專利名稱：蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明包括在果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)中生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)是商業(yè)生物技術(shù)的主干，其中在重組生物體或細(xì)胞中生產(chǎn)感興趣的多肽或蛋白質(zhì)?；诖竽c桿菌(E.Coli)等宿主的細(xì)菌表達(dá)的最早的系統(tǒng)已經(jīng)與基于真核宿主的系統(tǒng)相結(jié)合，特別是培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、培養(yǎng)的和以完整昆蟲(chóng)形式存在的昆蟲(chóng)細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物如綿羊和山羊。
原核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)容易維護(hù)并且操作便宜。但是，原核細(xì)胞不能進(jìn)行真核蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。而且，許多蛋白質(zhì)不正確地折疊，要求特定的過(guò)程進(jìn)行再折疊，這增加了生產(chǎn)成本。
對(duì)于一些用途已經(jīng)描述了真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠進(jìn)行翻譯后修飾，一般產(chǎn)生正確折疊且可溶的蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)包括需要專門的、昂貴的培養(yǎng)設(shè)備，以及感染的危險(xiǎn)，感染可能導(dǎo)致失去整個(gè)培養(yǎng)物。
植物生產(chǎn)系統(tǒng)可以用于蛋白質(zhì)表達(dá)，并且可以獲得高產(chǎn)量的生產(chǎn)。但是，轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)作物難以控制，增加了基因操作材料污染環(huán)境的危險(xiǎn)。
昆蟲(chóng)細(xì)胞也用于多肽表達(dá)。用于昆蟲(chóng)細(xì)胞中最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)基于桿狀病毒載體。通過(guò)在強(qiáng)天然多角體蛋白啟動(dòng)子控制下，用異源基因代替桿狀病毒的多角體蛋白基因而構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)的載體，桿狀病毒的多角體蛋白基因編碼桿狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。所培養(yǎng)的昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞用重組病毒感染，如果采用適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)，可以從細(xì)胞本身或者從培養(yǎng)基中回收所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。但是，這些系統(tǒng)也存在與培養(yǎng)物感染以及需要專門的培養(yǎng)設(shè)備相關(guān)的問(wèn)題。
基于生物體的表達(dá)系統(tǒng)避免了許多感染的缺點(diǎn)并且比細(xì)胞培養(yǎng)物更容易生長(zhǎng)。例如，使用桿狀病毒等病毒載體允許整個(gè)昆蟲(chóng)的感染，這對(duì)特定的生長(zhǎng)條件只有較少的要求。大昆蟲(chóng)如蠶蛾提供高產(chǎn)量的異種蛋白質(zhì)。可以根據(jù)常規(guī)提取技術(shù)從昆蟲(chóng)中提取蛋白質(zhì)。
基于在哺乳動(dòng)物如山羊和綿羊中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的技術(shù)也是已知的，在羊乳蛋白質(zhì)表達(dá)控制序列的控制下使它們?cè)谘蛉橹斜磉_(dá)。這種技術(shù)有很大的潛在優(yōu)點(diǎn)，但是由于需要從最終產(chǎn)品中分離內(nèi)源性哺乳動(dòng)物病毒、朊病毒和蛋白質(zhì)，所以是昂貴的。此外，產(chǎn)生和喂養(yǎng)大的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成本高。
已經(jīng)提出使用昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，粉斑夜蛾(Trichoplusa ni)的幼蟲(chóng)，用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)(Pham等人，1999Biotech Bioeng62175-182)。但是，這種系統(tǒng)僅與基于桿狀病毒的病毒載體技術(shù)相結(jié)合而提出。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)預(yù)計(jì)用于飲食或制藥用途時(shí)，細(xì)菌系統(tǒng)和/或病毒載體是不希望的。所以，在本領(lǐng)域中需要一種蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，它是有活力的并且是可以規(guī)?；模窕谕暾矬w的系統(tǒng)那樣，并且不含基于病毒的載體，而且在可以控制的環(huán)境中便宜地操作。
發(fā)明概述根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)的方法，它包括(a)轉(zhuǎn)化具有能在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的非病毒表達(dá)系統(tǒng)的昆蟲(chóng)；(b)使該昆蟲(chóng)繁殖以生產(chǎn)幼蟲(chóng)；(c)培養(yǎng)幼蟲(chóng)；和(d)從幼蟲(chóng)中分離感興趣的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以迅速生產(chǎn)用于研究目的的毫克量的多肽，生產(chǎn)用于臨床和診斷用途的千克量的蛋白質(zhì)，并且可能低成本地生產(chǎn)數(shù)千千克的工業(yè)酶，因?yàn)槭褂么_定的培養(yǎng)技術(shù)可以容易地培養(yǎng)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)。
