專利名稱：：金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種真菌代謝產(chǎn)物的培育使用方法，尤其是一種有抑菌、殺菌作用的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育及使用方法，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：白粉病是一種作物常見病，主要由真菌感染作物葉片。發(fā)病時，葉上先出現(xiàn)褪綠小點，再發(fā)展為有白色絮狀物的不規(guī)則粉斑，霉層由稀疏至稠密呈氈狀，病斑擴大連片，直至覆滿整個葉面，可使葉片變黃褐枯死，亦影響植物的莖、葉柄及果實。白粉病的發(fā)病周期短，一年會反復感染多次，且發(fā)病后病情都很嚴重，該病對農(nóng)作物生產(chǎn)的危害性很大。防治此病除了清理病枝、病葉，集中處理燒毀，添加肥料加強作物的抗病能力外，還配合用殺菌劑。常用微生物殺菌劑是一類控制植物病原菌的制劑，主要有農(nóng)用抗生素、細菌殺菌劑、真菌殺菌劑和病毒殺菌劑等化學殺菌類型。微生物殺菌劑主要抑制病原菌能量產(chǎn)生、干擾生物合成和破壞作物病原菌細胞結(jié)構(gòu)。內(nèi)吸性強、毒性低，有的兼有刺激植物生長的作用。微生物殺菌劑防治植物病害的機理隨生防菌及其代謝產(chǎn)物的種類及植物與病原菌的變化而異。其中主要的機制有竟爭作用、拮抗作用、重寄生作用和誘導植物抗性，或兩種以上機制的協(xié)同作用。但是白粉病的抗藥性較強和常發(fā)性，采用一般藥劑的預防效果較差，且有一定毒性，容易污染環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對目前農(nóng)作物生產(chǎn)中危害性大、抗藥性強、一般藥劑防治效果差的白粉病病害，提出一種金龜子綠僵菌小孢子亞種GXW26-8代謝產(chǎn)物一一綠僵霉素生物殺菌劑的殺菌培育及使用方法，該生物殺菌劑可以高效殺滅白粉病菌，并且安全環(huán)保。本發(fā)明涉及的金龜子綠僵菌小孢子亞種GXW26-8菌林，于2004年10月10曰在中國湖北省武漢大學、中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC保藏，保藏編號為CCTCCNO:M204078，拉丁學名為i/e"r力/z/咖a/z/^//2'aevar.GXW26—8(下文筒稱GXW26—8)。本發(fā)明GXW26-8代謝產(chǎn)物綠僵霉素培育方法采用2級培養(yǎng)法，包括以下步驟A.將馬鈴薯與蔗糖混合裝入容器中，其中蔗糖的重量百分比為18-22%,滅菌后溫度達28-32。C時接種GXW26-8,常溫培養(yǎng)15-20天采收取孢子；B.將馬鈴薯中加水煮沸后過濾，在濾液中加入重量百分比18-22%的蔗糖，滅菌后得到培養(yǎng)液；C.待培養(yǎng)液冷卻至28-32。C時，將步驟A所得孢子在無菌條件下接種至培養(yǎng)液中，經(jīng)發(fā)酵后儲存一個月以上，得到GXW26-8代謝產(chǎn)物；D.用篩網(wǎng)過濾步驟C所得GXW26-8代謝產(chǎn)物，濾液灌裝入瓶，即得到本發(fā)明的生物殺菌劑一一GXW26-8代謝產(chǎn)物綠僵霉素。之后可以按需E.將濾液稀釋后噴灑至病菌感染的環(huán)境中。觀察發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌小孢子亞種GXW26-8菌抹在發(fā)酵過程中出現(xiàn)以下現(xiàn)象初發(fā)酵時，發(fā)酵液為青灰色液體；IO小時后逐漸轉(zhuǎn)為乳白色，發(fā)酵液的濃度和粘度較初發(fā)酵增4-5倍，持續(xù)時間達150個小時左右；進入約200個小時后，在乳白色液體下部逐漸有沉淀物形成，并在貯液罐中部形成絲狀聚合物，最后聚合成塊狀半透明具有很強拉力的多糖蛋白塊；上部逐漸形成桔黃色的液體，性質(zhì)穩(wěn)定耐貯，具有抗菌、抑菌、殺菌現(xiàn)象。