本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種利用磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源蛋白一步純化與固定化的方法及應(yīng)用，以及一種通用載體。

背景技術(shù)：

動(dòng)物是否能夠檢測(cè)到地球的磁場(chǎng)，以及它們?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)感應(yīng)磁場(chǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)定向或遷移，這是最有爭(zhēng)議的話題之一。許多研究人員致力于識(shí)別磁感應(yīng)，并尋找磁受體。最近，有研究人員發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一個(gè)磁蛋白生物指南針，它是一個(gè)多聚磁感應(yīng)棒狀蛋白復(fù)合體，這種磁敏復(fù)合體是由已鑒定的假定的磁感應(yīng)蛋白magr和已知的磁受體相關(guān)的光感受器隱花色素cry組成，有cry系統(tǒng)和鐵基系統(tǒng)兩者的特性，在包括地球在內(nèi)的磁場(chǎng)中能自發(fā)排列。并且驗(yàn)證了蛋白質(zhì)復(fù)合體具有固有磁矩。此外，這樣的蛋白質(zhì)復(fù)合體已被證明在物種之間廣泛分布，并且相信會(huì)激發(fā)跨領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新。

磁感應(yīng)蛋白magr屬于鐵硫簇結(jié)合蛋白(簡(jiǎn)稱鐵硫蛋白)，每一個(gè)蛋白質(zhì)單體都結(jié)合了一個(gè)二鐵二硫形式的鐵硫簇。磁感應(yīng)蛋白magr具有明顯的內(nèi)稟磁矩和清晰的物理模型，其必然掀起生物感磁研究的新一波熱潮，推動(dòng)整個(gè)生物磁感受能力研究的發(fā)展。

分離和純化蛋白質(zhì)是生物技術(shù)中的重要加工過(guò)程。等電點(diǎn)、十二烷基硫酸鈉和凝膠過(guò)濾層析等傳統(tǒng)方法已經(jīng)應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)的純化。在低濃度蛋白質(zhì)的情況下，分離和純化意味著更具有挑戰(zhàn)性。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)的幾種融合標(biāo)簽和親和色譜法提供了一種有效方式來(lái)純化目的融合蛋白。然而，高成本的親和柱和耗時(shí)的操作限制了其大規(guī)模的可用性。通常而言，固定化酶能夠回收和再利用昂貴的酶，并且提高成本效益。盡管進(jìn)行了許多嘗試來(lái)開(kāi)發(fā)和優(yōu)化固定化方法，但是終于發(fā)現(xiàn)，比表面積大和量子尺寸效應(yīng)的氧化鐵納米顆粒提供了一種快速，方便和經(jīng)濟(jì)的固定化酶的方法。然而，先前的酶純化是必要的，然后是磁性固定，這對(duì)工業(yè)應(yīng)用造成沉重的負(fù)擔(dān)。因此，實(shí)現(xiàn)酶的一步純化和固定化是很必要的。雖然ni²⁺官能化修飾的聚多巴胺包被的fe3o4納米粒子可以用于分離純化his標(biāo)簽蛋白。氨基官能化的mcfs的生產(chǎn)是用于粘附醛標(biāo)簽酶。連接dna配體的磁珠的制備是應(yīng)用于β-葡萄糖醛酸酶的分離純化。然而，氧化鐵納米顆粒的表面修飾應(yīng)當(dāng)在純化和固定之前完成和評(píng)價(jià)，并且修飾后的納米顆粒的不穩(wěn)定性也限制了它的重復(fù)使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源蛋白一步純化與固定化的方法及應(yīng)用，以及一種通用載體，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中外源蛋白表達(dá)量低，分離純化困難的問(wèn)題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種利用磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源蛋白一步純化與固定化的方法，所述方法包括以下步驟：1)以pet-28a(+)為載體質(zhì)粒，向其中插入磁感應(yīng)蛋白基因，構(gòu)建一通用載體；2)將外源蛋白基因可操作地插入所述步驟1)中的通用載體中，構(gòu)建含有外源蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，再將該重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得重組菌株；以及3)培養(yǎng)所述重組菌株，誘導(dǎo)所述外源蛋白基因表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，向所述表達(dá)產(chǎn)物中投入納米鐵珠，實(shí)現(xiàn)所述外源蛋白的一步分離純化與固定化。

