的經典模式為：腎小球的濾過，腎小管的重吸收，腎小管的分泌，分泌后的重吸收，尤其是腎小管重吸收是影響尿酸排泄的最重要因素。目前已證實參與尿酸重吸收的蛋白有：產電的尿酸鹽單向運輸體(uat)，有機陰離子轉運體oat1和oat3，尿酸鹽陰離子轉運體(urateaniontransporter1，urat1)。urat1負責尿酸通過近曲小管刷狀緣毛膜一側轉運入上皮細胞內，是人體內主要的尿酸重吸收轉運蛋白，在近曲小管上皮細胞特異性的表達，不受膜電壓和細胞內外ph值的影響，為電中性尿酸鹽交換體，呈時間依賴性，有飽和現(xiàn)象(nature.2002,417(6887):447-452.)。尿酸在近端腎小管的重吸收大部分依靠urat1完成(arthritisandrheumatism,1975,18(6):805-809.)。urat1是有機陰離子轉運體(oat)超家族成員，是由slc22a12基因編碼，由10個內含子9個外顯子組成，擁有12個跨膜結構域，其cdna全長2642bp，編碼區(qū)1659bp，存在多種突變，易引起尿酸代謝異常，一項meta分析表明slc22a12基因對血尿酸水平有0.13％的變量貢獻。(jclininvest,2010,120(6):1791-1799.)。亦有研究發(fā)現(xiàn)，腎性低尿酸血癥患者攜帶的slc22a12基因發(fā)生突變，喪失編碼urat1成熟蛋白的能力，提示urat1對腎臟的尿酸重吸收功能具有重要意義。taniguchi等發(fā)現(xiàn)scl22a12基因的g774a突變是痛風發(fā)生的抑制因子，雜合子g774a突變的患者血清尿酸水平明顯比健康人低(arthritisrheum.2005；52(8):2576-2577.)。guan等在124名原發(fā)性痛風患者和168名健康中國男性受試者中，研究slc22a12中基因序列sr893006的多態(tài)性，提示該基因序列的多態(tài)性可能是中國男性高尿酸血癥患者的基因風險因素(scandjrheumatol.2009；38(4):276-81.)。因此，urat1將仍是今后開發(fā)治療痛風和高尿酸血癥藥物的主要靶點之一。
目前市場上用于治療痛風的促尿酸排泄藥有苯溴馬隆(benzbromarone)、丙磺舒(probenecid)、磺吡酮(sulfinpyrazone)、lesinurad等。苯溴馬隆為目前最常用的治療高尿酸血癥和痛風藥物，主要通過抑制urat1對于尿酸的重吸收而起到促尿酸排泄作用，為典型促尿酸排泄藥。相比苯溴馬隆，丙磺舒和磺吡酮對促尿酸排泄治療痛風的療效甚差。苯溴馬隆是苯并呋喃衍生物，上世紀60年代由法國labaz公司開發(fā)，于1971年在德國上 市，曾廣泛用于痛風和高血尿酸癥的治療。但苯溴馬隆存在嚴重的肝損害等副作用，2003年國際上報道該藥可引起爆發(fā)性肝炎的危險后，陸續(xù)在一些國家撤市(醫(yī)藥導報,2006,25(8):803)。
美國fda于2015年12月批準了阿斯利康公司開發(fā)的zurampic(lesinurad)用于治療痛風，該藥為目前最新進入臨床使用的urat1抑制劑。阿斯利康公司同時開發(fā)了lesinurad與別嘌呤醇的復方制劑，也已進入三期臨床研究。lesinurad為口服固體制劑，該藥可與黃嘌呤氧化酶抑制劑聯(lián)用，用于治療與痛風相關高尿酸血癥。但lesinurad存在許多不良反應：當它與黃嘌呤氧化酶抑制劑合用時常見頭痛，流感，血肌酐增加和胃食管反流??；當在400mg劑量時常出現(xiàn)腎功能相關的不良反應，也可導致嚴重心血管不良反應。同時，lesinurad為細胞色素cyp2c9的中度抑制劑，也是敏感cyp3a底物，對嚴重肝損傷患者不建議使用。
目前阿斯利康公司開發(fā)的rdea-3170已在二期臨床，部分公開的uratl抑制劑專利包括wo2005121112,wo2011159839,wo2007086504,wo2008062740,wo2009070740,wo2011085009,wo2014017643,wo2014183555,wo2014077285等。
為了更好地滿足市場需求，我們希望研發(fā)出新的高效、低毒的urat1抑制劑。本發(fā)明將提供一種新型結構urat1抑制劑，并發(fā)現(xiàn)該類化合物具有良好的urat1抑制活性，期待該新型urat1抑制劑可用于治療痛風、高尿酸血癥和相關腎病，以及降低血尿酸濃度。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術的基礎上，提供一類新型的urat1抑制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述urat1抑制劑在醫(yī)藥方面的用途。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到：
一類式(i)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體及其混合物形式，及其藥學上可接受的鹽，
其中，
y或z分別獨立地為n或ch，