分析得出桔黃色液體為綠僵菌素，通過試驗發(fā)現(xiàn)綠僵菌素能夠抑制和殺滅多種霉菌，尤其對白粉病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達100%,時間長達5-7天，作為作物已發(fā)白粉病的冶療劑使用，用藥后4-6小時內(nèi)白粉病菌絲和孢子變成黑色，失去活力，病指下降為零級，藥效期6天左右。經(jīng)大量室內(nèi)外生測和防病試驗表明，綠僵菌素是一種新型微生物殺菌劑，具有殺菌速度快、防治效果高、對環(huán)境無污染、對靶標以外的生物無毒害的特點。制劑生化合成速度快、生產(chǎn)成本低、無三廢排放、兼有固體發(fā)酵的孢子殺蟲，從2003年至今進行室內(nèi)外多次生測表明GXW26-8的孢子粉可以防治多種鱗翅目害蟲，其中對抗藥較強的斜紋夜蛾、銀紋夜蛾3齡以下幼蟲防治效果均在85%以上。圖1為本發(fā)明優(yōu)選實施例一綠僵菌素的紫外光鐠圖。圖2為本發(fā)明優(yōu)選實施例一綠僵菌素的熒光光譜圖。具體實施例方式實施例一本實施例所用的金龜子綠僵菌小孢子亞種GXW26-8菌林，于2004年10月10日在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC保藏，保藏編號為CCTCCNO:M20術(shù)8，拉丁學名為Metarhiziumanisopliaevar.anisopliaGXW26-8。GWX26-8代謝物綠僵菌素的殺菌培育及使用方法采取2級培養(yǎng)法，步驟如下A.將馬鈴薯與蔗糖按重量比5:1裝入200ml扁形耐高壓瓶中，在15磅高壓條件下滅菌20分鐘后，當溫度降到28-32。C時，接種GXW26-8，常溫下培養(yǎng)15-20天采收孢子；B.將馬鈴薯與水按重量比約1:2混合，煮沸30分鐘后進行過濾，在濾液中加入20%蔗糖，滅菌20分鐘，得到培養(yǎng)液；C.待培養(yǎng)液自然冷卻至28-32。C時，將步驟A中所得孢子于無菌條件下接種至培養(yǎng)液中，在溶氧15%、PH7、溫度30。C的條件下發(fā)酵79小時，抽樣測定，當酵液中GXW26-8菌含量大于500億個/ml時，發(fā)酵合格。再經(jīng)過40天以上，溫度30°C的儲存得到殺菌劑，即GXW26-8代謝產(chǎn)物；對GXW26-8代謝產(chǎn)物進行成分定量分析1.PH測定儀器PHS-3TS精密測定儀；方法標準緩沖液;歐正后測定；結(jié)果PH=6.84。2.紫外、熒光光語測定儀器島津-紫外分光光度儀、島津-熒光分光光度^f義；方法以雙蒸水為參比溶液，分別測定200-800nm波長處紫外、熒光的光譜吸收，見附圖l和附圖2;結(jié)果樣品無明顯紫外吸收，在400nm波長處有熒光吸收。3.成分分析儀器Heraeus低溫高速離心機；Termo超低溫冰箱；Christ冷凍干燥機；方法8000rpm，10min將樣品分離得上清及沉淀；在-80。C將樣品預凍4h，然后置冷凍千燥機中干燥，分別得到上清和沉淀的凍干粉，稱重；上清桔黃液體為53,6mg/ml。(l)粗蛋白含量方法考馬斯亮藍法；樣品處理采用考馬斯亮藍法試劑盒，以標準蛋白為對照，根據(jù)蛋白含量(g/L)=測定管0灘—空白管⑨值x標準管濃度(g/L),計算。吝里、S/標準管oz)值—空白管OZ)值"^巨'4乂夂、s',，,開蛋白含量。(2)測定結(jié)果未檢出蛋白含量。4.凱氏定氮法(1)樣品處理樣品與疏酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用i硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。(2)測定結(jié)果上清桔黃液體蛋白含量O.938mg/ml。5.測定多壽唐(1)樣品處理多糖在濃石危酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，然后用比色法測定其多糖含量。(2)測定結(jié)果上清桔黃液體多糖含量51mg/ml。6.元素分析(1)樣品處理用MICRO元素分儀分析樣品。(2)測定結(jié)果Cc/。54.12%、Hc/。8.56c/。、Nc/。0.27%。D.對步驟C中所得殺菌劑進行200目篩網(wǎng)過濾得到桔黃色均一液體，灌裝入棕色塑料瓶或鋁鉑罐中，常溫貯存；E.