優(yōu)選地，所述磁感應(yīng)蛋白基因是一種來(lái)自哺乳動(dòng)物家鴿的磁感應(yīng)蛋白基因或一種來(lái)自果蠅的磁感應(yīng)蛋白基因，其中來(lái)自哺乳動(dòng)物家鴿的磁感應(yīng)蛋白基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列，來(lái)自果蠅的磁感應(yīng)蛋白基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述步驟1)中通用載體的構(gòu)建還包括在所述磁感應(yīng)蛋白基因序列的下游插入凝血酶切割位點(diǎn)。通過(guò)在通用載體中引入該凝血酶切割位點(diǎn)，在外源蛋白以及磁感應(yīng)蛋白共表達(dá)之后，僅僅通過(guò)向表達(dá)產(chǎn)物中加入凝血酶，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)磁感應(yīng)蛋白標(biāo)簽的切割，獲得更加接近天然序列的外源蛋白。

可選地，所述步驟2)中重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中，所述外源蛋白基因與所述通用載體上的磁感應(yīng)蛋白基因直接連接。

優(yōu)選地，所述步驟2)中重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中，所述外源蛋白基因與所述通用載體上的磁感應(yīng)蛋白基因通過(guò)一段剛性linker連接，所述剛性linker具有如seqidno.5所示的核苷酸序列。

還優(yōu)選地，所述步驟2)中重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建中，所述外源蛋白基因與所述通用載體上的磁感應(yīng)蛋白基因通過(guò)一段柔性linker連接，所述柔性linker具有如seqidno.6所示的核苷酸序列。

作為舉例而非限制，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌bl21(de3)。

所述外源蛋白包括：脂肪酶、糖苷酶或普魯蘭酶等等。本發(fā)明通過(guò)上述三種外源蛋白驗(yàn)證了磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽的通用性，但是應(yīng)當(dāng)理解，此處僅作為舉例而非限制，外源蛋白實(shí)際并不僅限于上述三種。

所述步驟3)中還包括：向所述表達(dá)產(chǎn)物中加入適量凝血酶，實(shí)現(xiàn)磁蛋白標(biāo)簽與外源蛋白的分離。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，還提供一種根據(jù)上述方法獲得的通用載體，所述通用載體以pet-28a(+)為載體質(zhì)粒，插入連接有凝血酶切割位點(diǎn)的磁感應(yīng)蛋白基因，所述通用載體依次包括：t7啟動(dòng)子、磁感應(yīng)蛋白基因、凝血酶切割位點(diǎn)、linker、多克隆位點(diǎn)以及t7終止子。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，還提供一種利用磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源蛋白一步純化與固定化的方法在制備工業(yè)酶制劑、蛋白質(zhì)藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

根據(jù)本發(fā)明提供的方法，首次利用磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽，然后通過(guò)磁感應(yīng)蛋白對(duì)納米鐵珠的吸附，一步實(shí)現(xiàn)了外源蛋白的分離純化與固定化，該方法與傳統(tǒng)的純化方法相比，純化的步驟非常簡(jiǎn)便、快速，節(jié)約了大量的人力、物力以及時(shí)間成本。

根據(jù)本發(fā)明提供的方法，一步實(shí)現(xiàn)了外源蛋白，比如脂肪酶的純化與固定化，并且固定化的脂肪酶相對(duì)于游離的脂肪酶提高了熱穩(wěn)定性與ph的耐受性，增加了可重復(fù)利用性。