根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)是多方面的。在可控的生產(chǎn)環(huán)境中，使用現(xiàn)有技術(shù)大量飼養(yǎng)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)是可能的，并且可以非常低成本地生產(chǎn)多肽產(chǎn)品。對(duì)于完整的生物體如哺乳動(dòng)物，這可以使得規(guī)定批準(zhǔn)更容易，此時(shí)在獲得批準(zhǔn)之前必須證明沒(méi)有病毒和朊病毒。而且，本發(fā)明的方法避免了與動(dòng)物(包括昆蟲(chóng))細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)包括更高的感染危險(xiǎn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)系統(tǒng)的情況中病毒或朊病毒污染的危險(xiǎn)。
術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括單鏈多肽分子以及多肽復(fù)合體，其中各個(gè)組成多肽通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)方法連接。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括長(zhǎng)度為兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽，一般具有大于5、10或20個(gè)氨基酸。
如本文所稱，一種非病毒表達(dá)系統(tǒng)包括不基于病毒如桿狀病毒的轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)的任何技術(shù)。例如，非病毒表達(dá)系統(tǒng)包括基于自動(dòng)復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒和基于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的那些表達(dá)系統(tǒng)。用于昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)基于轉(zhuǎn)座子。下面更詳細(xì)地描述適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)座子。
在本發(fā)明的方法中所用的表達(dá)系統(tǒng)包括在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)，特別是在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)內(nèi)有活性的控制元件。許多昆蟲(chóng)控制序列，包括各種啟動(dòng)子，在許多不同物種中是有活性的。所以，不必使用由考慮中的昆蟲(chóng)獲得的序列?？梢允褂谜T導(dǎo)型或組成型活性序列。
優(yōu)選地，控制序列是誘導(dǎo)型序列。優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是通過(guò)提高培養(yǎng)幼蟲(chóng)的溫度而誘導(dǎo)的熱激蛋白HSP70啟動(dòng)子，和四環(huán)素誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)(Heinrich和Scott，PNAS978229-8232，2000)。
為了提高蛋白質(zhì)生產(chǎn)量，可以使用多種表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可以安排在每個(gè)系統(tǒng)中存在兩個(gè)或多個(gè)編碼序列，或者作為多種單個(gè)系統(tǒng)。在二者中的任一種情況下，為了在昆蟲(chóng)交配過(guò)程中有利于表達(dá)系統(tǒng)保持并傳遞給后代，可以使用平衡器染色體(balancerchromosome)。
昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)培養(yǎng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這些培養(yǎng)可以同步，使得所有的幼蟲(chóng)同時(shí)達(dá)到相同的成熟程度。這可以通過(guò)改變培養(yǎng)溫度來(lái)進(jìn)行，因?yàn)橛紫x(chóng)在低溫下發(fā)育更慢。例如，與25℃時(shí)的生長(zhǎng)速度相比，18℃的發(fā)育速度為其一半。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括蛋白質(zhì)積累可以引導(dǎo)到脂肪體中，或者可以在適當(dāng)?shù)目刂茀^(qū)和信號(hào)肽如幼蟲(chóng)血清蛋白質(zhì)序列的控制下，把蛋白質(zhì)分泌到血淋巴中。
附圖簡(jiǎn)述


圖1表示pMiHspGFP/HspCcW轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)，它在Hsp70啟動(dòng)子的控制下表達(dá)GFP和白色基因。
圖2表示質(zhì)粒pMiAct5CGFP的結(jié)構(gòu)，它在果蠅肌動(dòng)蛋白5C基因的控制下表達(dá)GFP。
圖3表示在熱激后在轉(zhuǎn)基因地中海果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)中表達(dá)GFP。
圖4表示在果蠅中GFP的組成型表達(dá)。
圖5表示在成年果蠅中GFP的組成型表達(dá)。所觀察的熒光是基因劑量依賴性的。
圖6表示在果蠅幼蟲(chóng)中GFP的表達(dá)(頂部轉(zhuǎn)基因；底部野生型)圖7表示在幼蟲(chóng)血淋巴中用于蛋白質(zhì)表達(dá)的載體的結(jié)構(gòu)。LspP/L是果蠅或地中海果蠅血清蛋白(Drosophila or Medfly Larbal SerumProtein)(Lsp)基因的啟動(dòng)子，然后是Lsp5’非翻譯前導(dǎo)區(qū)(帶條紋的方框)和Lsp信號(hào)肽(黑色方框)。感興趣的基因在框中與前導(dǎo)肽融合。HspP和HspT分別是熱激70基因啟動(dòng)子和終止子。CcW是地中海果蠅白色基因，用作檢測(cè)轉(zhuǎn)化株的顯性可見(jiàn)標(biāo)記。MiL和MiR是Minos元件的末端。
