專利名稱：極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平板篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物學、基因工程、生物技術等領域，具體涉及極 耐熱葡聚糖酶重組菌固相平板篩選方法。
背景技術：
世界上每年生成1500-2000億噸植物性有機物，其中約一半為 纖維素物質，如何將纖維素物質降解轉化為糖、乙醇、甲烷等容易利 用的小分子有機物是當前國際上的重大課題之一。目前，對纖維素的 降解利用主要采用酸堿化處理等化學手段，以及汽爆及蒸氣加熱等物 理手段。生物法由于對設備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，對環(huán) 境污染較小等特點而備受重視。由于耐熱細菌可生長于高溫環(huán)境，培 養(yǎng)過程中不易受常溫微生物的污染等優(yōu)點，分離和篩選多功能的高效 纖維素產(chǎn)生菌就顯得尤為重要，特別是它產(chǎn)生的纖維素酶具有較好的 熱穩(wěn)定性，提高反應溫度可加快降解速度，因此耐熱纖維素酶在高溫 領域具有廣泛的應用前景。
高溫酶的重要研究價值熱穩(wěn)定性酶在工業(yè)上已被廣泛應用，它 與常溫酶類相比有以下優(yōu)點1、高溫下的熱穩(wěn)定性，大多數(shù)酶在70
ll(TC溫度范圍內進行，這樣可減少污染的危害。2、室溫下較長的貯存期，盡可能長的存放期對商品酶制劑尤為重要，尤其是用于診斷試
劑中的酶類對貯存期要求更高。3、較高的抗化學變性作用， 一般而 言，蛋白質的熱穩(wěn)定性越好，其化學變性的可能性就越小。4、高溫 下的高活性，雖然普通酶類在37。C以下其催化反應速度隨著溫度上 升而加大，但耐熱性酶類隨溫度上升其活性增加的程度比普通酶類更 為顯著，溫度增加使反應體系粘度降低，進一步促進傳質效率。有時 較高的溫度還促使酶催化可逆反應朝著合成目標產(chǎn)物方向進行。5、 易于大規(guī)模生產(chǎn)及純化，由于熱穩(wěn)定性的酶大都來到于嗜熱和極端嗜 熱微生物，這些微生物往往難以進行大規(guī)模培養(yǎng)，或需要高溫發(fā)酵設 備，因此需要利用基因工程技術構建能高效表達高溫酶的常溫重組工 程菌，后者因在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的宿主蛋白質絕大多數(shù)對熱不穩(wěn)定， 因此只要將工程菌的培養(yǎng)液進行一步熱處理就可方便地純化異源高 溫酶蛋白。
定向進化技術在改造酶的熱穩(wěn)定性方面己表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性， 而將這一技術應用在葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的改造上在國內外的報道還 很少。采用定向進化技術對葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性進行改造的過程中， 首先需要解決的問題是如何建立高通量的篩選方法，從突變體庫快速 篩選到熱穩(wěn)定性提高的突變體。
在過去幾年，針對不同的實驗目的建立了許多有應用價值的的篩 選方法，如Joo等(1999)建立的固相平板篩選方法，Mastumura等(1999) 建立的濾膜為基礎的篩選方法，Nathalie Declerck等(2000)、 LoRiGIVER等(1998)和Cherry等(1999)建立的微孔板篩選方法。隨著
蛋白質定向進化技術的發(fā)展，又出現(xiàn)了許多新的高通量篩選技術，如
Amstutz等(2001)建立的核糖體展示技術和mRNA展示技術；Kim等 (2001)建立的細胞表面展示技術；Forrer等(1999)建立的噬菌體表面展 示技術；Firestine等(2001)建立的將靶活力與轉錄信號相偶聯(lián)的三雜 交體系；Heruberg等(2000)建立的發(fā)光信號為指示的反射增進系統(tǒng)； Sounllllion等(2001)建立的熒光共振能量轉換儀任(FRET); Ghadessv 等(2001)建立的隔室化自復制技術等[11]。