根據(jù)本發(fā)明提供的方法，直接采用納米鐵珠對(duì)蛋白的磁性吸附即可實(shí)現(xiàn)對(duì)外源蛋白的一步分離純化，避免了現(xiàn)有技術(shù)需在分離純化前對(duì)納米鐵珠進(jìn)行表面修飾，而修飾后的納米鐵珠的不穩(wěn)定性又限制了其重復(fù)使用的缺陷，而本發(fā)明所提供的方法中納米鐵珠不僅無(wú)需修飾，也不存在重復(fù)使用率低的缺陷，節(jié)約了成本。

根據(jù)本發(fā)明提供的通用載體，磁蛋白純化標(biāo)簽位于一環(huán)化質(zhì)粒(即通用質(zhì)粒)上，易于保存和dna操作。

本發(fā)明所采用的磁感應(yīng)蛋白，只有14.5kda，其單體只有130個(gè)氨基酸左右(不同物種略有差異)，更方便進(jìn)行基因操作，對(duì)目標(biāo)生物的負(fù)擔(dān)也會(huì)更小。

本發(fā)明提供的通用載體中帶有純化標(biāo)簽和凝血酶切割位點(diǎn)，有利于純化標(biāo)簽的去除，獲得更加接近天然序列的目的蛋白。

本發(fā)明提供的通用載體的多克隆位點(diǎn)中含有稀有接口，兼容絕大多數(shù)異源基因的連接，節(jié)約操作時(shí)間提高工作效率。

總之，本發(fā)明提供了一種以磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽，一步實(shí)現(xiàn)外源蛋白的純化與固定化的方法，并且該方法步驟簡(jiǎn)便、快速，相比傳統(tǒng)方法節(jié)約了大量的人力、物力和時(shí)間成本，為外源蛋白的一步分離、純化、固定化開(kāi)辟了新的道路。

附圖說(shuō)明

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例構(gòu)建的通用質(zhì)粒p28amagr的物理圖譜；其中，包括t7啟動(dòng)子；clmagr：磁蛋白純化標(biāo)簽；mcs：多克隆酶切位點(diǎn)；t7終止子；kanr抗性標(biāo)記。

圖2是clmagr的蛋白電泳圖；其中，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；3、4：bl21-pet28a-clmagr細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；5:鐵珠純化的clmagr蛋白。

圖3是linker模式下和無(wú)linker模式下融合clmagr標(biāo)簽的gfp的蛋白電泳圖；其中，(a)圖，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；3、4：bl21-pet28a-clmagr-剛性linker-gfp細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；5：鐵珠純化后clmagr-剛性linker-gfp蛋白；6、7：bl21-pet28a-clmagr-柔性linker-gfp細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；8：鐵珠純化后clmagr-柔性linker-gfp蛋白。(b)圖，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；3、4：bl21-pet28a-clmag-gfp細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；5：鐵珠純化后clmagr-gfp蛋白。

圖4是無(wú)linker模式下融合clmagr標(biāo)簽的脂肪酶、糖苷酶、普魯蘭酶的蛋白電泳圖；其中，(a)圖，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；3、4：bl21-p28amagr-lipase細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；5：鐵珠純化后clmagr-lipase蛋白；(b)圖，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；3、4：bl21-p28amagr-α-af細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；5：鐵珠純化后clmagr-α-af蛋白；(c)圖，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；3、4：bl21-p28amagr-pullulanase細(xì)胞破碎液的上清、沉淀；5：鐵珠純化后clmagr-pullulanase蛋白。

圖5是游離脂肪酶與固定化脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)比；其中，(a)游離脂肪酶和固定化脂肪酶在不同溫度下的相對(duì)活性曲線；(b)游離脂肪酶和固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性；(c)游離脂肪酶和固定化脂肪酶在各種ph條件下的相對(duì)活性曲線；(d)游離脂肪酶和固定化脂肪酶的ph穩(wěn)定性；