圖8是從camelid抗體文庫(kù)中分離并在地中海果蠅幼蟲(chóng)中表達(dá)的抗PERV p30抗體克隆的預(yù)知序列。
發(fā)明詳述雖然本文所述技術(shù)一般是本領(lǐng)域中熟知的，具體可以參考Sambrook等人的分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning，ALaboratory Manual(1989))，和Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology(1999)，第四版，John Wiley & Sons，Inc.。
轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子是能夠在物種的基因組內(nèi)從一個(gè)位置“跳躍”或易位到另一個(gè)位置的基因元件。它們廣泛分布在動(dòng)物中，包括昆蟲(chóng)。
由于由元件本身編碼的，或者由其它方法提供的轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)的活性，轉(zhuǎn)座子在它們的宿主物種內(nèi)是有活性的，所述其它方法例如注入轉(zhuǎn)座酶編碼的mRNA、使用編碼轉(zhuǎn)座酶的第二種編碼序列或加入轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)本身。轉(zhuǎn)座機(jī)制的理解的進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致基于可用于基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座子的基因工具的開(kāi)發(fā)。
可以使用在需要的昆蟲(chóng)中有活性的任何可轉(zhuǎn)座元件。但是，優(yōu)選的可轉(zhuǎn)座元件選自Minos、mariner、Hermes、Sleeping Beauty和piggyBac。
Minos是一種在地中海果蠅中有活性的可轉(zhuǎn)座元件。它在美國(guó)專利5,840,865中描述，在此引入其完整內(nèi)容作為參考。在前述美國(guó)專利中描述了使用Minos來(lái)轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)。
Mariner是最初從果蠅中分離的轉(zhuǎn)座子，但是后來(lái)在數(shù)種無(wú)脊椎和脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。在國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/09817中描述了使用mariner來(lái)轉(zhuǎn)化生物體。
Hermes來(lái)源于普通的家蠅。在美國(guó)專利5,614,398中描述了它在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)中的用途，在此引入其完整內(nèi)容作為參考。
PiggyBac是來(lái)源于桿狀病毒宿主粉紋夜蛾的轉(zhuǎn)座子。Handler等人(1998)PNAS(USA)957520-5描述了它對(duì)地中海果蠅的種系轉(zhuǎn)化的用途。
基因轉(zhuǎn)移通過(guò)已證明的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的種系轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。所選擇的轉(zhuǎn)座子是Minos，已經(jīng)證明它作為地中海果蠅(Loukeris等人，1995年)和果蠅中的基因轉(zhuǎn)移載體起作用。在地中海果蠅中起作用的其它轉(zhuǎn)座子如piggyBac(McCombs等人，1998年)，可以用作替代物。在文獻(xiàn)(Loukeris等人，1995年)中詳細(xì)描述了地中海果蠅轉(zhuǎn)化方法。簡(jiǎn)言之，將含有由側(cè)翼為兩個(gè)轉(zhuǎn)座子末端的感興趣基因組成(如紅細(xì)胞生成素、加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)DNA序列)的轉(zhuǎn)座子的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)座酶來(lái)源(表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒、體外合成的編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA、或轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)本身)一起注射到囊胚前期的地中海果蠅胚胎中。在早期的胚胎中，轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子末端相互作用并且催化轉(zhuǎn)座子的切除以及在隨機(jī)位置上的重新整合到染色體中。通常，為了促進(jìn)轉(zhuǎn)基因蒼蠅的檢測(cè)，“標(biāo)記基因”如賦予顯性的、可見(jiàn)的或者可選擇的表型的基因也被包括在轉(zhuǎn)座子中。使用標(biāo)記基因表型在注射后的蒼蠅的后代中檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的蒼蠅，然后雜交到純合性。數(shù)種這些種屬，每一種包含在基因組的不同位置的插入，可以在涉及幾百個(gè)卵的注射的每個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中生產(chǎn)。
多個(gè)插入為了增加表達(dá)的水平，可以通過(guò)品種間雜交不同的轉(zhuǎn)基因株來(lái)構(gòu)造含有多個(gè)插入的株。這個(gè)過(guò)程可以使用平衡器染色體來(lái)促進(jìn)。平衡器染色體含有數(shù)個(gè)重疊的翻轉(zhuǎn)，一個(gè)或多個(gè)隱性致死因子突變和至少一個(gè)顯性可見(jiàn)突變。這些染色體抑制重組并可以用來(lái)保持和操縱攜帶數(shù)種突變基因的染色體。已經(jīng)描述了地中海果蠅平衡器染色體FiM1。通過(guò)在5號(hào)染色體的大區(qū)域內(nèi)抑制重組，可以用來(lái)構(gòu)建攜帶數(shù)種轉(zhuǎn)座子插入的5號(hào)染色體。