對于熱穩(wěn)定性突變體的篩選，目前常用的為96孔板(Nathalie Declerek， 2000: LoRiGIVER， 1998)，平板篩選方法(Zhao Huimin et al， 1999; Toyamaetal, 1999; Hajime shibuya， 2000;肖志壯，2001) 和超薄層瓊脂板擴散法。但用96孔板篩選耐高溫酶時，必須將菌落 單個挑入96孔板進行培養(yǎng)，然后對培養(yǎng)液進行熱處理和酶活力測定， 這樣做費時費力，而且由于所用的帶色底物很貴，導致檢測費用較高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平板篩 選方法，該篩選方法根據(jù)葡聚糖酶在含有適量剛果紅的平板上水解固 相中的羧甲基纖維素可以產(chǎn)生透明圈的原理設計，篩選方法簡單，篩 選省時省力。
本發(fā)明的技術解決方案是該篩選方法依以下步驟進行
(1)將直徑9 cm的尼龍膜夾在兩層濾紙中間進行常規(guī)121。C滅
菌，15 min;
(2)極耐熱葡聚糖酶重組菌為五.co//JM109BL21 (DE3) pET-20b
一Cell2B，用接種環(huán)挑取一環(huán)重組菌在5mL的LB液體培養(yǎng)基中振 搖培養(yǎng)6小時；其中，LB液體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化鈉10.0g，調節(jié)pH至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高 壓滅菌，冷卻至55"加入氨芐青霉素100mg;其中，LB液體培養(yǎng) 基中氨芐青霉素終濃度為100pg/mL;
(3) 將4jal的濃度5jxg/mL的IPTG均勻地涂在直徑9 cm培養(yǎng)皿 的LB固體培養(yǎng)基上，37"C正放2—3小時；其中，LB固體培養(yǎng)基配 制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g，調pH 至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，冷卻至55。C加入氨芐青 霉素100mg，搖勻后倒平板；其中，LB固體培養(yǎng)基中氨芐青霉素終 濃度為100pg/mL;
(4) 將第二步獲得的菌液均勻地涂在第三步己涂有IPTG的LB 固體平板上，37。C培養(yǎng)15小時，使每個平板長出50個左右的菌落；
(5) 第四步培養(yǎng)好的平板4-C放置l-2小時；
(6) 菌落的原位膜轉印取第一步中尼龍膜置于第五步的平板上 影印菌落；37'C繼續(xù)培養(yǎng)被影印后平板3小時，該平板稱為原平板；
(7) 將第六步菌落轉印的尼龍膜的菌落面向上，置于另一塊新的 含有氨芐青霉素100pg/mL的LB固體平板上，37。C倒置培養(yǎng)4一5小 時；
(8) 用細胞壁裂解液、細胞膜裂解液和平衡緩沖液分別浸泡三張 濾紙，取出后放在干凈的培養(yǎng)皿內，用玻棒趕去多余液體以防止尼龍 膜所附菌落被沖散，將第七步尼龍膜菌落面向上按順序置于三張濾紙
上30min;其中，1升細胞壁裂解液含25 mmol Tris-HCl (pH8.0)、 lg 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升細胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡緩 沖液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 將第八步尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板上，70。C放置3小 時；其中，篩選平板制備將瓊脂粉20g、羧甲基纖維素鈉5g和 0.1mol/L咪唑-鄰苯二甲酸氫甲緩沖液1 L混勻，高壓滅菌，冷卻后倒 平板；
(10) 揭去第九步篩選平板上尼龍膜，在篩選平板上倒上0.1%的 剛果紅，顯色15min，棄去剛果紅，倒上lmol/LNaCl脫色15min， 確定產(chǎn)透明圈的菌落，挑取相應菌株，即為極耐熱葡聚酶重組菌的候 選。
本發(fā)明的篩選方法簡單，省時省事，篩選效率高，篩選效果好。


圖l.本發(fā)明方法在固相平板得到清晰的透明圈。 圖2.當平板上菌落密度不當時造成透明圈不清晰的情況 具體實施例方式
下面結合具體的實施例，進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這 些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范 圍。
實例1:依以下步驟進行極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平板篩選方