圖6是固定化脂肪酶的可重復(fù)利用性；

圖7是去掉clmagr標(biāo)簽的脂肪酶的蛋白電泳圖；其中，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：bl21-pet28a細(xì)胞破碎液的上清；2:bl21-p28amagr-lipase細(xì)胞破碎液的上清；3：鐵珠純化后clmagr-lipase蛋白；4：凝血酶在4℃下將純化的clmagr-lipase蛋白消化10h得到的脂肪酶條帶；5：凝血酶在20℃下將純化的clmagr-lipase蛋白消化3.5h得到的脂肪酶條帶；6：凝血酶在37℃下將純化的clmagr-lipase蛋白消化1.5h得到的脂肪酶條帶。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明所用的原料或試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均市售可得。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(newyork：coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件進(jìn)行，或按照制造廠商所建議的條件。

應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，該方法適用于任何磁感應(yīng)蛋白，但是由于存在無(wú)法窮舉的原因，本文僅以兩種磁感應(yīng)蛋白作為舉例說(shuō)明，其中一種是來(lái)自哺乳動(dòng)物家鴿的磁感應(yīng)蛋白基因，另一種是來(lái)自果蠅的磁感應(yīng)蛋白基因，其中來(lái)自哺乳動(dòng)物家鴿的磁感應(yīng)蛋白基因具有seqidno.1所示的核苷酸序列，來(lái)自果蠅的磁感應(yīng)蛋白基因具有seqidno.2所示的核苷酸序列。但是，應(yīng)當(dāng)理解，來(lái)自果蠅的磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽的應(yīng)用與來(lái)自哺乳動(dòng)物家鴿的磁感應(yīng)蛋白的應(yīng)用在方法上是基本一致的，區(qū)別僅在于具體核苷酸序列的不同。因此，以下具體實(shí)施方式僅以來(lái)自哺乳動(dòng)物家鴿的磁感應(yīng)蛋白基因?yàn)槔瑏?lái)自果蠅的磁感應(yīng)蛋白基因的應(yīng)用則不再贅述。

實(shí)施例中用到的試劑、緩沖液和培養(yǎng)基如下：

主要試劑配置：

卡那霉素：無(wú)菌雙蒸水配置50mg/ml的kanr溶液，使用孔徑0.22μm無(wú)菌濾膜除菌，-20℃保存。

50×tae：冰醋酸57ml，tris242g，0.5mol/ledta(ph8.0)40ml，ddh2o定容至1000ml。

蛋白電泳緩沖液：tris-base：3g，sds(十二烷基磺酸鈉)：1g，甘氨酸(glycine)：14.4g，加雙蒸水定容至1000ml，調(diào)節(jié)ph為8.3。

5×loadingbuffer：ph6.8的1mtris-hcl:0.6ml，10％sds：2ml，2-巰基乙醇：0.5ml，50％甘油：5ml，1％溴酚藍(lán)：1ml，雙蒸水：0.9ml。

sds-page染色液：冰乙酸：100ml，無(wú)水乙醇：450ml，考馬斯亮藍(lán)r-250：1g，雙蒸水：450ml。

sds-page脫色液：無(wú)水乙醇：100ml，冰乙酸：200ml，雙蒸水：700ml。

lb培養(yǎng)基(1l)配方：氯化鈉：10g，蛋白胨：10g，酵母粉：5g，原始ph；其固體培養(yǎng)基：在lb液體培養(yǎng)基中加入15-20％的瓊脂粉；121℃，濕熱滅菌20分鐘。

質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自invitrogen(usa)，膠回收試劑盒購(gòu)自omega公司。

實(shí)施例1pet28a-clmagr重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1)合成如seqidno.1所示的clmagr基因的核苷酸序列，該序列由金斯瑞生物科技有限公司合成；

2)分別合成以下引物：

引物clmagrf：5’cgcggatccatggcatctagcgcatcatc3’，其中，下劃線部分為bamhi識(shí)別位點(diǎn)；

引物clmagrr：5’acggagctcgatgttaaagctttctccac3’，其中，下劃線部分為saci識(shí)別位點(diǎn)。

3)在上述引物的引導(dǎo)下，以步驟1)中的序列為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4)將pet-28a(+)空載質(zhì)粒，以及步驟3)得到的帶有bamhi和saci酶切位點(diǎn)的基因，分別用bamhi和saci進(jìn)行雙酶切?；厥沾笃?，用t4dna連接酶連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a，用含50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，pcr法挑取陽(yáng)性克隆，試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，經(jīng)基因測(cè)序鑒定，獲得正確的克隆質(zhì)粒，命名為pet28a-clmagr。