昆蟲(chóng)和啟動(dòng)子的選擇許多昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)適合于在本發(fā)明中使用，包括Bactrocera oleae(油橄欖蠅(olivefly))、Bactrocera orientalis(桔實(shí)蠅)、Heliothisarmigera(棉鈴蟲(chóng))、Trichoplusani(粉紋夜蛾)、Manduca Sexta(煙草天蛾)、Lobesia botrana(葡萄藤蛾)、Anopheles gambiae(蚊子)、Aedes aegypti(黃熱病蚊子)、Glossina morsitans(舌蠅)、Simuliumsp.(黑蠅)、Phlebotomus sp.(沙蠅)、Musca domestica(家蠅)和Ceratitis capitata(地中海果蠅)中的任一種。但是，優(yōu)選的是地中海果蠅。
優(yōu)選地，所用的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子。可以使用兩類供選擇的啟動(dòng)子誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括例如熱激啟動(dòng)子。優(yōu)選地，熱激啟動(dòng)子是昆蟲(chóng)熱激啟動(dòng)子，例如黑尾果蠅(Drosophila melanogaster)hsp 70啟動(dòng)子，它能驅(qū)動(dòng)基因在異種生物體中的表達(dá)，異種生物體包括地中海果蠅。本發(fā)明還包括使用地中海果蠅hsp70啟動(dòng)子(Papadimitriou等人，(1998)，Insect Mol Biol 7279-90)。供選擇的系統(tǒng)可以基于用抗生素四環(huán)素的誘導(dǎo)(Heinrich和Scott，PNAS 978229-8232，2000)。
熱激啟動(dòng)子通過(guò)提高培養(yǎng)地中海果蠅的條件的溫度來(lái)誘導(dǎo)。例如，在23-25℃，hsp70啟動(dòng)子處于低活性或者根本沒(méi)有活性。這使得昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育而沒(méi)有由生產(chǎn)異種蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的應(yīng)激。然而，在更高的溫度，如37-42℃，hsp70啟動(dòng)子被誘導(dǎo)并且高水平地表達(dá)異種蛋白質(zhì)。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以基于已知的誘導(dǎo)型基因控制元件來(lái)構(gòu)建。例如，可以通過(guò)結(jié)合反應(yīng)于藥物或激素的元件來(lái)構(gòu)造誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述藥物或激素可以在食物中用藥。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用人的雌激素效應(yīng)元件(ERE)來(lái)調(diào)節(jié)感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)，只要昆蟲(chóng)被表達(dá)人體雌激素受體的第二種編碼序列轉(zhuǎn)化。
組成型啟動(dòng)子也可以用來(lái)在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)和/或其它要求的蛋白質(zhì)。例如，組成型啟動(dòng)子可以是細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。黑尾果蠅細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子已經(jīng)被克隆(Act5C)并且在蚊子中是高度活躍的(Huynh和Zieler，(1999)，J.Mol.Biol.28813-20)。細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白基因及其啟動(dòng)子和可以從其它昆蟲(chóng)包括地中海果蠅中分離。
其它實(shí)例包括細(xì)胞質(zhì)微管蛋白啟動(dòng)子，例如地中海果蠅細(xì)胞質(zhì)微管蛋白啟動(dòng)子。
可以使用控制分泌的多肽的啟動(dòng)子，任選與適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列一起使用，來(lái)引導(dǎo)蛋白質(zhì)到血淋巴的分泌。例如，可以使用幼蟲(chóng)血清蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(Benes等人，(1995)Mol.Gen.Genet.249(5)545-56).
幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)地中海果蠅的大量飼養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)高度發(fā)達(dá)。現(xiàn)存的大量飼養(yǎng)設(shè)備每周生產(chǎn)10億只蒼蠅。這些蒼蠅用于通過(guò)不能繁殖的昆蟲(chóng)技術(shù)進(jìn)行地中海果蠅害蟲(chóng)控制在蛹階段通過(guò)暴露于輻射使它們不能繁殖，然后在現(xiàn)場(chǎng)釋放。
在25℃，地中海果蠅的生命周期約為25天，雌性通常產(chǎn)100-200個(gè)卵。作為所有完全變態(tài)的昆蟲(chóng)，地中海果蠅有四個(gè)不同的發(fā)育階段胚胎(持續(xù)約2天)、幼蟲(chóng)(約8天)、蛹(約10天)和成蟲(chóng)。在成蟲(chóng)壽命的4-6天內(nèi)完成性成熟。恰好在蛹化前，每個(gè)幼蟲(chóng)質(zhì)量約為10mg，含有約200毫克蛋白質(zhì)。
對(duì)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，通過(guò)合適的溫度變化方案，在不同時(shí)間開(kāi)始的幼蟲(chóng)培養(yǎng)可以同步進(jìn)行。這是可能的，因?yàn)樯L(zhǎng)速度取決于環(huán)境溫度；在18℃，幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速度降低約50％。
對(duì)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生產(chǎn)，使用更小的昆蟲(chóng)如果蠅是優(yōu)選的。雖然每個(gè)幼蟲(chóng)生產(chǎn)較少的蛋白質(zhì)，但是，生命周期短，可以迅速建立生產(chǎn)。例如，果蠅的生命周期12天，1毫克幼蟲(chóng)每次生產(chǎn)20微克蛋白質(zhì)。