法
(1) 將直徑9 cm的尼龍膜夾在兩層濾紙中間進行常規(guī)121'C滅 菌，15 min;
(2) 極耐熱葡聚糖酶重組菌為丑co//JM109BL21 (DE3) pET-20b —Cell2B，用接種環(huán)挑取一環(huán)重組菌在5mL的LB液體培養(yǎng)基中振 搖培養(yǎng)6小時；其中，LB液體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化鈉10.0g，調節(jié)pH至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高 壓滅菌，冷卻至55"加入氨芐青霉素100mg;其中，LB液體培養(yǎng) 基中氨芐青霉素終濃度為100pg/mL;
(3) 將4pl的濃度5pg/mL的IPTG均勻地涂在直徑9cm培養(yǎng)皿 的LB固體培養(yǎng)基上，37°。正放2小時；其中，LB固體培養(yǎng)基配制 胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g,調pH至 7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，冷卻至55"C加入氨芐青霉 素100mg，搖勻后倒平板；其中，LB固體培養(yǎng)基中氨芐青霉素終濃 度為100^ig/rnL;
(4) 將第二步獲得的菌液均勻地涂在第三步已涂有IPTG的LB 固體平板上，37'C培養(yǎng)15小時，使每個平板長出50個左右的菌落；
(5) 第四步培養(yǎng)好的平板4t:放置l小時；
(6) 菌落的原位膜轉印取第一步中尼龍膜置于第五步的平板上 影印菌落；37"C繼續(xù)培養(yǎng)被影印后平板3小時，該平板稱為原平板；
(7) 將第六步菌落轉印尼龍膜的菌落面向上，置于另一塊新的含 有氨芐青霉素100pg/mL的LB固體平板上，37-C倒置培養(yǎng)4小時；
(8) 用細胞壁裂解液、細胞膜裂解液和平衡緩沖液分別浸泡三張
濾紙，取出后放在干凈的培養(yǎng)皿內，用玻棒趕去多余液體以防止尼龍 膜所附菌落被沖散，將第七步尼龍膜菌落面向上按順序置于三張濾紙
上30min;其中，1升細胞壁裂解液含25mmolTris-HCl(pH8.0)、 lg 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升細胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡緩 沖液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 將第八步尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板上，7(TC放置3小 時；其中，篩選平板制備將瓊脂粉20g、羧甲基纖維素鈉5g和 0.1mol/L咪唑-鄰苯二甲酸氫甲緩沖液lL混勻，高壓滅菌，冷卻后倒 平板；
(10) 揭去第九步選平板上尼龍膜，在篩選平板上倒上0.1%的剛 果紅，顯色15min，棄去剛果紅，倒上1 mol/L NaCl脫色15 min， 確定產(chǎn)透明圈的菌落，挑取相應菌株，即為極耐熱葡聚酶重組菌的候 選。
實例2:實例1:依以下步驟進行極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平 板篩選方法
(1) 將直徑9 cm的尼龍膜夾在兩層濾紙中間進行常規(guī)121'C滅 菌,15 min;
(2) 極耐熱葡聚糖酶重組菌為￡.co//JM10犯L21 (DE3) pET-20b 一Cell2B，用接種環(huán)挑取一環(huán)重組菌在5mL的LB液體培養(yǎng)基中振 搖培養(yǎng)6小時；其中，LB液體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化鈉10.0g，調節(jié)pH至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高
壓滅菌，冷卻至55i:加入氨芐青霉素100mg;其中，LB液體培養(yǎng) 基中氨芐青霉素終濃度為lOO^ig/mL;