r1或r2分別獨立地選自h、d、鹵素、氰基、羥基、羧基、c1-4烷基、取代的c1-4烷基、c3-4環(huán)烷基、c1-4烷氧基、取代的c1-4烷氧基、苯基、取代的苯基、雜芳基或取代的雜芳基，其取代基選自鹵素、氰基、羥基、氨基、c1-2烷基、c1-2鹵代烷基、c1-2烷氧基或c1-2鹵代烷氧基，
r3或r4分別獨立地選自h或c1-3烷基，或者r3和r4共同構成3-6元環(huán)烷基，
r5為h、c1-4烷基或取代的c1-4烷基，其取代基選自c1-2烷氧基、羥基或氨基。
在另一種優(yōu)選方案中，化合物選自式(ii)、式(iii)或式(iv)所示的化合物，
在一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r1或r2分別獨立地選自h、d、鹵素、氰基、羥基、羧基、c1-3烷基、取代的c1-3烷基、c3-4環(huán)烷基、c1-3烷氧基、取代的c1-3烷氧基、苯基、取代的苯基、噻吩基、取代的噻吩基、呋喃基、取代的呋喃基、噻唑基或取代的噻唑基，所述的取代基分別獨立地選自鹵素、氰基、氨基、羥基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、二氟甲氧基或三氟甲氧基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r1或r2分別獨立地選自h、d、鹵素、氰基、羥基、羧基、c1-3烷基、c1-3烷氧基、c1-3氟代烷基、c1-3氟代烷氧基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r3或r4分別獨立地選自h、甲基、乙基、正丙基或異丙基，或者r3和r4共同構成3-5元環(huán)烷基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物中，r5為h或c1-3烷基。
在另一種方案中，本發(fā)明的各化合物可選自：
2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸，
2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸甲酯，
2-[(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸，
2-[(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸甲酯，
2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸，
2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸甲酯，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)巰基-2-甲基丙酸，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)巰基-2-甲基丙酸甲酯，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸，
2-(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸甲酯，
2-甲基-2-{(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基}丙酸，
2-甲基-2-{(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基}丙酸甲酯，
7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸，
7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸甲酯，
2-甲基-2-{{5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基}巰基}丙酸，
2-甲基-2-{{5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基}巰基}丙酸甲酯，
2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸，
2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸甲酯，
1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸，
1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸乙酯。
本發(fā)明還提供一種制備通式(i)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體及其混合物形式，及其可藥用鹽的方法，該方法包括：
通式(ia)化合物與通式(ib)化合物進行取代反應，任選進一步在堿性條件下進行水解反應得到通式(i)化合物；其中：x1為離去基團或sh，所述的離去基團為鹵素、 oms(甲磺酰氧基)、ots(對甲苯磺酰氧基)或otf(三氟甲磺酰氧基)，優(yōu)選鹵素；x2為鹵素、oms、ots或sh；當x1為離去基團，x2為sh；當x1為sh，x2為鹵素、oms、ots。其它基團的定義如權利要求及發(fā)明內容中通式(i)所述。