僅僅為了舉例說(shuō)明，在下列實(shí)施例中描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1在地中海果蠅和果蠅幼蟲(chóng)中生產(chǎn)GFP已經(jīng)在地中海果蠅、地中海實(shí)蠅中以及實(shí)蠅黑尾果蠅中表達(dá)了來(lái)自水母Aequoria victoria編碼綠色熒光蛋白的基因。在其基因組中含有單一或多個(gè)Minos/GFP轉(zhuǎn)座子插入的轉(zhuǎn)基因果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)表現(xiàn)出GFP特征熒光。使用兩種GFP構(gòu)建體，一種具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(果蠅Hsp70)，一種具有組成型啟動(dòng)子(果蠅肌動(dòng)蛋白5C啟動(dòng)子)。具有Hsp70/GFP基因的果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)在通常的飼養(yǎng)溫度(22℃)下呈現(xiàn)低水平的熒光，在較高的溫度(39℃)下暴露1小時(shí)后呈現(xiàn)增高的熒光。具有肌動(dòng)蛋白5C/GFP基因的果蠅幼蟲(chóng)呈現(xiàn)組成型高水平的GFP熒光。GFP如果不是在果蠅和地中海果蠅的所有組織中表達(dá)，也會(huì)在大部分組織中表達(dá)。使用免疫印跡測(cè)定在轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)中也檢測(cè)到GFP蛋白質(zhì)。數(shù)種轉(zhuǎn)基因系的比較表明，GFP表達(dá)量取決于轉(zhuǎn)基因的整合位置和在基因組中存在的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)量。
材料和方法蠅和DNA注入將果蠅yw株和地中海實(shí)蠅A71株，w1基因?yàn)榧兒系陌籽壑暧糜谒械膶?shí)驗(yàn)中，蠅在標(biāo)準(zhǔn)條件下在22℃飼養(yǎng)。使用如前所述的囊胚前期的胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒表達(dá)轉(zhuǎn)座酶一起的DNA注入(Loukeris等人，1995，Science(科學(xué)))。
質(zhì)粒構(gòu)建和DNA分析質(zhì)粒pMiHsp70/GFP通過(guò)以適當(dāng)?shù)姆较蛳蛸|(zhì)粒pHSS6Hsp70PT的多個(gè)克隆位點(diǎn)插入含有GFP基因的PCR擴(kuò)增片斷而構(gòu)建。質(zhì)粒pHSS6Hsp70PT含有以適當(dāng)?shù)姆较蚺帕械膯?dòng)子和3’mRNA尾——黑尾果蠅的Hsp70基因的聚腺苷酸化信號(hào)(下文稱為‘終止子’)。啟動(dòng)子和終止子通過(guò)多個(gè)克隆位點(diǎn)分開(kāi)。為了提高mRNA的穩(wěn)定性，Hsp70啟動(dòng)子還含有Hsp70 mRNA的5’非翻譯前導(dǎo)序列。啟動(dòng)子/GFP/終止子盒然后作為NotI片斷克隆到含有地中海果蠅白色基因的野生型cDNA的Minos載體中、(Loukeris等人，1995，Science(科學(xué)))。白色基因用作檢測(cè)轉(zhuǎn)化體的主要可見(jiàn)基因標(biāo)記(Loukeris等人，1995，Science(科學(xué)))。PMiHspGFP/HspCcW轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)表示在
圖1中。
質(zhì)粒pMiAct5CGFP(圖2)包含含有Actin5C基因的啟動(dòng)子的黑尾果蠅2kb片斷下游的GFP基因，它編碼了普通表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白。質(zhì)粒pMiAct5CGFP不含白色基因作為主要標(biāo)記，用這種質(zhì)粒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體僅以GFP的表達(dá)鑒別(見(jiàn)下文)。
在典型的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中，轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA與輔助質(zhì)粒DNA的混合物被共同注射到眼睛顏色突變?yōu)榘咨募兒瞎壔虻刂泻９壍哪遗咔捌诋a(chǎn)卵后0-1小時(shí)的胚胎中。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的地中海果蠅，來(lái)自被注射胚胎的蠅(G0代)通過(guò)與受體株回交來(lái)繁殖，并且分別檢驗(yàn)它們的后代在幼蟲(chóng)階段表達(dá)白色基因(用pMiHspGFP/HspCcW注射的蠅)或GFP(用pMiAct5CGFP注射的蠅)。白色的表達(dá)由于眼睛顏色從白色變成有色(從淺黃到野生型紅色變化)可以檢測(cè)。GFP的表達(dá)可以在使用標(biāo)準(zhǔn)表面熒光顯微術(shù)在39℃每隔1天進(jìn)行的兩次連續(xù)的1小時(shí)熱處理后的幼蟲(chóng)組織中檢測(cè)GFP特異性熒光來(lái)監(jiān)測(cè)。
各個(gè)轉(zhuǎn)基因幼蟲(chóng)(G1代)通過(guò)與受體株回交來(lái)繁殖，白色或GFP-表達(dá)后代(G2)種間雜交產(chǎn)生純合后代(G3)。眼睛顏色的強(qiáng)度或GFP熒光的強(qiáng)度取決于基因劑量。所以通過(guò)下列這些表型在G3后代中檢測(cè)純合個(gè)體。使推定的純合G3進(jìn)行種間雜交，并用DNA印跡分析它們的后代，以確定它們是否含有單一或多個(gè)插入。通過(guò)這種過(guò)程確立了用于單一插入的純合株。
GFP在果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)中的熱誘導(dǎo)型表達(dá)與未轉(zhuǎn)基因的幼蟲(chóng)相比，在22-24℃的標(biāo)準(zhǔn)溫度生長(zhǎng)的對(duì)MiHspGFP/HspCcW轉(zhuǎn)座子的插入為純合的轉(zhuǎn)基因果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)呈現(xiàn)出低的GFP熒光水平，但是可以檢測(cè)到。在熱激后熒光急劇增強(qiáng)(圖3)。