(3) 將4pl的濃度5pg/mL的IPTG均勻地涂在直徑9cm培養(yǎng)皿 的LB固體培養(yǎng)基上，37t:正放2.5小時；其中，LB固體培養(yǎng)基配制 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g，調pH至 7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，冷卻至55'C加入氨芐青霉 素100mg，搖勻后倒平板；其中，LB固體培養(yǎng)基中氨芐青霉素終濃 度為100|xg/mL;
(4) 將第二步獲得的菌液均勻地涂在第三步已涂有IPTG的LB 固體平板上，37'C培養(yǎng)15小時，使每個平板長出50個左右的菌落；
(5) 第四步培養(yǎng)好的平板4'C放置L5小時；
(6) 菌落的原位膜轉印取第一步中尼龍膜置于第五步的平板上 影印菌落；37'C繼續(xù)培養(yǎng)被影印后平板3小時，該平板稱為原平板；
(7) 將第六步菌落轉印尼龍膜的菌落面向上，置于另一塊新的含 有氨芐青霉素lOOpg/mL的LB固體平板上，37-C倒置培養(yǎng)4.5小時；
(8) 用細胞壁裂解液、細胞膜裂解液和平衡緩沖液分別浸泡三張 濾紙，取出后放在干凈的培養(yǎng)皿內，用玻棒趕去多余液體以防止尼龍 膜所附菌落被沖散，將第七步尼龍膜菌落面向上按順序置于三張濾紙 上30min;其中，1升細胞壁裂解液含25 mmol Tris-HCl (pH8.0)、 1 g 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升細胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡緩 沖液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 將第八步尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板上，7(TC放置3小 時；其中，篩選平板制備將瓊脂粉20g、羧甲基纖維素鈉5g和 0.1mol/L咪唑-鄰苯二甲酸氫甲緩沖液lL混勻，高壓滅菌，冷卻后倒 平板；
(10) 揭去第九步選平板上尼龍膜，在篩選平板上倒上0.1%的剛 果紅，顯色15min，棄去剛果紅，倒上1 mol/L NaCl脫色15 min， 確定產(chǎn)透明圈的菌落，挑取相應菌株，即為極耐熱葡聚酶重組菌的候 選。
實例3:實例1:依以下步驟進行極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平 板篩選方法
(1) 將直徑9 cm的尼龍膜夾在兩層濾紙中間進行常規(guī)12rC滅 菌,15 min;
(2) 極耐熱葡聚糖酶重組菌為五.co//JM109BL21 (DE3) pET-20b 一Cell2B，用接種環(huán)挑取一環(huán)重組菌在5mL的LB液體培養(yǎng)基中振 搖培養(yǎng)6小時；其中，LB液體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，氯化鈉10.0g，調節(jié)pH至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高 壓滅菌，冷卻至55'C加入氨芐青霉素100mg;其中，LB液體培養(yǎng) 基中氨芐青霉素終濃度為100pg/mL;
(3) 將4ji的濃度5pg/mL的IPTG均勻地涂在直徑9cm培養(yǎng)皿 的LB固體培養(yǎng)基上，37'C正放3小時；其中，LB固體培養(yǎng)基配制: 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g，調pH至 7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，冷卻至55。C加入氨芐青霉
素100mg，搖勻后倒平板；其中，LB固體培養(yǎng)基中氨芐青霉素終濃 度為lOOpg/mL;
(4) 將第二步獲得的菌液均勻地涂在第三步已涂有IPTG的LB 固體平板上，37'C培養(yǎng)15小時，使每個平板長出50個左右的菌落；
(5) 第四步培養(yǎng)好的平板4'C放置2小時；
(6) 菌落的原位膜轉印取第一步中尼龍膜置于第五步的平板上 影印菌落；37-C繼續(xù)培養(yǎng)被影印后平板3小時，該平板稱為原平板；
(7) 將第六步菌落轉印尼龍膜的菌落面向上，置于另一塊新的含 有氨芐青霉素100pg/mL的LB固體平板上，37'C倒置培養(yǎng)5小時；