實(shí)施例2磁蛋白的異源高效可溶性表達(dá)和磁蛋白的磁性驗(yàn)證

1)將實(shí)施列1中的獲得的表達(dá)質(zhì)粒pet28a-clmagr采用熱激法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌bl21(de3)，挑取單菌落，在含有50μg/ml卡那霉素的5mllb培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)8小時(shí)，然后按1％的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的40mllb培養(yǎng)基中繼續(xù)繁殖。當(dāng)od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入iptg至終濃度20μm。在20℃下誘導(dǎo)13小時(shí)后，收集細(xì)胞并用純水洗滌。將收集的細(xì)胞重懸于tbs緩沖液(20mmtris，150mmnacl，ph7.5)中，并超聲破碎15分鐘。將細(xì)胞裂解液離心，分別收集上清與沉淀，進(jìn)行sds-page電泳。

2)將步驟1)收集的上清取0.5ml，加入0.1ml的fe3o4-sio2納米粒子(10mgml^-1)，室溫孵育10mim，通過(guò)離心收集所得沉淀，并用tbs緩沖液洗滌三次以除去非吸附雜蛋白。通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測(cè)吸附的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，clmagr基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源高效可溶性表達(dá)，并且該表達(dá)的磁蛋白經(jīng)驗(yàn)證具有一定的磁性。

實(shí)施例3linker的設(shè)計(jì)模式

1)分別設(shè)計(jì)并合成剛性linker和柔性linker，以及引物linker1f，linker2f，linker1r/linker2r，gfp1f/gfp1r，gfp2f/gfp2r，gfp3f/gfp3r；

其中，剛性linker的基因序列如seqidno.5所示，柔性linker的基因序列如seqidno.6所示；

linker1f：5’atcgagctcaaagcgaaactgaaagagga3’，其中，下劃線部分為saci識(shí)別位點(diǎn)；

linker2f：5’atcgagctcggcggaggtggctctggcgg3’，其中，下劃線部分為saci識(shí)別位點(diǎn)；

linker1r/linker2r：5’ttctcctttactcatatggctgccgcgcgg

cacca3’

gfp1f/gfp2f：5’ccatatgagtaaaggagaagaact3’

gfp3f：5’atcgagctcctggtgccgcgcggcagccatatgagtaaaggagaagaac3’，其中，下劃線部分為saci識(shí)別位點(diǎn)；

gfp1r/gfp2r/gfp3r：5’agtgcggccgcttatttgtatagttcatcca3’，其中，下劃線部分為noti識(shí)別位點(diǎn)。

2)對(duì)于質(zhì)粒構(gòu)建，使用引物gfp1f/gfp1r，gfp2f/gfp2r擴(kuò)增包括完整orf的gfp的dna片段ⅰ/ⅱ。接著，合成含有凝血酶序列+柔性linker/凝血酶序列+剛性linker的dna片段ⅲ/ⅳ，用引物linker1f/linker1r和linker2f/linker2r擴(kuò)增得到dna片段ⅴ/ⅵ。接著，使用pcr純化過(guò)的片段ⅰ/ⅴ和片段ⅱ/ⅵ作為模板，用引物linker1f/gfp1r和linker2f/gfp2r擴(kuò)增得到dna片段ⅶ/ⅷ。接著，通過(guò)saci和noti消化載體pet28a-clmagr，然后與同經(jīng)過(guò)saci/noti雙酶切的片段ⅶ/ⅷ整合，產(chǎn)生載體pet28a-clmagr-柔性linker-gfp和pet28a-clmagr-剛性linker-gfp。相似的，基因gfp用引物gfp3f/gfp3r擴(kuò)增，其在gfp的5'端引入凝血酶消化序列。在通過(guò)saci/noti消化后，將gfp基因克隆到質(zhì)粒pet28a-clmagr中以獲得載體pet28a-clmagr-gfp。