除非另外說明，在說明書和權利要求中使用的以下術語具有下面討論的含義：
“烷基”用于表示飽和烴基，c1-4烷基是指含有1～4個碳原子的飽和烴基，其包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和新丁基。本發(fā)明中的烷基優(yōu)選為c1-4烷基，進一步優(yōu)選c1-3烷基。取代烷基是指具有一個或大于一個取代基的烷基，當取代基的數目為2個以上(包含2個)時，各取代基可以相同，也可以不同。取代的c1-4烷基是指具有一個或多個(2個或2個以上)取代基的含有1～4個碳原子的飽和烴基；例如“氟代甲基”是指具有一個、兩個或三個氟取代基的甲基，“氟代乙基”是指具有1～5個氟取代基的乙基。
“環(huán)烷基”表示全部為碳的單環(huán)或稠合的環(huán)(“稠合”環(huán)意味著系統(tǒng)中的每個環(huán)與系統(tǒng)中的其它環(huán)共享毗鄰的一對碳原子)基團，其中一個或多個環(huán)不具有完全連接的π電子系統(tǒng)，環(huán)烷基的實例(不局限于)為環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)戊烯、環(huán)己烷、金剛烷、環(huán)己二烯、環(huán)庚烷和環(huán)庚三烯。環(huán)烷基可為取代的和未取代的。當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個各自選自以下的基團，包括：烷基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、羥基、烷氧基、芳氧基、巰基、烷巰基、芳巰基、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、c‐羧基、o‐羧基、o‐氨基甲?；‐氨基甲?；琧‐酰氨基、n‐酰氨基、硝基、氨基和‐nr10r11，其中r10和r11定義同上。
“雜芳基”表示5至12個環(huán)原子的單環(huán)或稠合環(huán)基團，含有一個、兩個、三個或四個選自n、o或s的環(huán)雜原子，其余環(huán)原子是c，另外具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。未取代的雜芳基地非限制性實例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、喹啉、異喹啉、嘌呤、四唑、三嗪和咔唑。雜芳基可以是取代的或未取代的。當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個，更為優(yōu)選為一個、兩個或三個，進而更為優(yōu)選一個或兩個，獨立地選自以下基團，包括：低級烷基、三鹵烷基、鹵素、羥基、低級烷氧基、巰基、(低級烷基)硫基、氰基、酰基、硫代酰基、o‐氨基甲?；?、n‐氨基甲酰基、o‐硫代氨基甲酰基、n‐硫代氨基甲酰基、c‐酰氨基、n‐酰氨基、硝基、n‐磺酰氨基、s‐磺酰氨基、r10s(o)‐、r10s(o)2‐、‐c(o)or10、r10c(o)o‐和‐nr10r11，其中r10和r11定義同上。優(yōu)選的雜芳基可選地被一個或兩個取代基取代，取代基獨立地選自鹵素、低級烷基、三鹵烷基、羥基、巰基、氰基、n‐酰氨基、單或二烷基胺基、羧基或n‐磺酰氨基。
“鹵代c1-4烷基”是指具有一個或多個(即2個或2個以上)鹵素取代基的含有1～4個碳原子的飽和烴基，其中各鹵素取代基可以相同，也可以不同?！胺鷆1-3烷氧基”是指具有一個或多個(即2個或2個以上)氟取代基的含有1～3個碳原子的飽和烴基。本發(fā)明中的鹵代c1-4烷基包括但不限于鹵代甲基、鹵代乙基、鹵代正丙基、鹵代異丙基、鹵代正丁基、鹵代異丁基、鹵代新丁基等，更具體的基團包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、一氟甲基、三氯甲基、二氯甲基、一氯甲基、四氟乙基、三氟乙基、二氟乙基、一氟乙基、三氯乙基、二氯乙基、一氯乙基等。
“鹵素”包括氟(f)、氯(cl)、溴(br)和碘(i)。
“烷氧基”是指“-o-烷基”基團，其碳原子數一般為1～10個。c1-4烷氧基是指該烷氧基中含有1～4個碳原子。本發(fā)明中的烷氧基優(yōu)選為c1-4烷氧基，進一步優(yōu)選c1-3烷氧基。取代烷氧基是指具有一個或大于一個取代基的烷氧基，當取代基的數目為2個以上(包含2個)時，各取代基可以相同，也可以不同。取代的c1-4烷氧基是指具有一個或多個(即2個或2個以上)取代基的含有1～4個碳原子的烷氧基。本發(fā)明中的烷氧基包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基和新丁氧基等。
“羥基”是指“-oh”基團。
“d”是指氫的同類位氘。
“氰基”是指-cn基團。
“羧基”是指-cooh基團。
“藥學上可接受的鹽”表示保留母體化合物的生物有效性和性質的那些鹽。這類鹽包括：