GFP在果蠅中的組成型表達(dá)與未轉(zhuǎn)移基因的成蟲(chóng)蠅(圖4)和幼蟲(chóng)(圖6)相比，在22-24℃的標(biāo)準(zhǔn)溫度生長(zhǎng)的MiAct5CGFP轉(zhuǎn)座子的插入為純合的轉(zhuǎn)基因果蠅同型結(jié)合表現(xiàn)出高的GFP熒光水平。該熒光水平是基因劑量依賴性的(圖5)。
在超過(guò)1000只用MiAct5CGFP注射的G0的后代中檢測(cè)到?jīng)]有GFP表達(dá)的地中海果蠅。我們推斷，果蠅肌動(dòng)蛋白5C啟動(dòng)子在地中海果蠅中是一種弱啟動(dòng)子，并且在地中海果蠅中必須使用同源的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，以獲得高含量的異種蛋白的組成型表達(dá)。
對(duì)于GFP表達(dá)，將數(shù)種對(duì)MiAct5CGFP為純合的果蠅轉(zhuǎn)基因系相互比較。雖然所有的系表現(xiàn)高熒光水平，但是可以檢測(cè)到強(qiáng)度方面的各系特有的差異。
對(duì)于Hsp70熱激基因，在黑尾果蠅啟動(dòng)子的下游克隆編碼hGH的cDNA序列。Hsp70啟動(dòng)子還包含Hsp70mRNA的5’非翻譯前導(dǎo)序列，以提高mRNA穩(wěn)定性。黑尾果蠅Hsp70的3’非翻譯含有聚腺苷酸化信號(hào)，它在hGH編碼序列的下游克隆。在也含有標(biāo)記構(gòu)建體的Minos載體中插入該構(gòu)建體。該標(biāo)記構(gòu)建體由被黑尾果蠅Hsp770啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的來(lái)自Aequoria victoria的綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)基因組成，并含有Hsp70的3’區(qū)。這種標(biāo)記給予轉(zhuǎn)基因生物體可見(jiàn)的基因型(GFP熒光)，并用于在胚胎、幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)階段檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的地中海果蠅。所以，完全的轉(zhuǎn)座子的總體結(jié)構(gòu)為Minos左反向重復(fù)-hGH表達(dá)構(gòu)建體-GFP標(biāo)記表達(dá)構(gòu)建體-Minos右反向重復(fù)。
在BlueScript載體中在大腸桿菌中構(gòu)建轉(zhuǎn)座子。
編碼Minos轉(zhuǎn)座酶的體外合成mRNA在轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中用作轉(zhuǎn)座酶來(lái)源。使用含有從噬菌體T7啟動(dòng)子和市售T7RNA聚合酶在下游克隆的轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)載體質(zhì)粒作為模板體外合成mRNA。通過(guò)從表達(dá)Minos轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因黑尾果蠅得到的Minos mRNA的反向轉(zhuǎn)錄，獲得了完全未間斷的編碼Minos轉(zhuǎn)座酶的DNA序列。
含有轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒DNA與Minos轉(zhuǎn)座酶mRNA一起共同注射到囊胚前期(產(chǎn)卵后0-1小時(shí))胚胎中。在文獻(xiàn)中(Loukeris等人，1995年)已經(jīng)描述了地中海果蠅胚胎處理和注射的條件。在這些條件下，預(yù)計(jì)由注射后的胚胎衍生的能繁殖的蠅的10-20％能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的地中海果蠅，由注射后的胚胎(G0代)衍生的蠅與受體株回交來(lái)繁殖，并且單個(gè)檢測(cè)它們的后代GFP表在幼蟲(chóng)階段的GFP表達(dá)可以使用標(biāo)準(zhǔn)表面熒光顯微術(shù)39℃下每隔1天進(jìn)行的在兩次連續(xù)的1小時(shí)熱處理后的幼蟲(chóng)組織中檢測(cè)GFP特異性熒光來(lái)完成。
通過(guò)回交到受體株中培養(yǎng)個(gè)體轉(zhuǎn)基因幼蟲(chóng)(G1)，并使個(gè)體GFP表達(dá)后代(G2)雜交，以產(chǎn)生純合的后代(G3)。純合的G3個(gè)體通過(guò)定量表面熒光顯微術(shù)測(cè)量GFP表達(dá)可以檢測(cè)。建立單一插入為純合的株。
在這些轉(zhuǎn)基因株中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的量不僅取決于啟動(dòng)子和誘導(dǎo)條件，而且取決于轉(zhuǎn)基因插入點(diǎn)。對(duì)于hGH表達(dá)水平，測(cè)試了數(shù)種獨(dú)立獲得的株(即從不同G0蠅衍生的株)，并且表現(xiàn)最高水平的株在分子和細(xì)胞遺傳水平上進(jìn)一步體現(xiàn)其特征。分子鑒定由DNA分析和轉(zhuǎn)基因的克隆和測(cè)序組成，后兩種是對(duì)于最終用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)株的。細(xì)胞遺傳鑒定通過(guò)在唾腺多線染色體上原位雜交，以確定插入的染色體點(diǎn)而完成。
為了構(gòu)建有多個(gè)插入的株，在不同株的成員間進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾s交。這些雜交的后代進(jìn)行品種間雜交，并使用GFP作為標(biāo)記重獲多個(gè)純合個(gè)體。取決于插入的染色體位置，攜帶平衡器染色體的株可以用來(lái)促進(jìn)這些構(gòu)建。需要3-4代來(lái)構(gòu)建具有多個(gè)插入的穩(wěn)定株。
根據(jù)已建立的程序進(jìn)行幼蟲(chóng)的大規(guī)模喂養(yǎng)。用半干食物喂養(yǎng)幼蟲(chóng)，這些半干食物由添加酵母的糠堿(bran base)組成。通過(guò)合適的溫度變化使幼蟲(chóng)生長(zhǎng)同步，并將第三齡期幼蟲(chóng)在39-41℃處理最大誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因所需的時(shí)間。使第三齡期晚期的幼蟲(chóng)離開(kāi)食物，尋找蛹化的地點(diǎn)。這種行為用于在規(guī)模喂養(yǎng)設(shè)備中從規(guī)模蠅生產(chǎn)的食物中收獲幼蟲(chóng)；它還可以用于收獲不用食物的幼蟲(chóng)以便進(jìn)行蛋白生產(chǎn)和純化。