(8) 用細胞壁裂解液、細胞膜裂解液和平衡緩沖液分別浸泡三張 濾紙，取出后放在干凈的培養(yǎng)皿內，用玻棒趕去多余液體以防止尼龍 膜所附菌落被沖散，將第七步尼龍膜菌落面向上按順序置于三張濾紙 上30min;其中，1升細胞壁裂解液含25mmolTris-HCl(pH8.0)、 lg 溶菌酶和1 mmol EDTA(pH8.0);其中，1升細胞膜裂解液含 10mmolTris-HCl(pH8.0)、 O.lg (wt/vol)Triton-x-100;其中，1升平衡緩 沖液含50 mmol Tris-HCl(pH8.0);
(9) 將第八步尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板上，7(TC放置3小 時；其中，篩選平板制備將瓊脂粉20g、羧甲基纖維素鈉5g和 0.1mol/L咪唑-鄰苯二甲酸氫甲緩沖液1 L混勻，高壓滅菌，冷卻后倒 平板；
(10) 揭去第九步選平板上尼龍膜，在篩選平板上倒上0.1%的剛 果紅，顯色15min，棄去剛果紅，倒上1 mol/L NaCl脫色15 min，確定產(chǎn)透明圈的菌落，挑取相應菌株，即為極耐熱葡聚酶重組菌的候 選。
本發(fā)明方法中的IPTG用量對透明圈的影響如表1
表l IPTG加入量對菌落生長和透明圈形成的影響
處理1 處理2 標準
結果統(tǒng)計 lul 2ul3ul4ul5ul lul 2ul3ul 4ul5ul 0wl
菌落數(shù)(個) 66 59 44 39 376055 45 36 30 70
不明 不明
透明圈亮度明顯明顯明顯 明顯 明顯 顯顯 明顯 明顯 明顯 無
透明圈大小 小 中等中等 大 大 很小 很小 小 小小 無 注很小，0 mm <直徑《3 ram;小，3mm <直徑《4mm;中等，4 mm <直徑《6mra;大，直徑> 6 mm，處理1是指先涂IPTG后涂菌液，處理2是指直接加IPTG到菌液中
結果顯示菌體的生長在IPTG用量大時受到抑制，將IPTG直接 加入到菌液中不利于菌體的生長，另外，IPTG用量與透明圈的大小 正相關，先涂IPTG后涂菌液所產(chǎn)透明圈比直接加IPTG到菌液中所產(chǎn) 的透明圈大且更明顯，這可能是因為先涂的IPTG可以均勻地分布在 培養(yǎng)基中，不會因局部濃度太高而抑制細胞生長，有利于持續(xù)誘導菌 體表達。
本發(fā)明方法中的重組菌培養(yǎng)時間對篩選的影響如表2
表2細菌培養(yǎng)時間對篩選的影響
結果統(tǒng)計9h12h15h18h21h24h
菌落大小小中等中等大大大
轉印成功率(％)68951001009578
篩選平板上透明圈(《5100100907560
注小，(km <直徑《lmm;中等，lmm 〈直徑《2咖；大，直徑>2mm
由表2可以看出重組菌培養(yǎng)9小時，長出的菌落非常小，膜的
轉印成功率較低且?guī)缀踉诤Y選平板上看不到透明圈，繼續(xù)培養(yǎng)到12 —15小時，平板上菌落中等大小適于轉化，轉化成功率和篩選平板 上透明圈的比率都比較高，在15小時可以達到100% ，菌株繼續(xù)培 養(yǎng)至18—24小時，菌落裂解后產(chǎn)生的透明圈比率反而下降，這可能 是菌落較大而不易裂解或酶被降解的緣故；因此，選定15小時為較 合適的培養(yǎng)時間。
本發(fā)明的方法中的篩選平板溫度和反應時間對篩選的影響如表3 當篩選平板中的瓊脂含量為15g/L時，平板在7CTC和75"C的溫 度條件下熔化了，于是改變了瓊脂的含量，70。C時瓊脂含量為20g/L ， 75'C時瓊脂含量為25g/L，瓊脂不再熔化。
表3篩選溫度和時間對透明圈的影響
55 °C60 °C65 °C70 °C75 °C
lh很小很小小小小
2h小中中中中
3h中大大很大大
4h中中中大中
注很小，直徑《4.5mm;小，4.5mm〈直徑《6mm;中等，6mm〈直徑《7mm;
大，7mm〈直徑《8mm;很大，8mm〈直徑《9mm 結果顯示在溫度不變的情況下，在1一3小時內，透明圈的大 小隨著時間的延長而增加，但到4小時后透明圈不再增大，反而在減 ??；在時間不變的情況下，在55°C—7(TC之間，隨著溫度的升高， 透明圈也在變大，但當達到75'C時透明圈與7(TC時相比不再增大， 反而在變??；因此，篩選平板中瓊脂的含量為20g/L，篩選培養(yǎng)溫度 為7(TC時，為最佳的篩選條件。
權利要求