3)將重組表達(dá)質(zhì)粒pet28a-clmagr-柔性linker-gfp、pet28a-clmagr-剛性linker-gfp和p28amagr-gfp通過(guò)熱激法分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中，誘導(dǎo)gfp表達(dá)，其誘導(dǎo)條件是：20℃，iptg0.05mmol/l，13小時(shí)通過(guò)離心收集細(xì)胞，用tbs緩沖液洗滌兩次，然后通過(guò)超聲破碎。如上所述，通過(guò)fe3o4-sio2納米顆粒純化融合蛋白，進(jìn)行sds-page電泳。結(jié)果如圖3所示，驗(yàn)證了磁蛋白作為純化標(biāo)簽的可行性。并且將200μl的clmagr-gfp，clmagr-柔性linker-gfp，clmagr-剛性linker-gfp溶液轉(zhuǎn)移到96孔微量培養(yǎng)板中，然后置于biotek^tmcytation^tm3cellimagingmulti-modereader(美國(guó)佛蒙特州)中，在485nm激發(fā)和520nm發(fā)射條件下，測(cè)得三者的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)表一。

表一clmagr-rigidlinker-gfp,clmagr-flexiblelinker-gfpandclmagr-gfp的熒光強(qiáng)度

根據(jù)上表一結(jié)果可知，當(dāng)在clmagr和gfp之間連入剛性linker時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其次是不加linker的情況，再次是連入柔性linker的情況。因此，在該實(shí)施例中，在磁感應(yīng)蛋白與外源蛋白之間連入剛性linker時(shí)，外源蛋白的表達(dá)量最高。但是，考慮到不加linker的熒光強(qiáng)度僅比連入剛性linker的熒光強(qiáng)度稍低，而不加linker模式構(gòu)建表達(dá)目的蛋白重組質(zhì)粒步驟簡(jiǎn)單，而且選擇不同目的蛋白，它們的構(gòu)象也不同，連入剛性linker是否會(huì)影響相應(yīng)目的蛋白的構(gòu)象也并不確定，而不加linker模式就表明了磁蛋白不影響gfp構(gòu)象，因此，也可選擇不加linker。對(duì)于其他外源蛋白，還可優(yōu)選連入柔性linker。

實(shí)施例4通用質(zhì)粒p28amagr的構(gòu)建：

1)合成帶有clmagr純化標(biāo)簽、凝血酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，如seqidno.13所示；

2)合成下列引物：

引物magrf：5’cgcggatccatggcatctagcgcatcatc3’，其中下劃線部分為bamhi識(shí)別位點(diǎn)；

引物magrr：5’acggagctcatggctgccgcgcggcacca3’，其中，下劃線部分為saci識(shí)別位點(diǎn)。

3)在上述引物的引導(dǎo)下，以步驟1)中合成的序列為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4)將pet-28a(+)空載質(zhì)粒，以及步驟3)得到的帶有bamhi和saci酶切位點(diǎn)的基因片段，分別用bamhi和saci進(jìn)行雙酶切?；厥沾笃?，用t4dna連接酶連接，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a，用含50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，pcr法挑取陽(yáng)性克隆，試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，經(jīng)基因測(cè)序鑒定，獲得正確的克隆質(zhì)粒，命名為p28amagr。