將濾液稀釋后噴灑至細菌感染的環(huán)境中，作為植物白粉病抑菌劑使用，按照l:IOO倍液噴霧；作為植物白粉病治療劑使用，按1:150倍液噴霧。殺菌劑的抗菌活性見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中a表示活性較強、b表示中等活性、c表示活性不明顯、d表示沒有活性。數(shù)據(jù)表明GXW26-8代謝產(chǎn)物綠僵菌素作為殺菌劑的藥效明顯?？傊囼炞C明綠僵菌素不僅可有效預防和治療白粉病對作物產(chǎn)生的危害，還能殺滅多種農(nóng)作物病菌，是一種理想的^t生物殺菌劑，具有殺菌速度快、防治效果高、對環(huán)境無污染、對靶標以外的生物無毒害的特點，其制劑生化合成速度快、生產(chǎn)成本低、無三廢排放，環(huán)保、安全。權(quán)利要求1.金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育方法，其步驟為A.將馬鈴薯與蔗糖混合裝入容器中，其中蔗糖的重量百分比為18-22％，滅菌后溫度達28-32℃時接種GXW26-8，常溫培養(yǎng)15-20天采收取孢子；B.將馬鈴薯中加水煮沸后過濾，在濾液中加入重量百分比18-22％的蔗糖，滅菌后得到培養(yǎng)液；C.待培養(yǎng)液冷卻至28-32℃時，將步驟A所得孢子在無菌條件下接種至培養(yǎng)液中，經(jīng)發(fā)酵后儲存一個月以上，得到GXW26-8代謝產(chǎn)物；D.用篩網(wǎng)過濾步驟C所得GXW26-8代謝產(chǎn)物，濾液灌裝入瓶，即得到生物殺菌劑GXW26-8代謝產(chǎn)物綠僵霉素。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育方法，其特征在于所述步驟C在溶氧15。/。、PH6-8、溫度范圍28-32。C的環(huán)境下發(fā)酵72-80小時。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育方法，其特征在于所述步驟C發(fā)酵后的發(fā)酵液中GXW26-8菌抹含量大于500億/ml;在25-32。C溫度下儲存發(fā)酵液。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育方法，其特征在于所述步驟D中篩網(wǎng)為200目。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的使用方法，其特征在于還包括步驟E.將得到的生物殺菌劑GXW26-8代謝產(chǎn)物綠僵霉素稀釋后噴灑至病菌感染的環(huán)境中。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的使用方法，其特征在于所述步驟E中稀釋的倍數(shù)為1:80-150倍。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物綠僵菌素作為生物殺菌劑的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種有抑菌、殺菌作用的金龜子綠僵菌小孢子亞種代謝產(chǎn)物的殺菌培育及使用方法，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明通過2級培養(yǎng)法得到綠僵菌素并作為殺菌劑使用，試驗證明綠僵菌素不僅可有效預防和治療白粉病對作物產(chǎn)生的危害，還能殺滅多種農(nóng)作物病菌，是一種理想微生物殺菌劑，具有殺菌速度快、防治效果高、對環(huán)境無污染、對靶標以外的生物無毒害的特點，其制劑生化合成速度快、生產(chǎn)成本低、無三廢排放，環(huán)保、安全。文檔編號C12P17/18GK101445818SQ200810155749公開日2009年6月3日申請日期2008年10月9日優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日發(fā)明者晶周,沈迎春,燕高,高小文申請人:高小文