1.極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平板篩選方法，其特征在于篩選方法依以下步驟進行(1)將直徑9cm的尼龍膜夾在兩層濾紙中間進行常規(guī)121℃滅菌，15min；(2)極耐熱葡聚糖酶重組菌為E.coli JM109BL21(DE3)pET-20b—Cel12B，用接種環(huán)挑取一環(huán)重組菌在5mL的LB液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)6小時；其中，LB液體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10.0g，調節(jié)pH至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，冷卻至55℃加入氨芐青霉素100mg；其中，LB液體培養(yǎng)基中氨芐青霉素終濃度為100μg/mL；(3)將4μl的濃度5μg/mL的IPTG均勻地涂在直徑9cm培養(yǎng)皿的LB固體培養(yǎng)基上，37℃正放2—3小時；其中，LB固體培養(yǎng)基配制胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10.0g，瓊脂15g，調pH至7.2，用蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，冷卻至55℃加入氨芐青霉素100mg，搖勻后倒平板；其中，LB固體培養(yǎng)基中氨芐青霉素終濃度為100μg/mL；(4)將第二步獲得的菌液均勻地涂在第三步已涂有IPTG的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)15小時，使每個平板長出50個左右的菌落；(5)第四步培養(yǎng)好的平板4℃放置1—2小時；(6)菌落的原位膜轉印取第一步中尼龍膜置于第五步的平板上影印菌落；37℃繼續(xù)培養(yǎng)被影印后平板3小時，該平板稱為原平板；(7)將第六步菌落轉印的尼龍膜的菌落面向上，置于另一塊新的含有氨芐青霉素100μg/mL的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)4—5小時；(8)用細胞壁裂解液、細胞膜裂解液和平衡緩沖液分別浸泡三張濾紙，取出后放在干凈的培養(yǎng)皿內，用玻棒趕去多余液體以防止尼龍膜所附菌落被沖散，將第七步尼龍膜菌落面向上按順序置于三張濾紙上30min；其中，1升細胞壁裂解液含25mmol Tris-HCl(pH8.0)、1g溶菌酶和1mmol EDTA(pH8.0)；其中，1升細胞膜裂解液含10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1g(wt/vol)Triton-x-100；其中，1升平衡緩沖液含50mmol Tris-HCl(pH8.0)；(9)將第八步尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板上，70℃放置3小時；其中，篩選平板制備將瓊脂粉20g、羧甲基纖維素鈉5g和0.1mol/L咪唑-鄰苯二甲酸氫甲緩沖液1L混勻，高壓滅菌，冷卻后倒平板；(10)揭去第九步篩選平板上尼龍膜，在篩選平板上倒上0.1％的剛果紅，顯色15min，棄去剛果紅，倒上1mol/L NaCl脫色15min，確定產(chǎn)透明圈的菌落，挑取相應菌株，即為極耐熱葡聚酶重組菌的候選。
全文摘要
本發(fā)明公開了極耐熱葡聚糖酶重組菌固相平板篩選方法，依以下步驟進行尼龍膜121℃滅菌15min；E.coli JM109BL21(DE3)pET-20b-Cel12B在5mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時；4μl濃度5μg/mLIPTG涂在LB固體培養(yǎng)基上，37℃正放2-3小時；菌液涂LB固體平板上，37℃培養(yǎng)15小時；平板4℃放置1-2小時；尼龍膜置于平板上影印菌落；尼龍膜影響菌落面向上置于LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)4-5小時；尼龍膜置于經(jīng)細胞壁裂解液、細胞膜裂解液和平衡緩沖液浸泡上30min；尼龍膜菌落面向下鋪于篩選平板上，70℃放置3小時；在揭去尼龍膜篩選平板上0.1％的剛果紅顯色15min，1mol/L NaCl脫色15min，挑取透明圈菌株。本發(fā)明方法簡單，省時省事，篩選效率高，篩選效果好。
文檔編號C12N1/00GK101372667SQ20081015546
公開日2009年2月25日 申請日期2008年10月6日 優(yōu)先權日2008年10月6日
發(fā)明者李相前 申請人:淮陰工學院