實(shí)施例5p28amagr-lipase,p28amagr-α-af和p28amagr-pullulanase的構(gòu)建

為了確認(rèn)該純化方法的普遍性，選擇具有不同分子量大小的脂肪酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-af)和普魯蘭酶作為靶蛋白。合成具有sali和xhoi酶切位點(diǎn)的引物lipasef/lipaser、aff/afr、pulluf/pullur，以分別擴(kuò)增脂肪酶，α-af和普魯蘭酶基因的完整orf，純化的pcr產(chǎn)物通過(guò)sali和noti雙酶切后并整合到p28amagr中，產(chǎn)生p28amagr-lipase，p28amagr-α-af和p28amagr-pullulanase重組表達(dá)質(zhì)粒。其中：

lipasef：5’tccgtcgactcctcagggcataaccctgt3’，其中，下劃線部分為sali識(shí)別位點(diǎn)；

lipaser：5’gtgctcgagttaatttgtattttgtccgc3’，其中，下劃線部分為xhoi識(shí)別位點(diǎn)；

aff：5’tccgtcgacatgaaaaacttcaagatgct3’，其中，下劃線部分為sali識(shí)別位點(diǎn)；

afr：5’gtgctcgagtcagttcagtgtgatctcaa3’，其中，下劃線部分為xhoi識(shí)別位點(diǎn)；

pulluf：5’tccgtcgacgattctacttcgactaaagt3’，其中，下劃線部分為sali識(shí)別位點(diǎn)；

pullur：5’gtgctcgagttattgtttgagaataagcg3’，其中，下劃線部分為xhoi識(shí)別位點(diǎn)。

將重組載體p28amagr-lipase，p28amagr-α-af和p28amagr-pullulanase分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21(de3)中。選擇通過(guò)pcr和測(cè)序確認(rèn)的轉(zhuǎn)化體。脂肪酶，α-af和支鏈淀粉酶的誘導(dǎo)條件為：20℃，iptg0.1mmol/l，16小時(shí)；20℃，iptg0.2mmol/l，20h；20℃，iptg0.1mmol/l，18小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，用tbs緩沖液洗滌兩次，然后通過(guò)超聲破碎。如上所述，通過(guò)fe3o4-sio2納米顆粒純化融合蛋白，進(jìn)行sds-page電泳。結(jié)果如圖4所示，驗(yàn)證了磁蛋白作為純化標(biāo)簽的通用性。

實(shí)施例6脂肪酶的一步純化與固定化

1)在bl21-p28amagr-lipase破碎后的上清中投入fe3o4-sio2納米粒子(購(gòu)買(mǎi)于蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)，方法見(jiàn)實(shí)施例2中的步驟2)，通過(guò)磁蛋白與納米鐵珠的物理吸附作用，一步實(shí)現(xiàn)脂肪酶的純化與固定化。通過(guò)分別對(duì)游離脂肪酶和固定化脂肪酶在不同溫度下和不同ph下的穩(wěn)定性進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示，固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性和ph穩(wěn)定性均相比游離脂肪酶得到提高。此外，發(fā)明人還對(duì)固定化脂肪酶的可重復(fù)利用性進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖6所示，固定化脂肪酶在重復(fù)利用高達(dá)15次后，其相對(duì)活性仍然保持80％，在重復(fù)利用20次后，其相對(duì)活性也仍然高達(dá)75％。由此可知，通過(guò)納米鐵珠對(duì)磁蛋白的物理吸附作用，實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的一步純化和固定化，使脂肪酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性均得到提高。為了得到純的脂肪酶溶液，在步驟1)所得溶液中加入少量的凝血酶，分別在4℃、20℃、37℃、酶切10h、3.5h、1.5h，實(shí)現(xiàn)磁蛋白標(biāo)簽與脂肪酶的分離，結(jié)果如圖7所示，磁蛋白標(biāo)簽與脂肪酶成功分離，獲得了更加接近天然序列的脂肪酶。

以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。

序列表

<110>華東理工大學(xué)

<120>一種利用磁感應(yīng)蛋白作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)外源蛋白一步純化與固定化的方法，應(yīng)用及通用載體