地中海果蠅幼蟲(chóng)用冷凍鹽水洗滌，然后在蛋白酶抑制劑的存在下均質(zhì)化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從均質(zhì)化物中提純hGH。
實(shí)施例3在地中海幼蟲(chóng)中生產(chǎn)camelid抗體設(shè)計(jì)用于在幼蟲(chóng)血淋巴中表達(dá)蛋白質(zhì)的載體表示在圖7中。Lsp/L是果蠅或地中海果蠅幼蟲(chóng)血清蛋白質(zhì)(Lsp)基因的啟動(dòng)子(Benes等人，(1995)，Mol.Gen.Genet.249(5)545-56)，然后是Lsp5’非翻譯前導(dǎo)序列(條形框)和Lsp信號(hào)肽(黑框)。感興趣的基因，在這種情況下是camelid抗體基因，在框中融合到前導(dǎo)肽中。HspP和HspT分別是熱激70基因啟動(dòng)子和終止子。CcW是地中海果蠅白色基因，用作檢測(cè)轉(zhuǎn)化體的顯性可見(jiàn)標(biāo)記。MiL和MiR是Minos元件的末端。
從噬菌體表達(dá)庫(kù)(Unilever)分離camelid抗體。該抗體對(duì)于豬逆轉(zhuǎn)錄病毒PERV(豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒)是特異的并且識(shí)別PERV gag蛋白質(zhì)(病毒核心蛋白質(zhì))的p30成分。p30克隆在表達(dá)載體pHEN1中表達(dá)，以便獲得篩選抗體庫(kù)的抗原，因此選擇抗體克隆。在本實(shí)驗(yàn)中所用的抗體的預(yù)知序列和翻譯在圖8中列出。
與實(shí)施例1一樣，由白色基因表達(dá)鑒別轉(zhuǎn)基因蠅。在轉(zhuǎn)基因蠅幼蟲(chóng)的血淋巴中檢測(cè)抗體的表達(dá)。
通過(guò)均質(zhì)化幼蟲(chóng)提取物并由蛋白A柱層析純化抗體。免疫球蛋白在pH為8.6時(shí)結(jié)合到蛋白A，并在pH為4.3時(shí)從柱中洗脫。因此，通過(guò)降低蛋白A柱的pH值完成了洗脫。蛋白A瓊脂糖(0.25g；Sigma)在三氨基甲烷鹽酸緩沖的鹽水(0.05M三氨基甲烷鹽酸緩沖液，0.15MNaCl，pH值為8.6)中溶脹，然后裝入柱(柱床體積為1毫升)。通過(guò)加入稀釋NaOH溶液把培養(yǎng)物上清液調(diào)節(jié)到pH值為8.6，然后在4℃用600g離心30分鐘。在裝載樣品后，蛋白A柱用pH值為8.6的三氨基甲烷鹽酸緩沖鹽水洗滌，直到?jīng)]有蛋白質(zhì)從柱中洗脫。然后，用PBS(0.05M磷酸鹽/0.15MNaCl，pH值為7.0)、檸檬酸鹽緩沖液(0.05M檸檬酸鹽/0.15M NaCl，pH值為5.5)和醋酸鹽緩沖液(0.05M醋酸鹽/0.15M NaCl，pH值為4.3)逐步洗脫，直到洗脫出抗體。收集對(duì)應(yīng)于A280峰的部分，在0.01xPBS中滲析，凍干，在500微升PBS中重新溶解，并在-70℃儲(chǔ)存。通過(guò)SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)峰的純度。通過(guò)用甘氨酸緩沖液(0.05M甘氨酸/HCl/0.15M NaCl，pH值為2.3)洗滌，然后用三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH值為8.6，含有0.02％的NaN3)洗滌再生所述柱。
使用如上所生產(chǎn)的固定化的p30抗原和標(biāo)記的鼠科抗camelid單克隆抗體進(jìn)行ELISA測(cè)定。因此證實(shí)了從PERVp30的地中海果蠅洗脫的抗體的特異性。
實(shí)施例4在地中海果蠅幼蟲(chóng)中人α-葡糖苷酶的生產(chǎn)構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例1的熱激誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)座子表達(dá)系統(tǒng)，使用人α-葡糖苷酶基因(GenBank GI182907)代替GFP基因。
與實(shí)施例1一樣，轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA和輔助質(zhì)粒DNA的混合物被共同注射到用于眼睛顏色突變?yōu)榘咨募兒瞎壔虻刂泻９壍哪遗咔捌?產(chǎn)卵后0-1小時(shí))的胚胎中。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因地中海果蠅，由來(lái)自被注射胚胎的蠅(G0代)通過(guò)回交到受體株繁殖，在幼蟲(chóng)階段分別檢測(cè)后代中白色基因的表達(dá)。在眼睛顏色從白色變成有色(從淺黃變成野生型紅色)時(shí)，可以檢測(cè)白色基因的表達(dá)。
通過(guò)回交到受體株繁殖個(gè)體轉(zhuǎn)基因幼蟲(chóng)(G1)，并使個(gè)體白色基因后代(G2)雜交，以產(chǎn)生純合后代(G3)。眼睛顏色的強(qiáng)度取決于基因劑量。所以，在G3后代中，通過(guò)下列這些表型檢測(cè)純合的個(gè)體。使推定的純合G3個(gè)體雜交，并且對(duì)它們的后代進(jìn)行DNA印跡分析，以確定它們是合有單一的插入，還是含有多個(gè)插入。單一插入的純合株通過(guò)這種方法建立。
α-葡糖苷酶在果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)中的熱誘導(dǎo)型表達(dá)根據(jù)Umapathysivam等人，Clin Chem 200046(9)1318-25的免疫定量法所評(píng)估的，與在脂墊中的未轉(zhuǎn)基因幼蟲(chóng)相比，在22-24℃的標(biāo)準(zhǔn)溫度下生長(zhǎng)的對(duì)MiHspα-葡糖苷酶/HspCcW轉(zhuǎn)座子的插入為純合子的轉(zhuǎn)基因果蠅和地中海果蠅幼蟲(chóng)表現(xiàn)出低但可以檢測(cè)α-葡糖苷酶量。α-葡糖苷酶在熱激后明顯增加。