(1)與酸成鹽，通過母體化合物的游離堿與無機酸或有機酸的反應而得，無機酸例如(但不限于)鹽酸、氫溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亞硫酸和高氯酸等，有機酸例如(但不限于)乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(d)或(l)蘋果酸、富馬酸、馬來酸、羥基苯甲酸、γ-羥基丁酸、甲氧基苯甲酸、鄰苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等，優(yōu)選鹽酸或(l)蘋果酸。
(2)存在于母體化合物中的酸性質子被金屬離子代替或者與有機堿配位化合所生成的鹽，金屬離子例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子，有機堿例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等。
本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其以本發(fā)明所述的化合物或其藥學上可接受的鹽為活 性成分或主要活性成分，輔以藥學上可接受的輔料。
本發(fā)明所涉及的各化合物或其藥學上可接受的鹽可應用于制備促尿酸排泄藥物方面，特別是應用于制備治療或預防高尿酸血癥或痛風藥物方面。
具體實施方式
給出下列制備實施例和生物學實施例，使本領域技術人員能夠更清楚地理解和實施本發(fā)明。它們不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍，僅僅是其例證和代表。
實施例1：2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(6)的合成
步驟a：將溴代異丁酸甲酯(7.0g，38.7mmol)和硫代乙酸鉀(4.83g，42.3mmol)的混合物在丙酮(36ml)中回流下攪拌2小時。冷卻后減壓蒸除溶劑，然后用二氯甲烷(70ml×3)提取，合并的二氯甲烷溶液依次用水(40ml)和飽和食鹽水(30ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，得2-乙酰巰基-2-甲基丙酸甲酯(1)(7.3g)，該化合物不經純化直接用于下一步反應。
步驟b：將氫氧化鉀(8.98g，160mmol)溶解于甲醇(90ml)，然后在冰水浴下加入化合物1的粗品(7.3g)，所得混合物在0～10℃攪拌過夜。加入適量水，用2m鹽酸調節(jié)ph值至3～4。用二氯甲烷(60ml×3)萃取，合并的有機相依次用水(50ml×3)和飽和食鹽水(30ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。常溫下減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，二氯甲烷:石油醚＝1:50洗脫)，得巰基異丁酸甲酯(2)(3.12g)。 步驟a和b兩步反應總收率為60.0％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ3.74(s，3h)，1.60(s，6h)。ms(ei，m/z)：133.0[m-h]-。
步驟c：在冰水浴下，將溴(4.31g，27.0mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液滴加到2-氨基-6-(三氟甲基)吡啶(4.37g，27.0mmol)的二氯甲烷(70ml)溶液中，所得混合物在室溫下攪拌過夜。加入飽和碳酸氫鈉水溶液(40ml)，分層，收集有機層。水層用二氯甲烷(70ml)萃取，合并的有機層依次用和飽和硫代硫酸鈉水溶液(20ml)和飽和食鹽水(20ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:50～1:30洗脫)，得3-溴-6-(三氟甲基)吡啶-2-胺(3)(2.79g)。收率為42.9％。1hnmr(cdcl3，300mhz)δ7.79(d，j＝9.0hz，1h)，6.90(d，j＝9.0hz，1h)，5.22(s，2h)。
步驟d：將含有化合物3(2.77g，11.5mmol)、40％氯乙醛水溶液(6.77g，34.5mmol)、碳酸氫鈉(966mg，11.5mmol)和乙醇(25ml)的混合物在110℃下封管攪拌過夜。稍微冷卻后，再加入40％氯乙醛水溶液(6.77g，34.5mmol)和碳酸氫鈉(966mg，11.5mmol)，然后在110℃繼續(xù)攪拌過夜。冷卻后減壓蒸除大部分溶劑，加入適量水，用乙酸乙酯(40ml×4)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:50～1:30洗脫)，得8-溴-5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶(4)(2.0g)。收率為65.6％。1hnmr(dmso-d6，500mhz)δ8.21(d，j＝1.0hz，1h)，7.91(s，1h)，7.81(d，j＝7.5hz，1h)，7.51(d，j＝7.5hz，1h)。ms(ei，m/z)：265.0[m+h]+。