<160>21

<210>1

<211>399

<212>dna

<213>家鴿

<400>1

atggcatctagcgcatcatctgttgttagagcaacagttagagcagttagcaaaagaaaa60

attcaagcaacaagagcagcacttacacttaccccatcagctgttcagaagataaaagag120

cttcttaaagataaacctgagcatgtaggcgtgaaagtaggtgttcgcacaagaggatgc180

aatggactttcttacacattagaatatacaaaatcaaaaggagactctgatgaagaagta240

gttcaagatggggttagagtgtttattgagaagaaggcacagctgacgcttttaggcact300

gaaatggactatgtagaagacaaactgtccagtgaatttgtcttcaataatccaaacatc360

aaaggaacatgtggctgtggagaaagctttaacatctga399

<210>2

<211>393

<212>dna

<213>果蠅

<400>2

atggcgacacgtgtggtggcaacggcgacagtgcgggcggtgaaaggccggaagttaatc60

ccgacgcgggccgctctgactctgacacccgcggcggtgctacgcatcaagacgcttctg120

caggacaagccggacatggttggcctaaaggtgggcgtacggcagcgaggatgcaatggt180

ctgtcctacacgctggactatgccagccaaaaagacaagttggatgaggaggtggtccag240

gatggcgtcaaggtcttcatcgacaagaaagcgcagttgtcgctgctgggtaccgagatg300

gactttgtggaatcgaagctgtccagcgagttcgtgtttaacaatccgaacattaagggc360

acatgcggctgcggcgaatcgttcagcatgtaa393

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>clmagrf

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>3

cgcggatccatggcatctagcgcatcatc29

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>clmagrf

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>4

acggagctcgatgttaaagctttctccac29

<210>5

<211>101

<212>dna

<213>人工序列

<220>剛性linker

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<400>5

aaagcgaaactgaaagaggaggaagagcgtaagcagcgcgaagaagaagacgtattaaac60

gtctggaagaactggcgaaacgtaaagaagaggaacgcaaa101

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>柔性linker

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>6

ggcggaggtggctctggcggtggcggatcg30

<210>7

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>linker1f

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>7

atcgagctcaaagcgaaactgaaagagga29

<210>8

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>linker2f

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<400>8

atcgagctcggcggaggtggctctggcgg29

<210>9

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>linker1r/linker2r

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>9

ttctcctttactcatatggctgccgcgcggcacca35

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>gfp1f/gfp2f

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<400>10

ccatatgagtaaaggagaagaact24

<210>11

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<220>gfp3f

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>11

atcgagctcctggtgccgcgcggcagccatatgagtaaaggagaagaac49

<210>12

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>gfp1r/gfp2r/gfp3r

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>12

agtgcggccgcttatttgtatagttcatcca31

<210>13

<211>420

<212>dna

<213>人工序列

<220>p28amagr

<223>

<400>13

atggcatctagcgcatcatctgttgttagagcaacagttagagcagttagcaaaagaaaa60

attcaagcaacaagagcagcacttacacttaccccatcagctgttcagaagataaaagag120

cttcttaaagataaacctgagcatgtaggcgtgaaagtaggtgttcgcacaagaggatgc180

aatggactttcttacacattagaatatacaaaatcaaaaggagactctgatgaagaagta240

gttcaagatggggttagagtgtttattgagaagaaggcacagctgacgcttttaggcact300

gaaatggactatgtagaagacaaactgtccagtgaatttgtcttcaataatccaaacatc360

aaaggaacatgtggctgtggagaaagctttaacatcggcctggtgccgcgcggcagccat420

<210>14

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>magrf

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>14

cgcggatccatggcatctagcgcatcatc29

<210>15

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>magrr

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>15

acggagctcatggctgccgcgcggcacca29

<210>16

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>lipasef

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>16

tccgtcgactcctcagggcataaccctgt29

<210>17

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>lipaser

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>17

gtgctcgagttaatttgtattttgtccgc29

<210>18

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>aff

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>18

tccgtcgacatgaaaaacttcaagatgct29

<210>19

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>afr

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>19

gtgctcgagtcagttcagtgtgatctcaa29

<210>20

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>pulluf

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>20

tccgtcgacgattctacttcgactaaagt29

<210>21

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>pullur

<223>金斯瑞生物科技有限公司

<400>21

gtgctcgagttattgtttgagaataagcg29