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)用能在昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)中表達(dá)所述蛋白質(zhì)的非病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)；(b)繁殖昆蟲(chóng)，以生產(chǎn)幼蟲(chóng)；(c)培養(yǎng)幼蟲(chóng)；和(d)從所述幼蟲(chóng)中分離所述蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，轉(zhuǎn)化所述昆蟲(chóng)包括下列步驟a)提供編碼轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)座的元件，所述轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)中是有活性的；b)通過(guò)插入編碼所述的蛋白質(zhì)的編碼序列修飾可轉(zhuǎn)座的元件；和c)用修飾的可轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)化目標(biāo)昆蟲(chóng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中，可轉(zhuǎn)座的元件選自Minos、mariner、Hermes，s1eeping beauty和piggyBac。
4.根據(jù)前面的權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，所述表達(dá)系統(tǒng)包括在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中操作性的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄控制元件的控制下編碼所述的蛋白質(zhì)的編碼序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中，誘導(dǎo)型控制系統(tǒng)可以通過(guò)四環(huán)素或雌激素調(diào)節(jié)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)的方法，其中，所述表達(dá)系統(tǒng)包括在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中操作性的組成型轉(zhuǎn)錄控制元件的控制下編碼所述的蛋白質(zhì)的編碼序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中，組成型控制元件選自細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，如Drosophila Act5C和細(xì)胞質(zhì)微管蛋白啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中，所述誘導(dǎo)型表達(dá)控制序列是熱激啟動(dòng)子，如果蠅或地中海果蠅hsp70啟動(dòng)子。
9.根據(jù)前面的權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)品主要在脂肪體或血淋巴中聚集。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中，幼蟲(chóng)血清蛋白質(zhì)啟動(dòng)子指導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)品到血淋巴的分泌，Hsp70啟動(dòng)子用于在脂肪體內(nèi)表達(dá)。
11.根據(jù)前面的權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，所述昆蟲(chóng)用兩種或多種表達(dá)系統(tǒng)，或者一種包含兩種或多種編碼序列的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中，通過(guò)使用平衡器染色體促進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)的保留。
13.根據(jù)前面的權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，所述蛋白質(zhì)選自酶、細(xì)胞因子、激素或蛋白質(zhì)藥品。
14.根據(jù)前面的權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，所述昆蟲(chóng)選自Bactrocera oleae(橄欖蠅)、Bactrocera orientalis(東方實(shí)蠅)、Heliothis armigera(棉鈴蟲(chóng))、Trichoplusa ni(粉紋夜蛾)、Manducasexta(煙草天蛾)、Lobesia botrana(葡萄藤蛾)、Anophelesgambiae(蚊子)、Aedes aegypti(黃熱病蚊)、Glossina morsitans(舌蠅)、Simulium sp.(黑蠅)、Phlebotomus sp.(沙蠅)、Muscadomestica(家蠅)和Ceratitis capitata(地中海果蠅)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述昆蟲(chóng)是地中海果蠅。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中，所述昆蟲(chóng)是黑尾果蠅。
17.根據(jù)前面的權(quán)利要求的任一項(xiàng)的方法，其中，通過(guò)培育溫度的操縱使幼蟲(chóng)培育同步。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，它包括用能在昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)中表達(dá)所述蛋白質(zhì)的非病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)；繁殖所述昆蟲(chóng)以產(chǎn)生幼蟲(chóng)；培養(yǎng)該幼蟲(chóng)；和從所述幼蟲(chóng)中分離所述蛋白質(zhì)。這種轉(zhuǎn)化借助于轉(zhuǎn)座子載體可以有利地進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1399685SQ0081455
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年10月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月19日
發(fā)明者羅杰·克雷格, 查拉拉姆波斯·薩瓦基斯 申請(qǐng)人:米諾斯生物系統(tǒng)有限公司