步驟e：向三口燒瓶a中依次加入二氧六環(huán)(6ml)、化合物4(100mg，0.377mmol)、pd2(dba)3(17.3mg，0.0189mmol)和4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲氧基雜蒽(xantphos)(22mg，0.0380mmol)，所得混合物在氮氣下攪拌40分鐘。向另一個三口燒瓶b中加入二氧六環(huán)(4ml)、化合物2(100mg，0.745mmol)和二異丙基乙基胺(98mg，0.758mmol)，該混合液在氮氣下攪拌20分鐘，然后通過注射器將三口燒瓶a中混合物轉移到上述三口燒瓶b中。所得混合物在回流下攪拌過夜。冷卻到室溫，加入水(30ml)，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(20ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:50～1:25洗脫)，得2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸甲酯(5)(54mg)。收率為45.0％。ms(ei，m/z)：341.0[m+na]+。
步驟f：將含有化合物5(54mg，0.170mmol)、thf(1ml)、甲醇(2ml)、水(2ml)和氫氧化鈉(21mg，0.525mmol)的混合物在室溫下攪拌過夜。加入水(10ml)，用甲基叔丁基醚(mtbe)(10ml×2)洗滌，收集水相。水相用稀鹽酸調節(jié)ph值至3～4，然后用乙酸乙酯(15ml×2)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，所得產物用石油醚/乙酸乙酯重結晶，得2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(6)(18mg)。收率為34.8％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ12.96(s，1h)，8.06(s，1h)，7.78(s，1h)，7.57(d，j＝7.5hz，1h)，7.29(d，j＝7.5hz，1h)，1.62(s，6h)。ms(ei，m/z)：305.1[m+h]+。
實施例2：2-[(6-氟咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸(10)的合成
以2-氨基-5-氟吡啶為原料，制備化合物10的實驗操作依次參見實施例1中的步驟c、d、e和f。
化合物8：1hnmr(cdcl3，500mhz)δ8.10-8.09(m，1h)，7.43(s，1h)，7.69(s，1h)，7.45-7.43(m，1h)。
化合物10：1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ9.22(s，1h)，8.35(s，1h)，8.12(s，1h)，8.01(s，1h)，1.52(s，6h)。ms(ei，m/z)：255.0.0[m+h]+。
實施例3：2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基-2-甲基丙酸(14)的合成
步驟a：在冰水浴下，將溴(5.25g，32.9mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液滴加到6-氨基吡啶甲酸甲酯(5.0g，32.9mmol)的二氯甲烷(70ml)溶液中，所得混合物在室溫下攪拌過夜。加入飽和碳酸氫鈉水溶液(40ml)，分層，收集有機層。水層用二氯甲烷(70ml)萃取，合并的有機層依次用和飽和硫代硫酸鈉水溶液(20ml)和飽和食鹽水(20ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20～1:5洗脫)，得6-氨基-5-溴吡啶甲酸甲酯(11)(1.83g)。收率為24.1％。1hnmr(cdcl3，500mhz)δ7.78(d，j＝8.0hz，1h)，7.36(d，j＝8.0hz，1h)，3.96(s，3h)。
步驟b：將含有化合物11(1.83g，7.92mmol)、40％氯乙醛水溶液(4.76g，23.7mmol)、二氧六環(huán)(16ml)、碳酸氫鈉(670mg，7.98mmol)和水(4ml)的混合物在90℃封管攪拌過夜。稍微冷卻后，再加入40％氯乙醛水溶液(2.38g，12.1mmol)，然后在90℃封管繼續(xù)攪拌過夜。冷卻后減壓蒸除大部分溶劑，加入水(20ml)，用飽和碳酸氫鈉溶液調節(jié)ph值到7～8。用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20～1:15洗脫)，得8-溴咪唑并[1,2-a]吡啶-5-甲酸甲酯(12)(1.24g)。收率為61.4％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ8.85(s，1h)，7.84(s，1h)，7.77-7.68(m，2h)，3.97(s，3h)。
步驟c：將含有化合物12(100mg，0.392mmol)、水合硫化鈉(122mg，0.508mmol)和dmf(4ml)的混合物在70℃攪拌1小時，稍微冷卻后，加入溴代異丁酸甲酯(284mg，1.57mmol)和碳酸鉀(81mg，0.587mmol)，所得混合物在60℃攪拌過夜。加入水(20ml)，用乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(15ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油 醚＝1:20～1:10洗脫)，得8-[(1-甲氧基-2-甲基-1-丙酰-2-基)巰基]咪唑并[1,2-a]吡啶-5-甲酸甲酯(13)(34mg)。收率為28.1％。1hnmr(cdcl3，500mhz)δ8.84(s，1h)，7.78(s，1h)，7.73(d，j＝7.5hz，1h)，7.27(d，j＝7.5hz，1h)，4.01(s，3h)，3.71(s，3h)，1.69(s，6h)。
步驟d：將化合物13(32mg，0.104mmol)溶解在thf(1ml)和甲醇(2ml)中，加入2m氫氧化鈉溶液(3ml)，所得混合物在40℃攪拌1小時。在40℃減壓蒸除約一半溶劑，加入水(20ml)，用mtbe(10ml×2)洗滌，收集水相。水相用稀鹽酸調節(jié)ph值至5～6，減壓蒸除溶劑，所得產物用二氯甲烷/甲醇＝5/1(15ml×4)提取，合并的溶液用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，得2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基巰基)-2-甲基丙酸(14)。1hnmr(dmso-d6，500mhz)δ9.08(s，1h)，7.52-7.50(m，1h)，7.39-7.38(m，2h)，7.27(d，j＝7.5hz，1h)，1.43(s，6h)。ms(ei，m/z)：235.1[m-h]-。
實施例4：2-[(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)巰基]-2-甲基丙酸(19)和2-[(5-氰基咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基)巰基]-2-甲基丙酸(22)的合成
以2-氨基-6-氰基吡啶為原料，制備化合物19和22的實驗操作依次參見實施例1中的步驟c、d、e和f。
化合物17：1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ8.20(s，1h)，7.96(d，j＝5.7hz，1h)，7.85(d，j＝0.6hz，1h)，7.60(d，j＝5.7hz，1h)。
化合物19：1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.20(s，1h)，8.01-7.98(m，1h)，7.89(d，j＝1.5hz，1h)，7.41(d，j＝7.5hz，1h)，1.51(s，6h)。ms(ei，m/z)：260.1[m-h]-。
化合物20：1hnmr(dmso-d6，500mhz)δ8.32(d，j＝1.5hz，1h)，7.90(d，j＝1.5hz，1h)，7.79-7.76(m，2h)。
化合物22：ms(ei，m/z)：260.1[m-h]-。
實施例5：2-甲基-2-[(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基]丙酸(25)的合成
步驟a：將含有2-氨基-6-氟吡啶(500mg，4.46mmol)、溴丙酮(1.83g，13.4mmol)、乙醇(10ml)和碳酸氫鈉(375mg，4.46mmol)的混合物在90℃封管攪拌過夜。冷卻后減壓蒸除大部分溶劑，加入適量水，用飽和碳酸氫鈉溶液調節(jié)ph值至7～8。用乙酸乙酯(20ml×3)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20～1:3洗脫)，得5-氟-2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶(23)(108mg)。收率為16.1％。
步驟b：將含有化合物23(108mg，0.719mmol)、三乙胺(182mg，1.80mmol)、化合物2(193mg，1.44mmol)和dmf(5ml)的混合物在70℃攪拌60小時。加入水(20ml)，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(10ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:8～1:1洗脫)，得2-甲基-2-[(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基]丙酸甲酯(24)(35mg)。收率為18.4％。
步驟c：化合物24按實施例3中實驗步驟d方法水解，并酸化后得2-甲基-2-[(2-甲基咪唑并[1,2-a]吡啶-5-基)巰基]丙酸(25)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.34(s，1h)，7.98(d，j＝8.8hz，1h)，7.88-7.84(m，1h)，7.65(d，j＝7.2hz，1h)，2.51(s，3h)，1.52(s，6h)。ms(ei，m/z)：251.1[m+h]+。
實施例6：7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸(29)的合成
步驟a：將含有1-氨基碘化吡啶(6.17g，27.8mmol)、丙炔酸乙酯(3.0g，30.6mmol)、碳酸鉀(8.44g，61.2mmol)和dmf(40ml)的混合物在室溫下攪拌過夜。加入水(200ml)，用乙酸乙酯(60ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(30ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:30～1:10洗脫)，得吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯(26)(3.46g)。收率為65.4％。
步驟b：在-30～-40℃下將2.0m雙三甲基硅基胺基鈉thf溶液(16ml，32mmol)滴加到化合物26(3.4g，17.9mmol)的thf(15ml)溶解中，加完后繼續(xù)攪拌1小時。然后在該溫度下滴加碘(5.4g，21.3mmol)的thf(10ml)溶液，加完后繼續(xù)攪拌40分鐘。加入飽和食鹽水(40ml)，然后滴加飽和硫代硫酸鈉溶液至顏色褪去，用乙酸乙酯(40ml×3)萃取，合并的有機相用飽和食鹽水(25ml×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:15洗脫)，得7-碘吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸乙酯(27)(1.96g)。收率為34.6％。1hnmr(dmso-d6，300mhz)δ8.53(s，1h)，8.11(dd，j＝1.2，8.7hz，1h)，7.75-7.72(m，1h)，7.33(dd，j＝1.2，8.7hz，1h)，4.31(q，j＝6.9hz，2h)，1.34(t，j＝6.9hz，3h)。
步驟c和d的實驗操作參見實施例1中的步驟e和f，得7-[(2-羧基丙-2-基)巰基]吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲酸(29)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.42(s，1h)，8.03(dd，j＝0.8，8.8hz，1h)，7.56-7.52(m，1h)，7.17(d，j＝6.4hz，1h)，1.58(s，6h)。ms(ei，m/z)：279.1[m-h]-。
實施例7：2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(33)的合成
步驟a：將含有化合物3(300mg，1.24mmol)、異丙醇(4ml)和n，n-二甲基甲酰胺二甲基縮醛(dmfdma)(195mg，1.64mmol)的混合物在氮氣下回流攪拌3小時。冷卻到50℃，然后加入鹽酸羥胺(114mg，1.64mmol)，所得混合物在該溫度下攪拌6小時。減壓蒸除溶劑，加入適量水，用乙酸乙酯(15ml×2)萃取，無水硫酸鈉干燥。減壓蒸除溶劑，產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:20洗脫)，得n-[3-溴-6-(三氟甲基)吡啶-2-基]-n’-羥基甲脒(30)(300mg)。收率為84.9％。
步驟b：將含有化合物30(290mg，1.02mmol)、thf(10ml)和多聚磷酸(700mg，2.07mmol)在100℃封管攪拌過夜，減壓蒸除大部分溶劑。加入適量水，用2m氫氧化鈉溶液調節(jié)ph值至8～9，然后用乙酸乙酯(15ml×2)萃取，無水硫酸鈉干燥。產物經柱層析純化(200～300目硅膠，乙酸乙酯:石油醚＝1:10洗脫)，得8-溴-5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶(31)(190mg)。收率為55.8％。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.79(s，1h)，8.20(d，j＝8.0hz，1h)，7.76(d，j＝8.0hz，1h)。
步驟c和d的實驗操作參見實施例1中的步驟e和f，得2-甲基-2-{[5-(三氟甲基)-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-8-基]巰基}丙酸(33)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ13.19(s，1h)，8.71(s，1h)，7.85(d，j＝7.6hz，1h)，7.69(d，j＝7.6hz，1h)，1.62(s，6h)。ms(ei，m/z)：304.0[m-h]-。
實施例8：2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸(37)的合成
化合物5-溴-[1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶(35)的制備方法參見實施例7中的步驟a和b。其中步驟a中的化合物3用2-氨基-6-溴吡啶替代。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.62(s，1h)，7.91(dd，j＝2.8，7.2hz，1h)，7.66-7.62(m，2h)。
化合物2-([1,2,4]三氮唑并[1,5-a]吡啶-5-基巰基)-2-甲基丙酸(37)的制備方法參見實施例1中的步驟e和f，其中實施例1步驟e中的化合物4用化合物35替代。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ8.55(s，1h)，7.88-7.85(m，1h)，7.71-7.67(m，1h)，7.30-7.28(m，1h)，1.57(s，6h)。ms(ei，m/z)：236.1[m-h]-。
實施例9：1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸(40)的合成
實驗操作參見實施例1中的步驟a和b，將1-溴環(huán)丁烷甲酸乙酯與硫代乙酸鉀反應，所得化合物利用氫氧化鉀醇解，得1-巰基環(huán)丁烷甲酸乙酯(38)。實驗操作參見實施例1中的步驟e和f，將化合物38與化合物4進行反應，所得化合物進行水解并酸化，得1-{[5-(三氟甲基)咪唑并[1,2-a]吡啶-8-基]巰基}環(huán)丁烷甲酸(40)。1hnmr(dmso-d6，400mhz)δ13.19(s，1h)，8.06(s，1h)，7.77(s，1h)，7.57(d，j＝8.0hz，1h)，6.93(d，j＝8.0hz，1h)，2.94-2.91(m，2h)，2.37-2.21(m，4h)。ms(ei，m/z)：315.0[m-h]-。
實施例10：化合物生物學評價
體外hurat1轉運尿酸的抑制試驗可用于篩選具有降低血尿酸的潛在活性化合物。本發(fā)明預先構建高表達hurat1的穩(wěn)轉細胞株，并通過檢測化合物阻斷穩(wěn)轉細胞株攝取放射性同位素標記的尿酸的能力，評估化合物對hurat1轉運尿酸的抑制活性。
高表達hurat1穩(wěn)轉細胞株的構建：
通過質粒pcmv6-hurat1(購自origenetechnologies,inc)轉染hek293細胞株(人類胚胎腎細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)，并以濃度為500μg/ml的g418(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)進行抗性篩選，獲得穩(wěn)轉株。該細胞株的膜表面高表達hurat1轉運蛋白，可作為本發(fā)明體外篩選hurat1轉運尿酸抑制劑的模式細胞(toxicologicalsciences,2009,113(2):305-314.)。
體外hurat1轉運尿酸的抑制試驗：
1.細胞板的包被：按200μl/孔加入0.1mg/ml多聚賴氨酸溶液(poly-d-lysin)(購自sigma-aldrichco.llc),并置室溫下過夜。用無菌水清洗晾干，待用。
2.細胞的培養(yǎng)：將hurat1穩(wěn)轉細胞按2×105個/孔接入包被過的細胞板中，在37℃，5％co2孵箱中培養(yǎng)3天。
3.緩沖液hbss的配制：按125mm葡萄糖酸鈉、4.8mm葡萄糖酸鉀、1.3mm葡萄糖酸鈣、1.2mmkh2po4、1.2mmmgso4、5.6mm葡萄糖、25mmhepes(均購自上海國藥集團化學試劑有限公司)配制hbss緩沖液，并調節(jié)ph至7.4，實驗之前置37℃中溫浴。
4.先用hbss輕輕洗滌細胞板中細胞，然后按160μl/孔加入hbss，并按20μl/孔加入終濃度為500nm受試化合物，做為試驗化合物孔；按180μl/孔加入hbss但不加試驗化合物，做為空白對照孔。放置室溫下10min。按20μl/孔加入終濃度為50μm的14c尿酸(購自americanradiolabeledchemicals,inc)，放置室溫下20min。
5.吸凈每孔溶液并用hbss洗滌細胞并吸凈。最后加入0.2mnaoh溶解細胞，收集細胞碎片并加入適量閃爍液置于perkinelmermicrobetatrilux1450液體閃爍分析儀上檢測同位素14c的放射強度(cpm值)。每個試驗組均設三個重復孔，試驗結果取平均值，并計算sd值。
在hurat1穩(wěn)轉細胞株中，化合物對hurat1轉運尿酸的抑制率計算公式如下：
結果顯示，受試化合物與陽性藥物lesinurad、苯溴馬隆相比較，在濃度為500nm下，化合物對hek293轉染細胞中hurat1轉運尿酸具有良好的抑制作用。
表1.受試化合物、lesinurad和苯溴馬隆對穩(wěn)轉細胞株中hurat1轉運尿酸的抑制率